（植物学专业论文）连续pcr扩增过程中异常现象的发生机理研究.pdf

摘要 摘要 聚合酶链式反应 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c r 技术从其发明以来 因为 其操作的简单方便和高效率而在生物学研究的各个领域得到了广泛的应用 包括序 列扩增 序列的人工突变 疾病诊断 法医学鉴定 基因的表达分析等等 从p c r 技术发明以来 如何提高反应的特异性和反应的效率一直是人们所共同关心的题 目 为此也发展了相当数量的各种方法 如热启动p c r 降落p c r 巢式p c r 以 及在反应体系中添加一些有益的附属物等 而适合不同目的的p c r 技术也得到了 充分的发展 如多重p c r 反转录p c r 定量p c r 原位p c r p c r 突变 毛细 管p c r 技术等等 并且 包括随机引物扩增多态 扩增片段长度多态性 简单重 复序列多态性 单核苷酸多态性等这些在p c r 技术基础上发展而来的各种分子标 记技术极大地方便了遗传分析和遗传图谱的构建等工作 在p c r 技术发明了2 0 年 后的今天 提高p c r 的反应性能 发展适合新领域的p c r 技术和新的分子标记技 术仍然是研究者关心的题目和努力的方向 p c r 实验中已经观察到多种异常现象 除了常见的扩增失败 没有产物 扩 增产物特异性不强 有非特异产物出现 引物多聚体产物扩增 扩增效率低等现 象以外 还包括p c r 介导的重组 跳跃 复制滑动等等 阐明这些异常现象的发 生机理和过程 避免或缓解这些异常现象在扩增过程中对目的产物扩增的影响 以 及促进和利用一些特殊的异常p c r 扩增都是p c r 技术研究所关心的话题 各种研 究工作中经常需要扩增一些长片段的序列 但是在进行长片段p c r 时经常会发现 扩增目标序列的长度是有限的 扩增效率比较低 扩增产物检测中有很强的背景弥 散等现象 同时长片段p c r 需要一些特殊的反应体系组成和反应条件 如何更加 有效地实现更长序列的p c r 扩增也是人们所关心的话题之一 常见的p c r 产物重复扩增 以上一轮扩增产物为模板进行新的p c r 扩增 扩 连续p c r 扩增过程巾异常现象的发生机理研究 增轮数少 通常仅进行一次重复扩增 同时 在重复扩增中常使用的策略是使用巢 式引物 而连续p c r 扩增实验 用相同的引物以产物为模板进行多轮次的连续重 复p c r 扩增 从未见于文献报道 我们第一次系统地进行了连续p c r 扩增实验 同时 在实验过程中我们观察到了一种新的p c r 扩增异常现象 用不同来源的 模板 病毒 细菌质粒或真核生物来源的d n a 序列 进行连续p c r 扩增不同长度 的靶序列 经过有限次数的重复扩增后 最终都会导致扩增失败 这种扩增失败都 表现为在常规琼脂糖电泳检测时特异产物条带的消失和不能泳动出点样孔之复杂 异常产物的出现 这种扩增产生的异常产物能够被稳定地重复扩增 用入和细菌质 粒序列为模板连续扩增不同长度靶序列的结果表明 连续p c r 扩增失败的时期具 有扩增靶序列长度的依赖性 越长的靶序列在连续p c r 中扩增失败的时期越早 对不同连续p c r 扩增的扩增过程观察表明扩增产物经历了一个从高效特异性 扩增到低效率特异性扩增 再到扩增产生复杂异常产物的过程 对复杂异常产物的 甲酰胺辅助变性处理和变性胶电泳 尿素变性聚丙烯酰胺胶电泳和n a o h 碱变性琼 脂糖电泳 检测表明扩增产生的复杂产物主要由连续分布的小于靶序列长度的具有 相当程度多样性的非全长链组成 连续p c r 产生的复杂产物在内部具有局部的双 链区域和大量的单链区域及外部单链分支 能够被单链特异的s 1 核酸酶消化 但 是不能被双链特异的限制性内切酶消化 用d n a s ei 或限制性内切酶处理连续扩增 早期产生特异扩增产物形成不同长度序列组成的混合物 或者直接用不同扩增反应 产生的不同长度的核酸序列组成混合物 混合物在经历变性 复性后都表现出类似连 续p c r 失败所产生的异常产物电泳行为 这些证据都表明p c r 扩增过程中形成的 非全长链成分是导致这种异常现象的关键因素 多个不同长度的非全长链复性形成 杂种分子 具有较大且不一致的分子量和复杂的分支结构 最终表现为常规琼 脂糖电泳异常的复杂产物 同时 异常产物组成非全长链成分和全长链成分是其能 够实现稳定重复扩增的基础 n 摘要 实验结果表明 对于特定长度的靶序列而言 导致复杂异常出现的根本原因是 连续p c r 扩增体系中所经历的总p c r 热循环数目 每一轮p c r 扩增所使用的循环 数目多 成功连续扩增的轮数就少 而扩增体系中的引物浓度 d n a 聚合酶用量 的多少 扩增程序中时间参数等对此影响较小 巢式p c r 和单引物 互补引物p c r 的结果表明这些处理对于缓解或延迟异常产物的出现有一定的作用 人工处理 d n a s ei 或限制性内切酶处理 完整模板双链形成的非全长链长产物 然后把非 全长链长产物以不同比例同完整模板混合模拟连续扩增后期产物 这种人工混合模 板表明连续p c r 扩增中同源的非全长链成分对p c r 扩增有严重的干扰作用 是导 致复杂异常产物出现的直接原因 已有的研究表明 p c r 介导重组 长片段p c r 难于操作有共同的产生基础一 一扩增过程中非全长链成分的产生和非全长链成分对后续扩增过程的干扰作用 