（环境科学专业论文）一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及代谢产物的研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t w i t ht h eg r o w t ho fw o r l dp o p u l a t i o na n di m p r o v e m e n to fs o c i a le c o n o m i cl e v e l ，t h e r ea r e m a n yp r o b l e m s ，s u c ha st h ee n e r g yc r i s i sa n de n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o na n ds oo n ，s e r i o u s l y p e r p l e x i n gt h ew h o l ew o r l d t h e r e f o r e ，i tb e c o m e sm o r ea n dm o r ei m p o r t a n tt od e v e l o pn e w e n e r g i e s c o r ns t r a wb e l o n g st oc r o pr e s i d u e s ，w h i c hh a sh i g h - e n r i c h e dc e l l u l o s e ，s op e o p l ea re p a y i n gm o r ea t t e n t i o nt ot h eh a z a r d - f r e et r e a t m e n ta n dr e c l a m a t i o no fc o r ns t r a w i ti sm o r e e f f i c i e n ta n dl e s sc o n t a m i n a t i v et ou s et h e c e l l u l o s ee n z y m ep r o d u c e db yt h em i c r o b et o h y d r o l y z et o ms t r a w i nv i e wo ft h e s ea d v a n t a g e s ，w en e e dt os e l e c ta n ds e p a r a t es o m e m i c r o o r g a n i s m sw i t hh i g hp r o d u c t i o no fc e l l u l a s ea n dl e a r nt h e i ra b i l i t i e so fd e g r a d i n g c e l l u l o s e t h e s er e s e a r c h e sw i l lp l a yas i g n i f i c a n tr o l ei nd e c r e a s i n gt h ep r e s s u r eo fa g r i c u l t u r a l w a s t et oe n v i r o n m e n ta n dt h ed e v e l o p m e n to fc e l l u l o s er e s o u r c e s t h ee x p e r i m e n t a ls a m p l e sw e r ef r o mt h es o i ls a m p l eo fl i n y a n gr o t ，c o r ns t r a wc o r r u p t i o n a n dt h er o ti nf i v e rc h a n n e li nn o r t h e a s to fc h i n a ，a m o n gw h i c hw es e l e c t e dt h em i c r o b ew i t h t h ec a p a b i l i t yo fd e g r a d i n gc e l l u l o s e a f t e rt h ef i r s tr o u n do fs e l e c t i o n ，19s t r a i n sw e r eg a i n e d w h i c hc o u l dg r o wo nc a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s es e r v i n ga st h eo n l yc a r b o ns o u r c e t h r o u g h f u r t h e rs c r e e n i n g ，w ea c q u i r e d12s t r a i n sw h i c hp r o d u c e do b v i o u st r a n s p a r e n tc i r c l e f i n a l l y , t h es t r a i n ，c 5 ，w a sc h o s e na st h