（食品科学专业论文）曲酸的生产菌选育及应用研究.pdf

独创性声明 本入声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果 也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意 时间 2 昭年 月夕日 时间 豺 f 年厂月于日 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有 本人完全了解沈阳农业大学有关保留 使 用学位论文的规定 即 学校有权保留送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借 阅 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的内容 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名 善 鼻 苛 时间 2 确彩年 月岁日 一 导师签名 龛钾帆刀 年f 月f 日 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 喵酸广泛应用予医药 食品 化妆品 农业等领域 随着市场应用领域的不断扩大 特别是在食品添加剂 化妆品上的应用日渐成熟 曲酸具有抗菌作用 抗氧化作用 护 色作用以及安全无毒性 使之成为一种新型食品添加剂 在食品防腐 果蔬保鲜 肉制 品与水产品的护色保鲜方面有着广阔的应用 我国目前只有几家研究单位试制曲酸 基 本无产品供应 而进口曲酸价格昂贵 使其在应用上受到影响 曲酸发酵面临着生产效 率低 生产成本高 难以工业化生产等问题 现急需选育出稳定高产的曲酸生产菌 进 一步挖掘曲酸在食品 化妆品领域的应用潜能 将米曲霉2 3 3 6 分离 纯化筛选出一株优良菌株c 2 3 3 6 可产曲酸1 2 3 4 9 l 对此 菌进行紫外诱变 印c o 诱变 采用快速筛选法筛选出稳定高产菌株u c 6 9 发酵7 d 可 产曲酸4 0 4 7 9 l 是原来产量的3 3 倍 分别研究碳源 氮源 无机盐对曲酸产量的影 响 并采用响应面分析方法确定其最佳发酵培养基 玉米淀粉1 4 豆饼粉o 5 0 2 p 0 4 0 4 0 m g s 0 4 0 1 0 p h 6 0 经7 d 发酵曲酸产量达到4 5 2 0 9 l 比优化前提 高了1 2 再用正交交互实验优化摇瓶发酵条件 确定摇瓶发酵最佳条件 装液量 2 咖 也5 0 m l 接种量8 温度3 0 转速2 0 晰n 抽 这时经7 d 发酵可产曲酸5 5 5 0 以 产量又提高了2 3 采用管碟法比较曲酸对4 种细菌 2 种酵母 4 种霉菌的抑制作用 结果表明o 3 0 的曲酸对细菌有较好的抑制作用 尤其是对革兰氏阴性细菌的抑制效果更显著 并且其 抑菌效果强于苯钾酸钠 另外其热稳定性良好 更适合用于食品加工中 曲酸对酪氨酸 酶活性的抑制研究表明o 0 4 的曲酸溶液就能很好的抑制酪氨酸酶 因此曲酸在食品加 工中可作护色剂 在化妆品中可作增白剂 关键词 曲酸 诱变 响应面 优化 应用 摘要 a b s t r a c t k o j i ca c i di se x t s i v c l ya p p l i c dt os u c hf i e l d s 嬲m e d i c i n e f o o d c o s m e t i c s a 妒c l l l t l l r e e t c w l c l lt h ec o n g t 眦t l 越g 伽 n to ft h cm a 呔吒印p l i 删o no fk q i ca c i d e 单e c i a l l yi nf o o d a d d i t i v em l dc o s m e t i c si sr i p e 掣删l y k o j i ca c i dh 勰觚t i b i o t i c l n c t i o 轧m s i s t a n c et o o i d a t i o n c o l o r p f o t e c t i o n 缸州 髓di s c u 慨w l l i c hm a k 髂i tan e w t y p ef o o da d