这 一点和导致连续p c r 失败的原因是一致的 非全长链成分的出现是p c r 扩增过程 中不可避免的 其最初产生的可能来源有三个 模板的损伤 扩增前的模板损伤或 扩增热循环过程中的损伤 聚合酶的忠实性 以及聚合酶的进行性 根据聚合酶 的特性而调整扩增程序中延伸时间的实验表明 聚合酶的进行性不是导致连续p c r 扩增失败的最主要原因 这种非全长链成分产物从无到有且不依赖于体系中非全长 链成分的过程我们称之为非全长链成分的初级合成 而已经存在的非全长链成分干 扰后续合成形成非全长链成分的过程我们称之为非全长链成分的次级合成 非全长 链成分的初级合成和次级合成共同导致了连续扩增的失败和异常产物的形成 从已有的研究结果看 任何降低p c r 扩增过程中非全长链成分产生的措施 特别是聚合酶忠实性的提高 都能缓解异常扩增产物的出现和利于长片段p c r 操 作 1 1 1 连续p c r 扩增过程巾异常现象的发生机理研究 关键词 聚合酶链式反应 p c r 连续扩增 扩增失败 p c r 介导重组 长片段 p c r 非全长链 i v a b s t r a c t ac o m m o t i o no c c u r r e di na m p l i f i c a t i o no f c u t i v ep013consecutiver o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c i u t h em e c h a n i s ma n di m p l i c a t i o n s r u il u o b o t a n y d i r e c t e db yp r o f d a m i n gz h a n ga n dp r o f d e y u a nh o n g a b s t r a c t b e c a u s eo fi t sh i g he f f i c i e n c y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c r h a sb e e nu s e di ne a c h b r a n c ho fb i o l o g i c a ls c i e n c es i n c ei t si n v e n t i o na b o u t2 0y e a r sa g o i n c l u d i n gs e q u e n c e a m p l i f i c a t i o n a r t i f i c i a lm u t a t i o nh e r i t a b l ed i s e a s ed i a g n o s i s f o r e n s i cd e t e c t i o n g e n e e x p r e s s i o na n a l y s i s a n ds oo n h o w e v e r i ti s s t i l lc o m m o na n ds e r i o u si nh o wt o i m p r o v et h es p e c i f i c i t ya n dt oo b t a i np u r ed e s i r e ds e q u e n c eb yp c r d i f f e r e n tp c r v a r i a n t so rs p e c i a lt r e a t m e n t sw e r em o d i f i e dt oe n h a n c ei t ss p e c i f i c i t y s u c ha sh o t s t a r t t o u c h d o w n n e s tp r i m e r s a d d i t i o no fb e n e f i c i a lc h e m i c a l s a n ds oo n f o rs p e c i a la i m s m u l t i p l ep c r r e v e r s ep c r q u a n t i t a t i v ep c r i ns i t up c r a sw e l la sc a p i l l a r yp c r w e r cd e v e l o p e d a d d i t i o n a l l y m a n yk i n d so fg e n o t y p i n ga n dm o l e c u l a rm a r k i n g t e c h n i q u e s s u c ha sr a p d a f l p s s r i s s r s n p e t c h a v ea c c e l e r a t e dg e n e t i c a n a l y s i sa n dc o n s t r u c t i o no fg e n e t i cm a p s a f t e r 2 0y e a r s r e s e a r c h e r sa r es t i l lc o n c e r n i n g o nh o wt oi m p r o v ep c r