et a r g e ts t r a i nt od of u r t h e rr e s e a r c hb yc o n t r a s t i n gt h ef i l t e r p a p e re n z y m ea c t i v i t i e sa n dt r a n s p a r e n tc i r c l e sa m o n gt h e s es t r a i n s t h i ss t r a i nw a si d e n t i f i e d a sp e n i c i l l i u m s pt h r o u g ht h em o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ， w h i c hb e l o n g e dt ot h ef a m i l yo fm o n i l i a c e a e ，t h eo r d e ro fh y p h o m y c e t a l e s ，t h ec l a s so f h y p h o m y c e t e s ，t h ep h y l u m o f d e u t e r o m y c o t i n a f u r t h e r m o r e ，w e c o n d u c t e ds o m e e x p e r i m e n t so f18 sr d n a i d e n t i f i c a t i o nb yt h ea n a l y z i n gm e t h o d so fm o l e c u l a rb i o l o g ya n d a n a l y z e dt h ei t ss e q u e n c eo fc 5 a n di nf i n a l ，w ed e t e r m i n e dt h a tt h es t r a i nw a sp e n i c i l f i u m d e c u m b e n s t h es t r a i nc 5c o u l dp r o d u c ee n z y m eb yf e r m e n t a t i o nc u l t u r ei nt h ei m p r o v e dc u l t u r e m e d i u m , c z a p e k sm e d i u m w h a t sm o r e ，t h i sc u l t u r ew e n to nu n d e rt h es h a k ec u l t i v a t i o na t2 8 a n d12 0r m i n , a n dt h e nt h ec e l l u l a s ea c t i v i t yo ft h i ss t r a i nw a sm e a s u r e d t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h eh i g h e s ta c t i v i t i e so ff i l t e rp a p e re n z y m e ( f p a s e ) ，e n d o g l u c a n a s e ( e g c e n ) ， e x o g l u c a n a s e ( c b h c e x ) a n d1 3 一g l u c o s i d a s e ( p g a s e ) w e r e7 0 8 5i u m l ，3 8 5 6i u m l ， 2 6 81i u m la n d1 4 8 7i u m l ，r e s p e c t i v e l y a f t e rd e t e r m i n i n gt h ee n z y m ea c t i v i t y , w ec o u l d g e tt h ef i l t e r e dp r o d u c t i o nt ot a k eap i c t u r et h r o u g he l e c t r o n i cs p e c u l u ms c a n n i n g ，a n a l y z et h e s h a p ec h a n g eo fs a m p l e sa n dd e t e r m i n et h ea b i u i t yo fd e g r a d i n gc e l l u l o s e t h ed a t ai n d i c a t e d t h a tt h es t r a i nc 5h a dg o o da b i l i t yo fp r o d u c i n ge n z y m e ，c o m p l e t ee n z y m es y s t e ma n dh i g h d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo f c o r ns t r a wc e l l u l o s e n a b s t r a c t d u r i n