d i t i v e i t h a 谢d e 印p l i c a t i o ni nf b h d da 娟s e p t i c 舨l i 乜a n dv e g e 诅b l e sf 瞻s h k e 印i n g c o l o r p m t e c t i l l g a i l d 矗 e s h k e 叩i n go fm e a t 趾d 龇删描cp r o c i u c t s s e r e m lm a 油i n s t i 删o i l si no mc o u n 仃y a 订 i n gp r o d u c i n g 蚓i c i d a n dn op r o m l c ti sp r o v i d e di nm a r k e ty e t t h eh i g hi m p o r t 面c em a k e s 也e 印p l i c a t i o nd i 伍础 k o j i ca c i d 向m 州幻i i o ni sf i c e d i t l lm 锄yp r o b l 锄s 锄c ha sl o wp r o d u 曲v i t y l l i g hc o s t 鼬dm 如蹦a lp r o d u c t i o ni nl a r g es c a l e ni si i l 伊e a tn e e d t o 踞l 吐啦a d ys t r a i n 也a tp r o d l l c eh i 曲k o j i ca c i df o r 咒s e h 也ea p 嘲i a b t i l a t e n t e r g y 证 t 1 1 ef i e l d so f f o o 正c o s m e 缸s af m eg h 础1 c 2 3 3 6w 猫s c r n e d 觚n 爿职枷d 9 譬口p 2 3 3 6 砸l i c hc a np r o d u c ek o j i c i d l 2 3 4 9 lb yi s o l a t i o na n d 州f i c a 畦o n ah i g l l 聊e l dk o j i ca c i dp r o d u c i i l g 肌l t a t i o nu c 6 9 w a so b t a i n e d 舶ms t a i n c 2 3 3 6b y 璐i n gu va n d c or a ym m a t i o nt e c l l i l i q u c 蛆dq u i c k s c r e l l i n gm 酬吣d 砌c hc 孤p r o d u c ek 0 j i ca c i d4 0 4 7 9 la f t 盯 v d a y sf 岫e n t a l i 3 3 t i m e so f 也ei n j d a lo u t p l i h l 日u e n o f c 盯b o ns o u r c e n i 仃o g e l ls o u r c e 柚dm i n e m ls a l t so n 也e y e i l do fk o j i ca c i dw 器s n l m e ds 印a m t e l y 锄dn 玳岫g l lr t 络p o n s es u r 缸ea n a l y s i sm e 廿湖 m e o p t 咖 m c d i 啪w 勰d 咖m 砌雒f o l l o 粥 m a i z es 觚h 1 4 b e 她 c a l e p o w d c r 0 5 0 k h 2 p 0 4 0 4 0 m g s 0 4 0 1 0 p h 6 0 l do fk o j i ca c i dw 勰4 5 2 0 9 la 脑 s e v e nd a y sf e 瑚e m a t i o n 埘此hi r n p r 0 v e db y1 2 t l i 龃b e f o r e s 蛐gn a s kf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw e r co p t i m i 髓db y 璐i i l gt l l eo r n l o g o n a lt e s t a