t od e v e l o pn e wp c rv a r i a n t sa n dt oe x p l o r em o r ee x t e n s i v e a p p l i c a t i o n v a r i o u sa b n o r m a lp h e n o m e n ah a v eb e e no b s e r v e dd u r i n gp c r s of a r t h o s ei n c l u d e d f a i l u r eo fa m p l i f i c a t i o n n op r o d u c t l o ws p e c i f i c i t y p r o d u c tw a sm i x t u r eo fe x p e c t e d p r o d u c t sw i t ht h eu n e x p e c t e d l o we f f i c i e n c yo fa m p l i f i c a t i o n p r i m e r ss e l f l i g a t i o na n d s e l f a m p l i f i c a t i o n a n ds oo n a n o t h e rk i n do fa b n o r m a lp h e n o m e n ai n v o l v e s v p c r m e d i a t e dr e c o m b i n a t i o n p c rj u m p i n g r e p l i c a t i o ns l i p p a g e r e p l i c a t i o nd e l e t i o n e t c b e s i d e st h e s e d i f f i c u l t i e sw e r ei n v o l v e df o rl o n g d i s t a n c ep c r s u c ha s p r o d u c t l e n g t hr e s t r i c t i o n l o wa m p l i f i c a t i o ne f f i c i e n c y a n ds m e a ro fn o n s p e c i f i cp r o d u c ta sw e l l r e s e a r c h e r sw e r ed e d i c a t e dt oe l u c i d a t em e c h a n i s m sf o rt h e s e p h e n o m e n aa n dt o d e v e l o pt e c h n i q u e st oa v o i dt h o s er e s u l t t h eo p e r a t i o no fr e a m p l i f i c a i t o nf o rp c r p r o d u c tw a so n ew a yt oi m p r o v et h e s p e c i f i c i t ya n dt og e te n o u g hc o u n to fp r o d u c t i nt r a d i t i o n a lr e a m p l i f i c a t i o no n l vo n e r o u n do fp c ra n dn e s tp r i m e r sw e r ei n v o l v e d h o w e v e r c o n s e c u t i v ep c r t h a ti n c l u d e s m a n yr o u n d so fp c rc o n t i n u o u s l y w e r en o te x e c u t e do rr e p o r t e dt od a t e t h ep r e s e n t s t u d yp e r f o r m e das e r i e so fc o n s e c u t i v ep c r sf i r s t l y w ef o u n do n en e wk i n do f a b n o r m a lp h e n o m e n o nt h a tt h ea b o r t i o no fr e a m p l i f i c a t i o nw a si n e v i t a b l e w h i c hw a s i n d i c a t e db yav a r i e t yo fs m e a ra n dc o m p l i c a t e dp r o d u c ta ss h o w ni n r e g u l a ra g r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s t h ea b o r t i n gs t a g e sv a r i e d h o w e v e r a c c o r d i n gt ot h el e n g t h so ft a r g e t s l o n g