gt h ep r o c e s so fp r o d u c i n ge n z y m eb yf e r m e n t a t i o n ，w es t u d i e dt h em e t a b o l i t e sb y t h ed e t e r m i n a t i o no fg c - m st e c h n o l o g ya f t e rf e r m e n t a t i o ns o l u t i o nw a sf i l t e r e da n d c o n c e n t r a t e d t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h em a i nm e t a b o l i t e sw h e np e n i c f i l i u md e c u m b e n sc 5 d e g r a d e dc o r ns t r a wc e l l u l o s ew e r ei s o b u t y la c e t a t e ，e t h y lb e n z o a t e ，a m y la l c o h o l ，i s o p r o p y l a c e t a t ea n dm e t h y ll a c t a t e ，r e s p e c t i v e l y i na d d i t i o n ，c o r ns t r a ww a su s e da sc a r b o nr e s o u r c ef o r t h eg r o w t ha n dm e t a b o l i s mo fp e n i c i l l i u md e c u m b e n sc 5d u r i n gt h ed e g r a d a t i o np r o c e s st o p r o d u c ea c i d sa n de s t e r s ，a n dt h e r ew a st h et r a n s f o r m a t i o nr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ep r i m a r y a n ds e c o n d a r ym e t a b o l i t e s k e yw o r d s ：s t r a wc e l l u l o s e ；r e s o u r c e s ；i n c l i n e dl i ep e n i c i l l i u m ( d e c u m b e n sp e n i c i l l i u m ) ；18 s r d n a ；c e l l u l o s ee n z y m e ；m e t a b o l i t e s 1 i i 1 绪论 1 1 纤维素的概述 1 绪论 1 1 1 纤维素 纤维素类物质作为自然界中最为丰富的资源，一直以来就受到人们的关注和重视。 但是由于纤维素降解的工艺不成熟、成本过高、工艺控制困难等问题，限制了纤维素在 实际工程的应用。随着社会的发展，分子生物学在科学领域的推广和应用，可再生能源 的利用再次成为研究热点。纤维素作为自然界最为庞大的可再生资源，将会成为能源、 食品、化工等领域的重要原材料。 纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，约占植物干重的三分之一到三分之二( 表 1 1 ) 。大量的纤维素只有一小部分用于纺织、饲料和造纸等方面，绝大多数用作燃料或 通过微生物的自然分解回到自然界的碳循环中，不仅没有得到充分利用，同时对环境造 成了污染。 表1 1 几种原材料的纤维素、半纤维素、木质素含晟 1 1 2 纤维素的结构 纤维素是一种多糖，化学式可用c m ( h 2 0 ) n 表示。天然纤维素分子量约为6 1 0 5 2 x 1 0 6 ，约相当于3 8 0 0 - - - 1 2 0 0 0 个葡萄糖残基。在纤维素分子中是以纤维二糖作为纤维素 的重复单位( 图1 1 ，图1 2 ) 1 1 1 。纤维素分子是一条螺旋状长链，由1 0 0 - - 2 0 0 条这样的 长链通过氢键结合形成纤维束。植物纤维素结构非常复杂，基本上是由原纤维构成的微 纤维束集合而成。原纤维是由1 5 - 4 0 根由结晶部和非结晶部构成的纤维分子长链，纤维 素的结晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规则地折叠排列而成。在结晶部分中，葡萄 糖分子的羟基或在分子内部或与分子外部的氢离子相结合，无游离的羟基存在，因此纤 维素分子具有牢固的结晶结构，酶分子及水分子难以侵入到内部中。所以，纤维素的结 晶部分比非结晶部分难降解得多。半纤维素是植物纤维原料的另一主要组成成分，半纤 维素是一大类结构不同的多聚糖的统称。在大多数情况下，半纤维素分子不是由一个单 一的糖苷聚合而成，而是由2 - - 6 种不同种类的糖苷组成【2 1 。在细胞壁中，它位于许多纤 维素之间，类似一种充填在纤维素框架中的填充物料。半纤维素与纤维素不同在于它很 东北林、l k 人学硕上学化论文 容易被水解。