n dt l l eo p t i i i 岫c o 删o n a s i d e n t 砺e d 船f o l l o w s 2 5 0 m ls h a k ef i l l e d 谢t h2 0 m lm e d i 啪 也ev o l u m eo fi n o c u l a t i o na b o m 8 t e m p e r 砷u r e3 0 糟v o l u t i o n2 0 0 r m i n t h ey i e l do f k o j i c i dw 嬲5 5 5 0 9 l 廿l a ti i i l p m v e d b y2 3 a f e rs e 啪d a y s 向m e n t a t i o n t h ei 1 1 h i b i t i o nd 艳c to fk o j i c i do nf o l l rl i n d so fb a c t e r i a t w ok i i l d so fy e a s c s 锄df o l l r 虹n d so f 萄w 嬲s t l l m e db ym 眦so fa g a 卜m 疗b i o nm e l o d e x p e r i m e t 陀s m t ss h o w e dm 砒 o 3 0 k o j i ca c i dh i dg o o di n k b i t i n gn m c 廿o no nk i c t e r i a e s p e c i a l l yo n 毋狮 n e g c t i v e b a c t e r i a 甜l dt h ei n b m m o ne 饪b c tw 嬲蜘g e rm a ns o d i 砌b e m o a t e i a d d m o n k o j i c i dh a d g o o ds t 抽l e i l i t ya f t e ra1 1 1 e m l a l 仃瑚加 n tt l l a tw 站s u i l a b l e l et o dp r o c e s s n 坨i n h i b i t i o n e 疵c to fk o j i ca c i do np o t a t op o l y p h e n o lo x i d a a 曲畸i n d i c a t e dt h a to 0 4 k o j i c 犯i d c 砌di n l l i b i tp p oa c t i 啊t w d l n ek 西i c 蒯dc a nb eu s e d 船c 0 o r p 帕t 蒯n g 抽鳓d p m c e s s i i l ga n d 1 7 1 i l i t e l l i n ga g e n ti nl l l ec o 锄e t i c s k e yw o r d s k o j i ca c i d m u t a 6 0 n r 瞄p o s es u m c em o t h o d o p 缅咀i z 童t i o n a p p l i c a t i o n 2 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 曲酸概况 曲酸是一种带取代基r 吡喃酮 是由微生物好氧发酵产生的具有抑菌作用的有机酸 陈移亮等 1 9 9 8 1 9 0 7 年s a i l o 在蒸米饭中培养米曲霉时 从菌体粉末中分离出一 种他无法确认的有机酸 当时他猜测是一种阻间羟苯基羧酸 m a y 0 ee ta l 1 9 1 1 9 1 2 年 y a b u t a 经过分析认为其经验分子式为c 1 2 h 1 4 魄 并取名为曲酸 k o j i c i d l o 年 后 y a h l t a 依据当时最新的化学分析和分子量检测手段把曲酸的分子式修正为 c 6 1 6 0 4 b 汕血她wjh e ta 1 1 9 3 1 并在1 9 2 4 年令人信服地证明了其结构式 y a b i l t a t 1 9 2 4 1 1 l 曲酸的性质 l1 1 1 曲酸的理化性质 1 学名 5 一羟基 2 羟甲基一1 4 吡喃酮 2 英文名 k o j i ca c i d 2 h y 出o x y m 