e rt a r g e t sr e a c h e dt h ea b o r t i o ne a r l i e rt h a nt h es h o r t e ro n e s m a r k e db ya p p e a r a n c e o fac o m p l e xo fm o l e c u l e st h a tw e r ei m m o b i l ei n e l e c t r o p h o r e s i s t h r e ek i n d so f t e m p l a t e s c y c a sr e v o l u t eg e n o m ed n a ec o l ip l a s m i d a n db a c t e r i o p h a g e 入 g e n o m i cd n a w e r eu s e di nc o n s e c u t i v ep c r st oa m p l i f yv a r i o u sk i n d so ft a r g e t sa n d s i m i l a rr e s u l t sw e r eo b t a i n e d t h ea b o r t i o no fc o n s e c u t i v ep c r sf o l l o w e ds i m i l a rp r o c e s sd u r i n gm u l t i p l er o u n d so f a m p l i f i c a t i o n a sa tt h ee a r l i e rr o u n de x h i b i t i n gv e r yh i g hs p e c i f i c i t ya n de f f i c i e n c y t h e n b e c o m i n gl o ws p e c i f i c i t ya n de f f i c i e n c y a n df i n a l l yp r o d u c i n go n l ya b n o r m a la n d c o m p l i c a t e dp r o d u c t s a d d i t i o no ff o r m a m i d et ot h e c o m p l e xb e f o r er u n n i n g e l e c t r o p h o r e s i sb yd e n a t u r e dg e l s e i t h e ru r e ap a g eo ra l k a l ia g r o s eg e l r e v e a l e dt h a t t h ec o m p l e xw a sm a i n l ym a d eu po fs h o r t e ro r p a r t i a l l ys y n t h e s i z e ds t r a n d s t o g e t h e r w i t hf e w e ra m o u n t so ff u l l l e n g t ho n e s a b l et ob ed i g e s t e db ys 1n u c l e a s eb u tu n a b l eb y r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e r e s t h ea b n o r m a lp r o d u c t sp r o v e dt oc o n s i s to fb o t hs i n g l e r e g i o n sa n dd o u b l e h e l i xr e g i o n st h a tk e p tt h ec o m p l e xs t a b l e t h e r m o d y n a m i c a l l y v i s i m u l a t i o n sg a v ee v i d e n c et h a tp a r t i a ls t r a n d s e v e na t l o w e rc o n c e n t r a t l o n d l s t u r b e a r e a m d l i f i c a t i o ne f f e c t i v e l y l e dt oa b o r t i n go ft h ea m p l i f i c a t i o nf i n a u y av a t i e t y o f d i f f e r e n tl e n g t hs t f a n d sw o u l df o r m h y b r i dm o l e c u l e s w i t hb r a n c h i n g s t r u c t u r emt h e p r o d u c tm i x t u r et h a t w a si m m o b i l ei ne l e c t r o p h o r e s i s d i f f e r e n te x p e r i m e n t a ld a