但是，由于半纤维素和纤维素交织在一起，因此只有当纤维素也被水解时， 半纤维素才可能全部水解。木质素和半纤维素一起作为细胞间质填充在细胞壁的微细纤 维之间，起到加固木化组织的细胞壁的作用；木质素和半纤维素形成牢固的结合层，紧 紧地包裹着纤维素，阻碍酶与纤维素的接触。因此，要提高糖化的速度，必须先除去木 质素、半纤维素的结合层，使纤维素的孔隙和裂缝增大，提高纤维素与酶接触的有效比 表面积，从而提高水解速度。 c h h 母。 o 图1 1 纤维素的化学结构 n z z 图1 2 纤维素的分子结构 由于纤维素通常是以不溶性的纤维呈晶状排列形式存在的，再加上纤维素分子与其它 多糖，如半纤维素、果胶等结合在一起，而且其外又包裹上木质素，致使人们在利用纤 维素前，首先又必须把它从其与木质素和半纤维素构成的复合物中分离出来。这通常是 使用强酸或强碱处理的办法，或是通过高温高压的途径而得以实现。令人遗憾的是，这 种过程中不仅要耗费巨大的能量，导致生产成本昂贵，而且还会给周围环境造成污染， 使民众的身体健康受到严重的危害，并会给生态系统带来灾难性的后果。所以长期以来， 人们一直在努力寻找能够有效降解纤维素的新途径和新方法，特别是酶解的方法。 1 2 纤维素物质的处理 由于天然纤维质材料主要由纤维素、木质素和半纤维素组成，木质素不易被降解。 在微生物降解纤维素材质的过程中，保证酶与纤维素底物充分接触是酶解的必要条件。 纤维质材料的预处理目的主要目的有以下几个方面：除去木质素、减小结晶度、增大孔 隙体积和增大吸附纤维素酶相应位置有效的表面积。目前预处理方法主要有以下三种： 凸 、o l 绪论 物理法、化学法和生物法【3 j 。 1 2 1 物理法 物理法主要包括传统的刀切、粉碎和爆破处理。爆破处理方法是在几十个大气压下， 1 5 0 至2 4 0 饱和水蒸气中经几十秒至几分钟的瞬间处理后，立即降至常压，使纤维素空 隙增大同时爆碎成豆腐渣一样。在高温高压下的饱和水蒸气环境中，木质素中的x 丙烯 乙醚键及部分d 丙烯乙醚键裂开，木质素、半纤维素和半纤维素的结合层被破坏。经过 爆破处理的杨木经2 4 h 的纤维素酶处理可以达到9 0 以上的消化率，而未经处理的只有 1 5 4 1 。物理法处理可在很大程度上破坏纤维素的晶体结构，增加纤维素与酶的接触面积， 但这种处理方法仅能在物理方面改变纤维素质材料，具有很大的局限性。 1 2 2 化学处理法 化学处理法主要包括酸化、碱化、纯水和氨化处理。稀酸处理已经成功的用于处理 纤维质材料【5 1 。稀酸处理可以提高反应速率，并显著促进纤维素的水解速率。目前主要 有两种稀酸预处理方法：一种是高温( 温度高于1 6 0 ) 流动相方法，另外一种为低温批 次方法【6 j 。采用流动相管试反应器，对于相同的酶水解，稀酸的添加可以降低预处理的 强度。但也有报道在稀酸水解的过程中，条件不是很苛刻却获得了较好的木糖得率【7 】。 碱处理：氢氧化钠虽有较强的脱木质素和降解结晶度能力，但在脱木质素同时，半 纤维素也被分解，致使损失人多，同时还存在试剂的回收，中和，洗涤等问题，致使用 氢氧化钠药剂进行预处理的成本太高。用氢氧化钙预处理生物质材料是一个较低成本的 预处理方法，较好的氢氧化钙预处理可以在较宽的温度范围内进行，相应的处理时间也 可以从几周到几小时不等1 8 j 。 纯水处理：当水的温度为2 0 0 时p h 可达5 0 。在高压下水可以渗透到生物质材料 的内部，水解纤维素，同时将半纤维素移除，水的p k a 是受到温度影响的，水有较高的 电解常数，能产生离子溶解纤维素，并且使一半或三分之二的木质素溶解；另外，热水 可以分裂半纤维素的氢键释放酸性物质催化酯键，使用纯水的另一个优点是不需要额外 添加化学试剂p j 。 氨化处理：氨化技术是碱处理方法的新发展。处理用的氨源种类较多，主要是液氨、 尿素和氨水等。氨呈碱性，可起碱化作用破坏木质素与纤维素、半纤维素的结合状态， 同时，氨与木质纤维素中的有机物生成铵盐，可作为微生物生长的氮源，可被利用合成 氨基酸并进一步合成菌体蛋白。目前对此工艺比较重视的国家有瑞典、挪威等国。我国 对氨化技术也比较重视，主要利用硫胺和尿素进行氨处理。 1 2 3 微生物处理法 在生物进化的过程中，形成了一群能够分解和利用天然纤维素材料的生物种群，主 要集中在微生物的丝状真菌当中，其中以木霉、曲霉和青霉为代表 1 0 , 1 1 】。微生物处理纤 维素质材料的方法主要包括青贮、微贮发酵和酶解等，利用微生物处理纤维质材料的优 点是反应条件温和、不产生污染物质、易于控制，缺点是成本高、转化率低【1 2 ，”】。随着 东北林q k 人学硕上学化论文 科学技术的发展，利用微生物的降解途径替代高温、高压的化学反应，可以节约能源、 降低生产成本和提高原料的利用率，在净化环境和开发新能源等方面有重要意义。目前， 制约微生物降解纤维素的因素是反应周期长、效率低等，影响了微生物处理纤维素材料 的广泛应用，探求利用微生物降解纤维质材料具有重大的理论价值和实际意义。 1 3 纤维素酶 1 3 1 纤维素酶的概述 纤维素酶是指所有参与降解纤维素材料，最终将其转化为还原糖的各种酶的总称。它 是一类复杂的酶复合物，故而又称为纤维素酶系( c e l l u l a s es y s t e m ) 。在生命演化的过程中， 形成了一群能够分解天然纤维素的生物种群，如丝状真菌及部分细菌和真菌等。