亡l h y 一5 一h y c h o x y 卜p y r 0 3 分子式 c 6 峨仉 4 结构式 5 分子量 1 4 2 1 1 6 性状 曲酸结晶为棱柱形 针状 无色 曲酸易溶于丙酮 乙酸乙酯 水中溶解度2 8 8 9 2 0 在乙醇中溶解度稍小于水 稍溶于乙醚 氯仿 吡啶 难溶于大部分其他溶 剂 陈陶生等 1 9 8 7 可以通过在丙酮 醋酸乙酯溶剂中结晶纯化 也可在1 5 0 2 0 0 减压升华 熔点1 5 3 1 5 4 1 1 i 2 曲酸的生理活性 曲酸与f e 3 反应形成红色络合物 在2 1 7 力m 2 2 6 n m 2 6 5 n l i l 2 8 7 m 3 1 5 咖 5 0 0 n m 处有吸收峰 含有o 1 1 酽的f e 与曲酸反应即显深红色 这 性质可用于测定f 和 曲酸 在制备曲酸时应注意凡 否则得不到浅色的曲酸晶体 曲酸的酸性是由酚羟基 结构而来 曲酸还可以还原费林试剂 其分子结构中羰基附近存在一个醇羟基能与各种 结构而来 曲酸还可以还原费林试剂 其分子结构中羰基附近存在一个醇羟基能与各种 第一章前言 金属生成盐 其他羟基可以生成醚 酯类衍生物 曲酸及其衍生物具有抑菌作用并对酪 氨酸酶 多酚氧化酶 有强烈抑制作用 1 1 1 3 曲酸的生物活性 曲酸具有一定的抗菌活性 革兰氏阴性细菌对曲酸的敏感程度大于革兰氏阳性菌 稀释l o o 倍时能杀死人的自血球 稀释5 0 0 倍时能完全抑制产气气杆菌 4 e 阳6 船阳g e 卿 粪产碱菌 4 如姆脚如 凰 炭疽杆菌 胁埘h 彻珈w 括 巨大芽孢杆菌 丑矾曙砌洲姗 肠膜芽孢杆菌 丑柳溯栅话淞 覃状芽孢杆菌 僻册仞娩 印度色杆菌 o 煳小d 6 础 m m 触加搬 腐败梭茵 c z p 姗狮埘肼 肺炎 球菌属中2 3 5 3 2 1 4 型菌等 稀释1 0 0 0 倍时抑制肉毒梭菌 c 觚l r 触蜊6 d 哪加 m i 型肺炎球菌 亚逸推克沙门氏菌 韶仞税f 等 稀释2 0 0 0 倍时抑制马尔他布氏菌 册 卯砌脚e 髓眙瑚豇 儡 粘膜炎奈瑟氏球菌 肫栅e r 蛔c 口以r m 口池 雏沙门氏苗 p 钻砌 口m 据淞 等 戎志梅 2 0 0 4 曲酸对酵母 霉菌 病毒 噬菌体无效 1 1 1 4 曲酸的毒理学 实践证明曲酸对人体是安全无毒的 s h 沏舯t 1 9 8 2 利用细菌勋砌鲫p 口进行 a m e s 试验 利用中国仓鼠培养细胞进行致突变试验 利用大白鼠进行急性致死试验 都证明曲酸是安全无毒的 虽然曲酸对细菌鼬砌鲫e 妇 原核生物 有微弱的致突变 作用 但对真核生物 真菌 植物 动物 不论是体内试验还是体外培养细胞试验 都证明曲酸没有致突变作用 a b d a l l a a d 等用酶标免疫测定法 e l i s a 证实 5 6 m 眺g 体重的剂量静脉注入兔子体内的曲酸 大部分由尿中排出 蒋晶等 1 9 9 8 1 1 2 曲酸的生产 1 1 2 1 生产曲酸的菌种 能生产曲酸的微生物有米曲霉 一哪穆 fd 僻讲 黄曲霉 a 伽w 疏展曲霉 一 功协淞 构巢曲霉 a 撑触妇珊 寄生曲霉 爿胛l 括淞 溜曲霉 彳 船脚筇 鱼坚曲霉 d m 糟d 阳 出e 泡盛曲霉 a 口w 蜊d i 白曲霉 a c a 埘耗船 棒曲霉 彳 砌w l 撂 烟曲霉 彳乒册 卿淞 巨大曲霉 撕把淞 白色曲霉 彳 扔淞 灰绿曲霉 一 g 肠搬淞 变黄曲霉 爿 m 觚馑脚 等 国内外菌种保藏机构收藏的产曲酸 菌株有米曲霉i f f l 2 3 2 6 即上海工业微生物研究所的5 5 4 米曲霉平展变种 d 硝珊 1 研 细s 淞 球f 1 2 3 3 7 米曲霉绿色交种2 2 7 8 8 亮自曲霉a t c c 4 4 0 5 4 黄曲霉a 1 陀c 1 0 1 2 4 4 沈阳农业犬学硕士学位论义 和产曲酸青霉 如一f c f f l 妇删磊 琏 自弦雅群m 触 c 1 8 2 2 7 镣 王博彦与佥其荣 2 o l 2 2 夔酸鹣台袋途径 曲酸的合成途径众说纷纭 至目前为止 较为人所接受的曲酸念成途径有两种理论 第一种理论叫做分裂说 誓 矗s s i 傀t l 黼碍 f o s t e l 舛9 这一派学者如c o 触l l i n i 和 q 镑碰越等入认为魏酸燕耀令三菝糖分子 g l 删汹赌及g l 弦d c 菇溷蛐经缩合 反应 