t ai n d i c a t e ds a m er e s u l t s i tw a s t o t a lh u m b e ro fc y c l e st h a t b r o u g h tt oa b o r t i n go fc o n s e c u t i v ep c r sa n dp r o d u c i n g c o m p l i c a t e dp o d u c t ih em o e t h e n n a lc y d i n gn u m b e ri n v o l v e di no n e r o u n do fp c r t h el e s sr o u n do fp c r c o u l db e d e 怕r ms u c c e s s f u l l yd u r i n gc o n s e c u t i v ep c r s p r i m e r s c o n t e n t sa n d锄o u n to f d o l y m e r a s ei nm a s l e ro f p c r s a n dp r o g r a m so ft h e r m a lc y c l i n g h a v el i t t l ee f f e c to nt h e a b o r t i o no fc o n s e c u t i v ep c r s a n da m p l i f i c a t i o nb y n e s t p r i m e r so rs l n 出ep n m e r t o g e t h e rw i t hc o m p l e m e n t a r yp r i m e r h a v ew e a ki m p r o v e m e n t si nc o n s 咖t 1 v e 上 乙k a n i f i c i a lp a r t i a ls t r a n d s p r o d u c e db yd i g e s t i o no ff u l ls t r a n d sp r o d u c t w i t hd n a s eio r r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e s m i x e dw i t hn o n d i g e s t i o nf u l l s t a n d sp r o d u c ta st e m p l a t e sf o r c o n s e c u t i v ep c r s s h o w e ds t r o n gd i s t u r b i n ge f f e c t s o nt h ef u l l s t r a n ds y n t h e s l s a n d f i n a l l yc a u s e da b o r t i n g o fc o n s e c u t i v ep c r s p r e v i o u ss t u d i e sh a v er e v e a l e dm e c h a n i s m sf o rt h ep c r m e d i a t e dr e c o m b m a t l 叩如d d i f f i c u l t i e se n c o u n t e r e di nl o n g d i s t a n c ep c r i tw a sp a r t i a ls t a n d p r o d l u c e dd u r i n g t h e p r o c c s s e so fp c r 锄p l i f i c a t i o n w h i c h d i s t u r b e dt h es u b s e q u e n ts y n t h e s i so f f u l ls t r a n d s t h i si sc o n s i s t e n tw i t ht h ea b o r t i o no f c o n s e c u t i v ep c r si nt h ep r e s e n ts t u d y t h ep a n i a l 咖d sw e r ef o 衄c di n e v i t a b l yd u r i n gt h ea m p l i f i c a t i o no f p c r a n dt h e y0 0 u l db e p r o d u c e df r o mt h r e ea p p r o a c h 骼 t e m p l a t ed a m a g e b e f o r ea m p l i f i c a t i o n a n dd u r i n g 锄p l i f i c a t i o nb e c a u s eo fh i g ht e m p e r a t u r e t h ef i d e l i t y o fd n ap o i y m e 艘 a n dt h e p r o c e s s i v i t yo fd n ap o l y m e r a