其主要 分布于草原、森林生态系统土壤的腐殖层以及众多昆虫和草食性动物的消化道中。 s e i l l i e r e 于1 9 0 6 年在蜗牛的消化液中发现了能水解天然纤维素纤维素酶。1 9 3 3 年， g r a s s m a n 等人研究了一种真菌的纤维素酶，分离出了两个组分。2 0 世纪四、五十年代学 者们进行了大量的产纤维素酶的菌种的分离和筛选研究，形成了较为完善的筛选分离和 鉴定方法。到2 0 世纪中期以后，由于生化技术和色谱技术的飞速发展，推进了纤维素酶 的分离纯化进程，推进了纤维素酶的组分及作用机制等方面的研爿1 4 1 。到目前为止，已 分离纯化出了近百种纤维素酶组，克隆了八十个纤维素酶基因，人们对纤维素酶分子的 作用机理以及酶体系的表达机制也有了比较深刻的研究。 。 纤维素酶是水解纤维素及其衍生物生成葡萄糖的一组酶的总称【1 5 1 ，是由多种水解酶 组成的复杂酶系，主要来自于真菌和细菌，现己确定纤维素酶含有以下组分： ( 1 ) 葡聚糖内切酶( e n d o - l ，4 一p - d - g l u e a n a e s ，e c 3 2 1 4 ) u 6 j ：也称c x 酶、c m c 酶， 简称e g 。它能水解溶解的纤维素衍生物，以及膨胀的和部分降解的纤维素，但不能直接 作用于结晶的纤维素。随机水解9 - 1 ，4 糖苷键，将长链纤维素分子截断，并产生大量带 有非还原末端的小分子纤维素。它的主要代谢产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖。 ( 2 ) 葡聚糖外切酶( e x o 1 ，4 d g l u n a c a s e ，e c 3 2 1 9 1 ) m 】：也称c i 酶，简称c b h 。 是纤维素酶系中的重要组分，在天然纤维素材料的降解过程中起主导作用，它能从纤维 素链的非还原性的末端切割，水解b 1 ，4 糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，生成可 溶的纤维糊精和纤维二糖，称纤维二糖水解酶。 ( 3 ) p 一葡萄糖苷酶( p 1 ，4 - g l u o c s i d a s e ，e c 3 2 1 2 1 ) 3 1 ：简称b g ，它能水解纤维二糖 和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解速度很快。 不同来源的纤维素酶分子特征和催化活性都不尽相同。细菌产生的纤维素酶量较少 ( 小于0 1 9 l ) ，主要是内切酶，大多数对结晶纤维素没有活性，多数不能分泌到细菌细胞 外，常聚集形成多酶复合体。真菌产生大量的纤维素酶，酶系全面，能分泌到菌体外， 一般不聚集成多酶复合体。内切酶分子量介于2 3 1 4 6 k d a ，外切酶为3 8 l l s k d a ，d 葡 萄糖苷酶为9 0 1 0 0 k d a ( 胞内) 和4 - 7 6 k d a ( 胞外酶) 。但纤维粘菌内切型酶分子量小至 6 3 k d a ，蚕豆腐皮镰胞的b 葡萄糖苷酶竟高达4 0 0k d a 1 9 , 2 0 】。 i 绪论 在一级结构和三维结构的研究中发现，纤维素酶分子普遍具有类似的结构，全酶分 子呈蜡蚌状，由具有独立活性的两个结构域和连结序列构成( 图1 3 ) 。由球状的催化结构 域( e a t a l y t i e d o m a i n s ，c d ) 、连接桥( 1 i n k e r ) 和纤维素结合结构域( e e l l u l o s e b i n d i n g d o m a i n s ， c b d ) 三部分组成。其中，( 1 ) a 代表纤维素结合结构域：它对酶的催化活力是非必需的， 但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用【2 l 】：( 2 ) b 代表了高度糖基化 的连接桥：纤维素酶的连接区大多富含g l y 、s e r 、t h r ，连接桥的作用可能是保持c d 和 c d b 间的距离，也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体，其存在的重要性尚 有争议；( 3 ) 球状的催化结构域：它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性，c b d 在纤维素酶中位于氨基端或梭基端，它通过一段高度糖基化的l i n k e r 与c d 相连【2 2 l 。部 分纤维素酶含有2 0 1 5 0 个氨基酸残基的重复序列重复序列可能与纤维素酶复合物中蛋 白之间的相互作用。有关纤维素酶结构域拆分的研究为内切酶和外切酶底物的特异性作 出了合理的解释：内切酶的活性位点位于一个开放的c e l t f 中，它可与纤维素链的任何部 位结合，并切断纤维素链；外切酶的活性位点位于一个长l o o p 所形成的t u n n e l 里，它只 能从纤维素链的非还原末端切下纤维二糖，在后来的有关研究也进一步证实了上述分析 【2 3 ，2 4 1 。 ： 图1 - 3 纤维素酶的分子结构 1 3 2 纤维素酶的作用机理 目前普遍认同纤维素的酶解是纤维素酶各组分协同作用的结果，但是各个组分是如何 作用的，许多学者提出了不同的看法主要包括以下几种观点： ( 1 ) c 1 c x 假说，1 9 5 0 年r e e s e 等人提出c 1 c x 假说【2 5 】： 结晶纤维素匕令无定形纤维素匕令纤维二糖 b 葡萄糖苷酶儿 图1 - 4 c 1 c x 假说流程图 葡萄糖 东j 匕林q k 人学硕上学位论文 c 1 酶首先作用于结晶纤维素，使其变成无定形纤维素，再被c x 酶进一步水解成可 溶性的纤维素和葡萄糖的p 1 ，4 寡聚物，即c l 酶的作用是c x 酶水解的先决条件，接着 p - 葡萄糖苷酶将纤维二糖和三糖水解成葡萄糖。但该学说不清楚酶c x 的作用机理，因此 提出了种种推测，如c l 酶可能作用于纤维素链间的氢键或作用于纤维素中少数的d 1 ， 4 葡萄糖苷键，或者其它一些不规则的键、薄弱键等，可是都没有分离获得c 。酶。 ( 2 ) 顺序作用假说【2 6 】：另一种观点以e n a r i 等人为代表的，认为首先是由外切型葡 聚糖酶( c b hi 和c b hi i ) 水解不溶性的纤维素，生成了可溶性的纤维糊精和纤维二糖， 然后由内切型葡聚糖酶( e g i 和e g l ) 作用于纤维糊精，生成纤维二糖，再由b o 将纤维二 糖分解成葡萄糖，如下图示： c b hi 纤维素 hl 、c b hi i 糖 图1 5 顺序假说流程图 ( 3 ) 协同作用模型，目前，普遍接受的纤维素酶降解机制是协同作用模型，如下图 所示【2 7 1 ： 0 季拄 图1 - 6 协同作用流程图 在协同降解过程中，首先由c x 酶在纤维素聚合物的内部起作用，在纤维素的非结晶 部位进行切割，产生了新的末端，然后再由c l 酶以纤维二糖为单位，从末端进行水解， 最后由b g 酶将纤维二糖水解成为葡萄糖。w o o d 在研究木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 、青霉 ( p e n i c i l l i u mf u n i c u l o s u m d e ) 的纤维素酶水解纤维素时，发现培养液中的两种外切酶在液 化微晶纤维素和棉纤维素时，具有协同作用；f a t e r s t a m 也发现两种外切酶( c b hi 和 l 绪论 c b h i i ) 具有协同作用；k a n d a 等还发现了对可溶性纤维素进攻方式不同的两种内切葡萄 糖酶在微晶纤维素的水解过程中也具有协同作用【2 趴。 1 3 3 纤维素酶的应用 纤维素酶可广泛地用于食品工业、洗涤、造纸、纺织、饲料、医药和能源工业等。 酒精的生产原材料主要是玉米、高梁等淀粉质料，这些原料中含有l 3 的纤维素， 在纤维素酶的作用下能转化为可发酵性糖，增加原料的利用率。纤维素酶还能破坏这些 原料的细胞壁结构促使淀粉的释放，有助于糖化酶的作用。另外由于纤维素酶的作用， 使糖化液、发酵液粘度降低，有利于实施发酵和酒糟的分离【2 叭。 纤维素因其储量大、产生污染少等特点，逐渐被人们重视，在能源方面的应用也逐 渐被开发。纤维素能被某些特定的微生物降解，转化成乙醇，这对于现今社会能源匮乏、 环境污染等亟待解决的问题无疑是一个很好的途径。美国的n r e l 建立了一套日处理生 物质一吨规模的中试装置，积极开发基于木质纤维素类原料燃料乙醇生产技术，并进行 综合经济分析。随着中国燃料乙醇产业的逐步发展，这一领域的技术开发和科学研究工 作也将越来越引起人们的关注。在燃料乙醇生产原料方面，与目前广泛使用的淀粉质和 糖质原料相比，资源丰富的木质纤维素类原料一直是世界各国研究开发的主要方向并已 取得了一些进展，相信在不远的将来，随着预处理、酶解等技术的突破，木质纤维素原 料应用于大规模燃料乙醇生产将不会遥远。 ； 碱性纤维素酶是理想的洗涤添加剂。采用纤维素酶处理棉织物，不仅能在纤维表层 进行可控的“刻蚀”，使织物产生不均匀的褪色，具有古朴的美观质感，并且不会对织物 内部纤维的强度产生损伤【3 们。纤维素酶的使用一方面保护了机器，避免洗涤环境中浮石 尘土的存在；另一方面，处理后的纺织物手感更细腻、均匀、柔软，没有批色差，故在 纺织工业中用于生物抛光、去除纺织基布表面纤维，防止涂层表面出现瑕疵等。 1 3 4 纤维素酶的研究进展 1 3 4 1 国外研究状况 纤维素酶的发现较早，早在1 9 0 6 年s e l l i i e c r 在蜗牛的消化液中就有发现，能分解天 然纤维素；1 9 3 3 年g a s r s m n a 等研究了一种真菌的纤维素酶系，分辨出两个组分；2 0 世 纪四五十年代，对产纤维素酶的微生物菌种进行了大量的分离和筛选工作，建立了比较 完整的分离筛选方法；2 0 世纪六十年代后，分离技术的发展推动了纤维素酶的分离纯化 工作，在纤维素酶的组分、作用方式以及诱导作用等方面，都取得了较大的研究进展， 实现了纤维素酶制剂的工业化生产，在应用上取得了很大的成绩1 3 lj 。2 0 世纪七十年代， 有些学者提出协同作用在纤维素酶对纤维素进行作用时，才表现出很强的活性，还提取 了这种协同作用的3 种酶；1 9 8 5 年，采用腐殖根霉( h u m i c o l ai n s o l e n s ) 发酵的方法，制得 了世界上第一个洗涤剂用的纤维素酶，其产品名为c e l l u a s l e ；1 9 8 7 年又推出了一种细菌 纤维素酶( b a c e t r i a lc e l l u l a s e ) ，并成功地用于a t t a e k 洗衣粉，从此纤维素酶正式作为洗涤 剂面世1 3 2 】。