再脱去二个水分子所产生的 如图1 1 所示 有些醋酸菌禚利用酒精生产醋酸时 发现也能生产曲酸 便能报好地证明这个理论 g 惝急 苫嚣鏊鬻 枷删忡蚰蝴 球 h 圈t l 曲藏食成机制t 分瓤说 羲拳l l 靶喀k 嘛d g 罐掩鲢s m 馥l 出辩 瓤蠡s s 主雌磕娜 第二耱溅论嘲傲分割落 卫1 ec 扪妇go u 主岫 这派学者如瓢n o s h i 衄l 鞠 1 w o 髓 镣人发现葡萄糖和曲酸结构非常相似 因此推测是葡萄糖氧化生成酮类中间产物 再脱 嵌鼹令水分予产生蓝酸 如圈l 2 所示 m 踟嘲在1 9 3 0 年尾 g 融c o s e 成功遮以健学法 会成馥酸便怒这理论的有效诞明 越撼姆融和b e n 诅e y 1 9 5 3 发现耱酸是由葡萄糖不经 碳环断裂直接转化而成 送说明了葡萄糖为合成曲谶的最佳碳源 k i 乜l 妇 1 9 6 8 在研 究魏酸合成动力学过程中 逑一步提邂钛蘩莓糖到鞠羧靛系裂反嶷孛 有一特逡薅反瘦 建决定性步骤 该酶在麓缀体形成过程巾同对合成 函就产酸前的麓丝俸形成过程与产 酸的系列反应溉关 i 切j l a s i i 1 9 8 0 雀研究曲酸产爨间黄曲霉菌体干重的关系时发现 在蓑俸于羹逸剿l o g 纯前 麴酸产量隧麓俸手重增加鼹褥蠢 当萤体于重达嚣l o 2 0 殴 辩 曲酸产爱髓菌体干耋增加雨降低 巍菡体千重超过2 0 9 绝对 发现发酵液中测不到 曲酸 因此他认为曲酸仅倪是某些真菌糖分解代谢的一个中间体 陈移亮等 1 9 9 8 欲黝允动支 垂1 2 藏簸贪戚辊剃 分辑泌 f 嚣l x 秘i c 蹰谴姆棚瓣s 瑚毵蛔瓣畦啦髓疆i 坞磕 帮 b 嘧 a i 等人发现在曲黢生产菌株一胁中脊h e x o l i r l a s e 掣u c o 静6 p s p h a c e 第一章前言 d e h y d 瑚喀e n 嬲e 6 p h o s p h o g l u c o n a t ed e h y 血嘲舱 出u c o d e h y o g c 皿 g l u c o 辩嫡d 嬲e 和g i u c a t ev d e h y d r o g e 皿 等六种酵素并在不同的培养时间下比较曲酸生产速率和这 六种酵素活性的关系 发现出u c o o x i d a 的活性太低 应和曲酸的合成无关 由曲酸 的浓度和酵素活性的关系 他确认g l u c o d e g 舔e 和g l u c o r l a t ed e 鲫船e 与 曲酸合成有关 并进一步推测出曲酸可能的合成途径如图1 3 詈一i 围1 3 曲酸在一舢中可能台成避径 b 面p a i n 虬1 9 8 1 f i 导1 3 k d j i c 舵i d p o 站i b l c 掣n n l c 暑i s 廿a i l s b y 一 枷 1 1 2 3 曲酸生产工艺 1 生产原料 曲酸发酵可以以多种碳源为原料 工业上常用淀粉或糖蜜为原料 如用葡萄糖为原 料进行发酵 更有利于曲酸的精制 但生产成本提高 据报道 p a r r i s hfw c ta l 1 9 6 6 曲酸的发酵生成最初使用的碳源是大米等谷类天然有机物 很快改用纯有机化合物 这 些有机化合物分为三类 多糖 淀粉 果胶 单糖及其衍生物 葡萄糖 木糖 甘露 糖醇 以及简单有机物 乙醇 甘油 以纯有机化合物作为碳源 可以避免天然有机 物成分不稳定 杂质多的影响 便于定量研究 在三类碳源中 单糖的效果比较好 其 中葡萄糖尤为常用 被认为最佳碳源 t a l d am e ta l 1 9 6 7 2 有机氮与无机氮都可用作氮源 3 工艺流程 斜面菌种 一种子培养 发酵罐培养 一过滤 浓缩 结晶 一 溶解 脱色 重结晶 一干燥 一白色曲酸 1 1 2 4 技术参数 1 菌种一般采用不产生黄曲霉毒素的米曲霉菌株 2 种子培养温度3 0 3 3 转速2 0 叫i n i n 装液量4 0 m l 也5 0 m l 6 沈阳农业大学硕士学位论文 3 发酵罐接种量1 0 1 5 4 发酵温度3 3 搅拌转速1 9 0 机n i l l 通气量8 0 0 u m 讯 s 浓缩采用直接浓缩法 5 0 7 0 真空浓缩 6 浓缩后于4 结晶 7 活性炭5 0 保温脱色 8 密封 避光包装 1 1 2 5 产品标准 曲酸含量兰9 9 5 重金属含量卯 0 0 2 氯化物翊 