s e m o d i f i c a t i o n s t ot h ee l o n g a t i o nt i m ei np c r t h e m l a l c y c l i i l gp r o g r a mi n d i c a t e dt h a tt h ep r o c e s s i v i t yo fd n a p o l y m e r a s ew a s tt h em a m c a u s e 低p a r t i a ls t a n d s w h o s es y n t h e s i s w a si n d e p e n d e n to ft h ea l r e a d ye x i s t e dp a r t l a l s t a n d si np c rs o l u t i o n w e r en a m e d a st h ep r i m a r ys y n t h e s i s t h o s ep a r t i a ls t a n d s w n 坨n w e r es y n t h e s c d 锄da c c u m u l a t e db e c a u s eo fe x i t e dp a r t i a ls t a n d s w e r cn a m e d 弱u l e v l i 连续p c r 扩增过程中异常现象的发生机理研究 s e c o n d a r ys y n t h e s i s a n dw e r ec o n f i r m e dt ob et h em a i nc a u s el e a d i n gt oa b o r t i n g e l u c i d a t i o no fm e c h a n i s m sf o ra b n o r m a lp c r sw o u l df a c i l i t a t ei t sa v o i d a n c eo ri t s u t i l i z a t i o n o nt h eb a s i so fo u re x p e r i m e n t sa n dp r e v i o u ss t u d i e s w ec o n c l u d e dt h a t t r e a t m e n t so fr e d u c i n gt h ep a r t i a ls t r a n d ss y n t h e s i sd u r i n gp c r s c o u l dd e p r e s st h e p c r m e d i a t e dr e c o m b i n a t i o na n dd e l a yt h ea b o r t i o no fc o n s e c u t i v ep c r s a n d t h e r e f o r e f a c i l i t a t et h el o n g d i s t a n c ep c r k e yw o r d s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c r c o n s e c u t i v ea m p l i f i c a t i o n a b o r t i o no f a m p l i f i c a t i o n p c rm e d i a t e dr e c o m b i n a t i o n l o n gd i s t a n c ep c r p a r t i a l s t r a n d s v i n 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院植物研究所有关保留 使用学位论文的规 定 即 植物研究所有权保留送交论文的复印件 允许论文被查阅和借 阅 学校可以提供目录检索以及公布论文的全部或部分内容 可以采用 影印 缩印或其他复制手段保存论文 学位论文作者签名 年月日 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师指导下 进行研 究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本学位论文的研 究成果不包含任何他人创作的 已公开发表或者没有公开发表的作品的 内容 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体 均已在 文中以明确方式标明 本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担 学位论文作者签名 年月日 第1 章核酸扩增技术的发展和虑用 第1 章核酸扩增技术的发展和应用 遗传学是现代生物学研究的基础之一 一切生物现象和表型都是遗传和环境相 互作用的结果 表型 遗传和环境三者之间的关系可以表示为 表型 遗传 环境 解释任何生物现象和调节控制任何生物过程都必须对其遗传基础和分子机理有深 入的了解 遗传学以孟德尔定律在1 9 0 0 年的重新发现为诞生标志 在确定遗传的 化学基础 遗传物质为核酸分子 之前 遗传学主要是以表型特征 