韩国和美国学者于1 9 9 7 年研究了里氏木霉及5 株温度突变菌株产纤维素酶的 东北林q k 人学硕上学位论文 最佳条件，指出在几种酶的协同作用下，葡萄糖的产率比单独的纤维素酶作用的总和高 出8 - 1 5 倍；1 9 9 8 年瑞典的j o s z e fm e d v e 、j o h a nk a r i s s i o n 和加拿大的d o r a l e e 等，用从 里氏木霉中提取的纤维二糖水解酶和内葡聚糖纤维素酶，对微晶纤维素的进行的水解试 验表明，4 0 时复合酶作用所产生的可溶性糖比两种酶单独作用时产糖的总和多 2 7 0 o , - - 4 5 t ”j 。目前，世界上酶制剂工业发展迅速，1 9 9 7 年丹麦的n o v on o d i s k 和美国的 g n e n e c o r 两公司销售额占全世界酶制剂销售额的7 0 以上，成为世界上最大的酶制剂生 产商和供应商。 1 3 4 2 国内研究状况 我国纤维素酶的研究始于2 0 世纪六十年代初，迄今为止，国内各大专院校科研院所 都进行了纤维素酶的筛选分离工作，已经培育出了一批高产纤维素酶的菌种。1 9 7 5 年广 东微生物研究所分离筛选出一株纤维素酶产生菌一长梗木霉；2 0 世纪九十年代中科院微 生物研究所获得一株突变株一康宁木霉c p 8 8 3 2 9 ；2 0 世纪九十年代初，在沈阳农业大学 陈祖沽教授和曹淡君教授的亲自指导下，黑龙江省海林市万力达集团公司首条年产2 0 0 0 t 纤维素酶生产线投产，使我国成为继美国、日本、丹麦之后世界上第4 个能生产纤维素 酶的国家【3 4 1 。目前，国内关于纤维素酶的特性、作用机理、培养条件、应用试验等方面 的报道文献虽然较多，但至今仍未能规模化生产，满足不了市场的需要。丹麦n o v o n o d i s k 公司的酶制剂产品，占领了我国绝大部分市场，使进口纤维素酶的价格昂贵。虽然我国 在九十年代后，建成了一些纤维素酶生产厂，但均由于菌种选育和生产技术进展不大、 酶活力较低、成本高等原因，没有形成大规模生产。而另一方面，目前国内对纤维素酶 的需求量很大，年需求总量在3 0 0 0 - - 4 0 0 0 吨，可见该产品在我国供需矛盾较大，也正是 供求矛盾的存在促使了人们对纤维素酶进行更深入地研究。 1 4 产纤维素酶真菌 1 4 1 真菌源 所有能分解晶体纤维素的真菌，均能或多或少地分泌出纤维素酶，所以纤维素酶的 真菌源非常广泛。目前研究和生产中采用的菌种大多是木霉、曲霉和青霉、根霉属和漆 斑霉属等。制成酶制剂的有绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 、黑曲霉( a s p e r g i l l i u sn i g e r ) 、 镰刀霉( f u s a r i u ms p ) 、拟青霉( p a e c i l o m y c e ss p ) 和斜卧青霉( p e n i c i l l i u md e c u m b e n s ) 等的纤维素酶【35 1 。 其中，研究的热点之一是通过对已知纤维素酶的产生菌进行诱变，提高菌种产酶的 性能。利用基因工程手段也是提高纤维素酶产量和质量的重要方法，通过克隆出真菌的 纤维素酶基因，将其与高效表达基因的启动子和染色体起始位点融合则可以表达，并且 表达量增加，同时利用基因工程手段对纤维素酶分子进行改造增加其活性，并能提高耐 受性。 i 绪沦 1 4 2 细菌源 在目前为人们研究较多的微生物中，细菌类有红黄纤维弧菌( c e l l v i b i r of u 加u s ) 、普通 纤维弧菌( c v u l g a r i s ) 、纤维单胞菌属( c e l l u l o m o n a s ) 、瘤胃球菌( r u m i n c c c u s ) 、镰状纤维菌 ( c e l l f a l c i c u l a ) 、嗜纤维菌( c y t p h a g a ) 、多囊粘细菌( p o l y a n g i u m ) 、假单胞菌( p s e u d m n a s ) 和 荧光极毛杆菌( n p “d 锄d ，l 船伽d ，嚣瑚) 等1 3 6 1 。但是，由于细菌分泌的纤维素酶量少( 低于 0 i v , m ) ，且产生的酶属胞内酶或粘附在细胞壁上，难以进行工业化生产，所以很少用细 菌作为纤维素酶的生产菌种。但近年来，一些国家利用纤维杆菌深层通气培养生产纤维 素酶，取得了较好的效果。 1 4 3 动物源 反刍动物能消化纤维类饲料主要由于其瘤胃内的微生物能分泌纤维素酶。因此，可 以利用瘤胃液获得纤维素酶的粗酶制剂。国内外已进行了这方面的研究工作，但尚未能 应用到规模化生产上。杨国字较系统地阐述了瘤胃微生态体系中，细菌、真菌、纤毛虫 及其纤维素酶系统对植物细胞壁纤维素进行的消化作用；张晓华等报道了一个厌氧中温 条件下分解纤维素的瘤胃梭菌新种。 