0 2 0 缸含量如 0 0 0 2 f e 含量如 0 0 1 外观白色针状结晶 1 1 3 曲酸的应用 曲酸由于具有抑菌 抑制酪氨酸酶活性等作用 使之在化妆品 医药 食品 农业 等方面有着广泛的应用 曲酸有很多用途 如可作生产食品增香剂麦芽酚的原料 用于 生产头孢类抗生素及其它合成药物的原料 曲酸可作为作物生长促进剂对粮食和蔬菜有 明显的增产效果 用作对人 畜无毒 无公害的杀虫剂 用作铁分析试剂 胶片去斑剂 等 目前最热门和最具前景的应用是在食品与日用化妆品方面 日本三省制药公司生产 的曲酸于1 9 8 8 年被日本厚生省批准可作为保鲜剂和增自荆加到食品与化妆品中 从此加 快了对曲酸的生产及应用研究的步伐 1 1 3 1 曲酸在食品工业中的应用 1 在食品中作防腐剂 历来 在食品防腐上都使用山梨酸与苯甲酸 安息香酸 及其盐类 由于此类防腐 剂对机体有一定的变异作用 所以在食品添加中受到量的限制 如允许使用山梨酸的量 为0 2 这个浓度在很多情况下都不能取得很好的效果 另外一些如醋酸盐 丙酸盐等 防腐剂因为对食品风味有影响也不能添加至理想浓度 再如一些水产制品与腌制品中 常规防腐剂在其添加量上很难起到好的效果 因而需要一种更为理想的防腐剂 曲酸与 目前在食品添加剂方面广泛使用的苯甲酸相比 有以下优点 陈移亮 1 9 9 8 易溶于 水 解决了山梨酸与苯甲酸等防腐剂需要有机溶剂溶解后再加入食品的问题 不为细菌 所利用 具有更强 更广泛的抗菌力 而山梨酸抗菌力弱 易为细菌所利用 只能在无 菌时加入才起作用 热稳定性好 可与食品共同加热灭菌 而山梨酸受热易挥发 p h 苎 塞照童 对曲酸抗菌力无明箍影响 而山梨酸与苯甲黢钠等随p h 增大而抗菌力减弱 曲酸对人无 刺激瞧 并可挪铡瓣硝酸盐生成效癌物 丽出梨酸对人皮肤 跟睛有刺激性 当有磷黢 盐存在时能生成致瘸物 辫文游等 2 o 缀实验证骧 豢培养基串魏酸含量达到o 2 o 5 时 对大多数细菌均有很好的抑菌效果 棚同浓度的曲陵抑菌能力瑟强于苯甲酸钠 尤其懋辩鼠伤寒沙门氏菌鹃抑制效果比苯甲黢钠豹抑副效纂强很多 许多疆车学者对照 酸俸为防腐裁骰7 穴量的应用研究工作 申请了许多戳曲黢为主要成势的复合食晶保存 剂的专利 这些结果证明曲酸确有广泛的抗黼作用 作为防腐剂添加予食品中时 具有 菲鬻好豹效暴 2 在食品中作绦鲜帮 新鲜的香菇 菠菜 甘蓝 苹果 香蕉 柑桔及鲜切椽等目前是用冷藏 冷冻 水 或熬承浸溃豹方法来逃行保鳟 毽霉霉效果不佳袭不方便 所戳罴要一释使露麓便 效 果露饕的方法 隗文沂等 2 0 0 0 保鲜涉及掰色调 形状 体积 风睬 香味 含水 量等状态的维持 但由于本身的性能及添加擞的限制 目前所用的保鲜荆很难完全达到 要求 魏用予莩聚保鲜豹乙氧基囔 龛诲残黧囊仅为l m g 纯 蘧羧戆觋究表骥 它舆露 抗氧化作用及抗繁体用 安全无毒易溶予水 只需少置即w 有效 是用于鲜花及蔬菜 水果保鲜的理想物质 内野用o 1 与1 o 的曲酸溶液分别以喷雾与浸润的方法处理褥 菇 菠菜等荔瘸败变色鳇裁菜 绥栗在鬻浸下撼郯发生异燮瓣香菇与菠黎 懿嚣壤然绦 持新鲜 很少萎缩 3 在食品中作护色剂 曲酸用予酶键褐交的抑制 耨鲜的果蔬蕊甲壳类产晶中存在的多酚飘他酶 p p o 会导致褐变 在这些食品的加工和贮存过程中其内源酚类物质被酶催化氧化形成褐色索 或黑色素 影响食品的色泽 并产嫩不良风味 长期以来 防止食品的酶假褐变是一个 重要的研究课题 在食品加工和僳藏中使用多酚簸化酶掷制荆照防止产龋酶鼹福变的蕊 要手段 目前常用的处理方法是利用二氧化硫或其他强还原憔禽硫化合物 这热化食物 在食品中残留并在以后的过程中会放出二氧化硫 会对食物的褥味造成损坏 此外肖过 不少掇道认为亚硫酸钠及二氧化硫可诱发过敏和礞喘 曲酸用于肉制品 食品的颜色是引起消费者食欲与购买欲的重臻因索 也是影响 食品价格的重要因素 在香肠 火腿等肉制品及煎予酱等水产晶的加工中 一般都使用 发色剂与色素 目前广泛使用的护镰剂与发色剂是甄硝酸镍 众所周知 期予驻硝酸般 沈阳农韭大学颟士学位论文 在食品加工及消化过程中能转化为亚硝胺 一种有较强致癌性与毒憔的物质 世界各 国都严掇隈制其饿熙塞 豆亚磷酸盐熬护色散果并不理想 其它合成或天然色素也都存 在魏予空气氧纯麓色泽减逶蕊静致静时效缀静不足之赴 在有色食螽串便焉鳆酸不徽w 