形态学 解剖 学特征等 为标记 研究遗传现象及其规律 以1 9 5 3 年w a t s o n c r i c k 在n a t u r e 杂志上发表d n a 的双螺旋结构为标志 w a g o na n dc r i c k1 9 5 3 a 1 9 5 3 b 遗传学进 入了分子遗传学时代 对各种遗传现象所蕴涵的遗传机理的研究进入蓬勃发展的时 期 而所有相关的生物学科也相应的在此基础上踏入分子生物学时代 分子生物学时代的生物学研究离不开对遗传物质 核酸分子 的操作 包 括检测 人为改变 转化等等 而这一切操作的基础是获得足够量的核酸分子 因 为生物细胞所含有核酸量的微小 在有效的核酸扩增方法出现以前各种操作都受到 能够获得的核酸的量的限制 通过一些生物方法可以对核酸实现一定程度的扩增 从而获得相当量的核酸 如通过大量样品的直接提取 或者是通过细菌 病毒等原 核生物克隆 繁殖 然后再提取 这些方法通常受到很多限制 如样品量的稀少 操作烦琐费时或实验花费昂贵等 为了更加方便地获得大量核酸分子或者直接对微 量的核酸分子进行操作 相当多的核酸体外扩增方法被创造出来 一些常用的核酸 体外扩增技术见表1 1 在所有的扩增技术中 p c r 技术是最简单 最容易操作 最经济 花费时间最少的技术 也是实验操作中最常用的技术 连续p c r 扩增过程中异常现象的发生机理研究 鼻暑 皇 置 一i 量曩日 量 皇e 皇曼曼曼墨鼍 量 鼍罾皇曼皇蟹詈曼舅量 墨 量 表1 1 常用的核酸扩增技术 垦垒 皇 坠坠垡g 竺呈兰丛旦丛塑垒坠塑巳 i 鱼曼塾i 塑 名称缩写常见用途 代表参考文献 至竺 塑垒翌皇垒垒 o 垦垒巳巳 i 望 i 垒旦兰 堡璺 曼 曼翌堡苎 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c r 核酸复制 检测m u l l i s1 9 8 7 s a i k ie ta 1 1 9 8 5 t r a n s c r i p t b a s e da m p l i c a t i o ns y s t e m t a s 核酸复制 检测c o o k2 0 0 3 s e l f s u s t a i n e ds e q u e n c er e p l i c a t i o n 3sr deiman e ta 1 2 0 0 2 o rn u c l e i ca c i ds e q u e n c e b a s e d o rr o m a n oc ta 1 1 9 9 6 a m p l i f i c a t i o n n a s b a s t r a n dd i s p l a c e m e n ta m p l i f i c a t i o n 核酸复制 检测d e t t e re ta 1 2 0 0 2 e h s e se ta 1 2 0 0 5 w a l k e rc ta 1 1 9 9 2 w a l t e ra n ds t m n k 1 9 9 4 s d a z w a d y ke ta 1 1 9 9 4 b e g g se ta 1 1 9 9 6 c y c l i n gp r o b er e a c t i o n c p r靶序列检测m o d r u s a ne ta 1 1 9 9 8 1 1p c r 技术的发展 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 技术的发明既是k a r yb m u l l i s 个人创造性的 贡献 m u l l i s1 9 8 7 也是前人一系列研究和客观需求的结果 1 9 5 5 年a r t h u rk o m b e r g 及其合作者发现了d n a 聚合酶 d n ap o l y m e r a s e 之后的 系列核酸生物化学方 面的工作表明d n a 聚合酶在体内执行d n a 的复制和修复等功能 b e s s m a ne ta 1 1 9 5 8 k o m b e r ge ta 1 1 9 6 4 l e h m a n2 0 0 3 l e h m a ne ta 1 1 9 5 8 s c h a c h m a ne ta 1 1 9 6 0 而h g o b i e dk h o r a n a 2 乏其合作者发现在有核酸单链和合适寡核苷酸引物存在的情况 下 d n a 聚合酶能够在体外催化溶液中的单核苷三磷酸聚合成多聚物 d n a 链 2 第1 章核酸扩增技术的发展和应用 g e f l e rc ta 1 1 9 7 2 k h o r a n a1 9 7 4 t e r a oc ta 1 1 9 7 2 到2 0 世纪8 0 年代 对微量核酸 的检测和分析已经成为了一种迫切需要 而需要解决核酸量稀少的问题就成为了研 究工作前进中必须突破的一个瓶颈 其重要性引起了许多研究者的注意 可以这样 说 即使不是m u l l i s 在1 9 8 3 1 9 8 4 年发明了p c r 方法 p c r 技术也会由其他的人在后 面的某一个时间发明它 1 9 8 5 年 在c e t u s 公司正式向专利局提出专利申请以后 公司的研究人员公开发 表了p c r 技术在人类镰刀型贫血症诊断中的应用 