此外，放线菌中的黑红旋丝放线菌( a c t i n o m y c e sm e l a n o c y c l u s ) 、玫瑰色放线菌 ( a c t i n o m y c e sr o s e o d i a s t a t i c u s ) 和纤维放线菌( a c t i n o m y c e sc e l l u l o s a e ) ，一些昆虫、软体动物、 原生动物都能产生纤维素酶1 3 7 , 3 8 。 。 1 5 纤维素降解过程代谢产物 玉米秸秆是储量大、可再生的自然资源，环境危害低，如能经过生物途径进行转化， 不仅能缓解能源的短缺，而且利于经济可持续发展和生态环境保护。玉米秸秆、水稻等 天然生物质材料，经固态发酵转化为乙醇，并为汽车等提供洁净的动力资源，是新世纪“绿 色农业”、“生态农业”的新产品，符合全球可持续发展战吲”】。 秸秆是一种丰富的农业废弃物，若利用微生物技术将其转化为氢气，既能降低产氢 成本，又能使废弃物得到资源化，从清洁能源开发和废物利用的角度都具有极大的社会 效益和经济效益。目前纤维素被作为废弃物处理，造成环境污染，又造成资源浪费，曹 广丽针对目前制约秸秆纤维原料生物转化产氢研究中的主要技术瓶颈，进行了戊糖发酵 产氢菌和纤维素降解产氢菌的分离筛选，并分别考察了其利用半纤维素水解液和纤维素 物质发酵产氢性能，同时结合预处理技术建立了玉米秸秆高效利用组合体系【4 们。李兴等 通过绿色木霉与产丁二酸放线杆菌实施两步发酵，实现可再生农作物秸秆进行规模化制 备丁二酸，以期摆脱对石化原料的依赖，提供农作物秸秆的新用途1 4 。传统的乙醇生产 主要以淀粉类物质发酵而成，生产成本高昂，所以研究以秸秆纤维素转化乙醇的途径， 采用秸秆作为生产乙醇的原料成为了一种趋势。 1 6 存在的问题和解决方法 纤维素是地球上最丰富的可再生能源，植物通过光合作用使光能以纤维素材质的形 东北林、l k 人孕硕上中化论文 式固定下来，每年的产量约上千亿吨，这些纤维素材质是巨大的可再生资源，然而随着 我国农村生活水平的提高，纤维素秸秆作为劣质燃料燃烧掉，或者作为废弃物被丢弃， 因此，秸秆作为传统意义的燃料、肥料和饲料被排除于农业生产的内部循环之外，逐步 演变成无用的负担物，大部分将被就地焚烧、遗弃，严重污染生态环境【4 2 1 。 目前纤维素在应用过程中大都存在着技术尚不成熟，成本高等问题，主要原因在于： ( 1 ) 纤维素分子结构稳定、复杂，很难被降解。纤维素分子通过氢键相连成整齐排 列的长链，包埋在木质素里形成坚固而稳定的结晶结构，因此，进行发酵前应该经过适 当的预处理。 ( 2 ) 目前成品纤维素酶的生产技术主要掌握在国外的大公司，因此价格高昂；而且 大多纤维素酶活性低，用量大，降解速率有待提高。 ( 3 ) 在秸秆纤维素生产乙醇的过程中，存在乙醇产量低、菌种耐受力差等问题。 由于纤维素酶催化效率较低、成本高、耐受力差在实际应用普遍存在，因此降低生 产成本，提高单位还原糖的催化率的策略有以下两种： ( 1 ) 提高纤维素酶生产的经济性，增大纤维素酶生产的规模，从而降低单位纤维素 酶的生产成本； ( 2 ) 提高纤维素酶的比活力和利用率，增大单位发酵还原糖的效率，提高纤维素酶 的经济性。 根据上述方向的理论研究，以及分子生物学研究的不断发展推进，选择具有人们期 望的特性的纤维素酶和菌株，是提高纤维素降解的基础研究，而生物学与工程学的过程 整合，为纤维素的高效降解提供了新思路。 1 7 课题研究目的和意义 随着全世界人口的增长和社会经济水平的不断提高，能源危机、环境污染等问题， 正日益严重地困扰着整个世界，因此，寻找开发新能源、节约粮食、减少环境污染的途 径显得越来越重要。同时，纤维素酶在食品、饲料、医药、纺织、造纸和能源等领域取 得了一定的进展，具有很大的开发潜力和价值，但在实际应用中仍然存在着些的问题， 主要为产纤维素酶菌株产酶率低、产酶不稳定，纤维素酶制剂催化率低，单位催化还原 糖成本高，以及纤维素酶产品生产技术未能推广等。 本论文在大量采集样品的基础上，筛选分离出高产纤维素酶的菌株，运用分子生物 学鉴定菌株的种属，测定菌株的酶活力，确定一株高效降解纤维素的真菌，研究其降解 天然纤维素材质的能力和酶活力；同时，测定降解过程中代谢产物的生成与转化，为进 一步研究纤维素菌株的产酶能力和工业化生产提供理论依据和参考。 本研究工作包括以下几个方面的内容： ( 1 ) 在东北地区采集原始样品，经初筛和复筛后获得高产纤维素酶菌株； ( 2 ) 采用生理生化、形态学鉴定及1 8 sr d n a 鉴定方法，确定菌株的种属和菌株特 性； l 绪论 ( 3 ) 通过测定菌株的酶活和发酵物的电镜图片分析，研究目标菌株对玉米秸秆纤维 素的降解效果； ( 4 ) 运用g c m s 分析降解秸秆纤维素过程中代谢产物，初步探明代谢产物的代谢 途径。 东北林业犬学倾_ 学位论文 2 产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及降解效果的研究 2 1 引言 纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，是人类最宝贵的天然可再生性资源。 全世界每年产农作物秸秆近2 0 0 0 亿t ，我国属于农业大国，每年产超过6 亿t ，大部分作为 废弃物被丢弃，不但带来了严重的环境问题，也浪费了宝贵的物质资源【4 3 】。玉米秸秆是纤 维素组分含量很高的农作物残留物，如何使玉米秸秆无害化、资源化已经成为国内外研 究的热点。利用