降低溉硝酸盐等有害发色剂的使用量 而且姆维生素c 烟酰胺等目前使用的护色荆有 缀好豹趣成律用 爨其有抗萤 挽致瘗物佟髑 网砖也减少或取代了出槊敬帮苯甲羧戆 用蠹 因而蓝酸怒一种非常瑗想酌护色防穰瘸 有研究掇邋 盐酸等鞋毛崤蘼结梅像裔糖 添加平肉类熏制之前能抑制亚硝酸盐转化为溉硝胺 因为曲酸能与木材中的馏出物j 敷择 性绩会蔼挪测了致痰鹈的生戒 1 蛐s a 协d l a l 1 9 8 4 球 z 硼在文肇孛指出在熬斑 中翔魏酸不但熊保特爽色不穗 面且可防斑微生物生长 辩o z o v a b 1 9 骛4 医本成和 化成株式会社的深泽与若林 深泽立太郎 1 9 9 0 等在鱼予酱与猪肉加工中试验了曲黻 结暴淡骥添热7 裁羧豹极为显馨缝延长了携骰避趣 在牛肉静有些绿蔻蔬菜串的试聆结 果 暾耩同 1 1 3 2 曲酸在化妆晶中的应用 1 鳆酸在纯妆懿方嚣豹美鑫搬理 现代科学研究诞实 在入体表层细胞巾 黼氨酸在酶氮漩酶的催傀作用下 与氨自 由基缝过复杂的飘化 聚合等作用 生成黑色索 使皮肤起斑 变黑 曲酸能抑制百筹氨 酸黪鹣合戚 在捧涮酪氮酸酶涵牲方嚣 鼗羧及懿生携不矮子熊果营 巽黄弱张会物 胎纛提取液及抗坏斑酸 其独捌之处在予作厢时与铜离予结台 阻止了镝离子与酪氨羧 酶的活化作用 从而切断了合成黑色索的途径 黄璜 2 0 0 3 2 麴酸在纯妆灏孛静瘦用 曲酸对体外抑制酪氨酸酶黛成黑色素的研究已有诸多报道 如在黑色金鱼的水槽中 添加0 2 5 的曲酸 经1 2 个月淡察发现黑也金鱼变黄 朱秀荣与康健平 2 0 0 2 曲 酸在纯竣鑫审豹翳珠试验表骥 1 魏酸髯矜髑 骞效率霹达9 5 5 1 麴羧嚣器对瓣毅 具雀斑妇女1 4 个月的应用 对镯黄斑 老年斑 黄症色素沉着均有明擞效果 经临床试 验表明 曲酸在化妆品中对色瑗的祛除有显潇效果 且在合适配方下w 以无副作用并取 蹇雯磐袈莱e 鍪予潼酸缝骞效辍递巢毽素熬衾藏途径撬爨 瑟敬哥戳每耱睡黑墼纯薮熬 配合使用 曲酸谯2 0 0 3 0 0 n m 她有强吸收蝽 可吸收对皮肤有伤害作用的中波紫外线 因此曲酸具备防晒与美白 祛斑多种功效 邀就是曲酸及熊衍生物化妆龋在日本及霞方 鏊家滤毒亍嚣穰受鬻骧浆爨鑫 露滓多专裁与熬方溪密 懿祭臻裁与生产熬酸及愆垒耱系 第一章前言 列化妆品大量上市 对于我国发酵法生产曲酸的产业化必将起强大的推动作用 曲酸衍生物在化妆品中的推荐用量为o 5 2 o 制剂在p h 3 1 0 范围内稳定 曲酸 是曲霉发酵的天然产物 它只专一性地抑制形成黑色素的酪氨酸氧化酶 不抑制其他的 酶 对细胞没有毒害作用 曲酸是环状的吡哺圈化合物 除抑制酪氨酸氧化酶活性外 还进入细胞间质中组成胞间胶质 起到增加皮肤弹性和保水的作用 日本 法国美容专 家把曲酸用于人体面部黄褐斑的治疗 其效果特别明显 美容专家和生物化学家对曲酸 祛斑和增自的功效给予了科学的肯定 1 2 国内外研究现状 1 9 3 2 年m a y 研究指出 如果在培养基中添加乙烯氯乙醇对于提高曲酸的收率有显 著的效果 m a yoe e ta l 1 9 3 2 1 9 3 3 年高桥及朝井从果实分离出以果糖为碳源的曲酸 生产菌株 此曲酸生产菌属于葡萄糖酸菌属 此菌在以果糖或蔗糖转化所产生的果糖 甘露醇等为碳源 并添加酵母抽提液等有机氮源的培养基中静置培养 对糖原料能产生 1 0 的转化率 从三十年代就开始了曲酸发酵及生理生化的研究 但一直到五十年代几 乎未发现曲酸的用途 六十年代以后 蟹泽恒好等相继报道了将曲酸及其衍生物用作制 造香料麦芽酚或乙基麦芽酚的原料 并用于烟草 使曲酸发酵一度引起重视 七十年代 许多学者对曲酸的发酵进行了研究 如日本的北田牧夫 富金原孝采用深层培养法 由 米曲霉n o 6 9 生产曲酸 在1 5 0 0 l 发酵槽培养6 7 h 产曲酸2 9 9 l i 川手昭平一用米曲霉 m 1 0 8 进行发酵试验 进行了培养基组成的研究 发现碳源 葡萄糖为最好 蔗糖 麦芽糖 果糖次之 氮源 毋o n i t 0 鱼膏 酵母膏等复合有机氮源为最好 此外还需适 量的磷钾镁等 巴西的m t l i n 研究寄生曲霉u i b f a l 2 生产曲酸时 发现曲酸在发酵 液中结晶 我国七十年代也有类似的研究与生产 后来由于曲酸制备麦芽酚的工艺被淘 汰 曲酸的应用范围未能进一步开拓 曲酸发酵未能产业化 九十年代以来 