s a i l ie ta 1 1 9 8 5 m u l l i s 最初使 用的d n a 聚合酶是大肠杆菌d n a 聚合酶i 的k l e n o w 片段 其缺点是 1 k l e n o w 酶不耐高温 9 0 会变性失活 每次循环都要重新加 2 引物链延伸反应在3 7 下进行 容易发生模板和引物之间的碱基错配 其p c r 产物特异性较差 合成的d n a 片段不均一 p c r 技术公开发表以后 以它为基础的一系列研究工作立即展开来 包括遗传疾病诊断 基因克隆和序列分析等方面 而对p c r 技术本身的研究和改善 也在不断地进行 由于k l e n o w 酶不耐热 在d n a 模板进行热变性时 会导致此酶钝 化 每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期 最初的p c r 实验操作就显得相当烦 琐而且结果不稳定 1 9 8 8 年初 k e o h a v o n g 改用t 4d n a 聚合酶进行p c r 其扩增的 d n a 片段很均一 真实性也较高 只有所期望的一种d n a 片段 但每进行一次扩增 循环仍需加入新的酶 k e o h a v o n ge ta 1 1 9 8 8 p c r 技术发展的一个重要里程碑是 热稳定d n a 聚合酶 t a qd n a 聚合酶的应用 1 9 8 8 年s a i k i 等从温泉中分离的一株 水生嗜热杆菌 t h e r m u sa q u a t i c u s 中提取到一种耐热d n a 聚合酶 为与大肠杆菌多 聚酶ik l e n o w 片段区别 将此酶命名为t a qd n a 多聚酶 t a qd n ap o l y m e r a s e 此聚 合酶具有以下特点 1 耐高温 在7 0 下反应2 h 后其残留活性大于原来的9 0 在9 3 下反应2 h 后其残留活性是原来的6 0 在9 5 下反应2 h 后其残留活性是原来 的4 0 2 在热变性时不会被钝化 不必在每次扩增反应后再加新酶 3 因为 在高温度条件下扩增而大大提高了扩增产物的特异性和扩增效率 增加了扩增长度 3 连续p c r 扩增过程中异常现象的发生机理研究 2 0 硒 由于提高了扩增的特异性和效率 因而其灵敏性也大大提高 s a i k ie ta 1 1 9 8 8 热稳定d n a 聚合酶的应用略去了p c r 过程中每一次热循环都必须添加聚合 酶的步骤 极大地提高了扩增的效率 方便了实验者的操作 同时也提高了扩增的 效率和稳定性 za q u a t i c u s 的聚合酶基因很快被克隆并实现t t a qd n a 多聚酶大规 模的商品化生产 l a w y e r e ta 1 1 9 8 9 而各种经过基因工程改造得到的适合于各种 需要的t a q 酶也不断出现 至此以后 p c r 技术得到了更加广泛的应用 同时它本身 也得到了更加广泛而深入的发展 p c r 技术的发展体现在实现热循环的各种仪器的 出现和自动化 其性能和效率的不断提高以及适应不同目的p c r 的仪器的出现 性 能不断提高的反应容器 薄壁管的出现 适应不同需求的相应试剂和各种来源及 特性的聚合酶的开发 各种特殊的p c r 方法的不断发展等等 图1 1 每年被p u b m e d 数据库收录的涉及p c r 技术的文章数目 f i g u r e1 1n u m b e ro fr e s e a r c ha r t i c l e si n v o l v e dp c rt e c h n o l o g yi np u b m e dd a t a b a s ee v e r yy e a r 4 第1 章核酸扩增技术的发展和应用 图1 2 每年被p u b m e d 数据库收录的涉及p c r 技术文章的比例 f i g u r e1 2p r o p o r t i o no fp a p e ri n v o l v e dp c rt e c h n o l o g yi np u b m e dd a t a b a s es i c n e1 9 8 5 以 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n o rp c r 为检索词在p u b m e d 数据库中检索 从检 索到的每年的文章数量 图1 1 和相应的文章占当年文章的比例 图1 2 中我们 可以看到p c r 技术在现代生物学研究中的重要地位 p c r 技术的重要性不但表现 为各种p c r 技术变体或衍生形式在生物学各领域内的广泛应用 还表现在以p c r 技术为基础的各种分子标记技术的深入发展和广泛应用 5 连续p c r 扩增过程中异常现象的发生机理研究 1 2p c r 技术的应用 p c r 技术从发明以来迅速在任何一门生物科学分支内都得到了广泛的应用 包 括医学 动物学 植物学 微生物学和病毒科学等 其应用领域包括物种 微生物 检测 法医学检测 疾病诊断 种质资源评价 生物多样性分析 遗传组成检测 遗传图谱构建 基因序列克隆 基因表达检测 核酸序列测定 核酸序列体外突变 物种进化关系探讨 甚至是考古工作等方面 一些常见的p c r 应用技术见表1 2 在p c r 技术发明了2 0 年以后 虽然它已经有了极为广泛的应