曲酸的应 用研究取得越来越多的成绩 特别是发现曲酸能有效抑制酪氨酸酶 或多酚氧化酶 的 活性 可用于化妆品增自与食品果蔬防腐保鲜等 因此曲酸产品重新引起人们的兴趣 但是对盐酸发酵的研究至今并未有很大的突破 七十年代北田 富金的发酵水平为发酵 9 6 h 产酸2 9 川手的报道中发酵产酸虽然可达5 6 但需要1 3 1 7 d 国内北京日化 一厂1 9 6 7 年曾使用黄曲霉爿印舢批量生产曲酸用于香料麦芽酚的生产 后来北大钱 存柔等曾帮助诱变菌种 生产性能达到7 d 产酸4 左右 但最终未能正常生产 近年来 国外有关曲酸报道较多 其中大部分为曲酸衍生物的制备及应用研究与应用专利报道 l o 沈阳农业犬学硕士学位论文 并已注意到麴酸生产中黄赧霉毒素的影嚷 丽有关麴酸发酵研究报道并不太多em o o y o u 强 拇9 2 盼强定纯整长缨藏发簿擞产趣酸及9 5 每a 醢珏o l i 煞率连续镞藐簿貘表瑟 液态培养生产曲酸 但不怒产酸低就是放大极为困难 并不易低成本大规模生产 国内 最近有报道郑铁霞等 1 9 9 5 用黄曲霉8 0 0 4 发酵生声曲酸将发酵周期缩短至7 d 裴疆 森 1 鳄7 辙遭蘑t 诱嶷荚麴霉缮鬓6 d 最态产酸6 耱 豹蓥株 毽并未豢卺辩箕避行 黄曲雩毒素产生路径切断殿黄曲霉毒索的含量澜定 蛆酸发黪艇产中如产嫩黄曲霉毒索对曲酸的生产与应用是是非常有害的 所以曲酸 提取霹还登缀进一步热王 去捧黄魏霉潆素 我稍为使生产的瑟羧逶予食品与纯教菇 溉用了不产黄曲霉毒素的米曲霉菌株作为出发菌株 进行u v 诱燮岛6 0 c o 诱燮 并进行 发酵工艺研究 使摇瓶平均水平达到7 d 产酸5 缀检溅不产黄曲霉毒素 保隙了生产 及食品 亿妆品方箍应用熊安全往 1 3 研究目的与意义 随着曲羧产晶墨盏受戮熏褪 毂酸艘爆靛枣场媳疆蘸扩大 嚣裁 发酵生拶妞酸熬 方法 有液态培养法 通风发酵法 匿鼯化细胞技术等 但益酸发酵都面 隘着生产效率 低 生产成本商 难以大艘模工业化生产等问题 本论文对曲酸生产菌进行了诱变 发 赫工艺优化研究 获褥囊产鼗酸生产燕秘劳确定最饿发黪工艺 掇瘫了基酸产爨 逶蓬 曲酸的抑菌试验及对多酚氧化酶活性的抑制试验 姘究曲酸对新鲜的食品的防腐和护色 作用 因此 本课题的研究具有一定的懑义 1 搀态夔酸生产效搴 降低垒产成本 繁采瞧大豹经济效豢 2 为荫酸工业纯生产奠定基础 3 推动食品保鲜研究的发展 4 研究内窭 本课题的研究首先将米曲霉2 3 3 6 和米曲霉2 3 3 7 活化 再在筛选培养基上筛选出一 株优良的菌株 然后采用 诱变 联 c o 诱变获得产曲酸高 性能稳定的菌株 在此基 鬟骜主采角穗寝溪方法撬徼发黪壤葬基 确定最佳发酵臻莽薹 瑟蓬交交互试验捷纯捶藤 发酵条件 确定摇瓶发酵的最佳发酵工愁参数 为工业化生产曲酸提供依据 进行曲酸的应用研究 先对食品中常见的腐败菌进行抑菌试验 然后再进行髂氨酸 蕊葭撵懿试骏 浚臻鏊酸淼食菇孛霹传洚耱囊蘩 轳色裁 第二章曲酸生产苗的选育 第二章曲酸生产菌的选育 生产曲酸的微生物主要是曲霉属 有疏展曲霉 一秽帆够心螂 构巢曲霉 4 月汹z k 淞 寄生曲霉o 脚批 溜曲霉 彳 伽删锄时 米曲霉 a 0 弦珊 黄曲霉 4 舢 白色曲霉 a n f 6 埘 鱼坚曲霉 a g i 驴玎招淞 棒曲霉 a c b 榭淞 烟曲霉 彳加魄讲淞 巨大曲霉 a g 姆册衍珊 泡盛酒曲霉等 其中产酸较高的是米 曲霉和黄曲霉 黄曲霉在产生曲酸的同时产生黄曲霉毒素 为了曲酸在食品和化妆品上 应用的安全性 本课题选择不产黄曲霉毒素的米曲霉为出发菌株 本研究对c i c c 提供的米曲霉2 3 3 6 2 3 3 7 经过4 种培养基摇瓶培养发现2 3 3 7 产曲 酸较低只有3 9 0 9 l 2 3 3 6 产酸较高达到1 2 3 4 9 l 故将2 3 3 6 作为出发菌株 将2 3 3 6 进行分离 纯化 通过u v 与 c o 诱变 获得一株产酸高并稳定的交异菌株u c 6 9 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种与原料 米曲霉2 3 3 6 购于中国工业微生物菌种保藏中心 曲酸标准样品为德国础e d e l d ch a c n 公司分析纯试剂 玉米淀粉购于沈阳农业大学超市 豆饼粉是市售豆饼粉碎后过6 0 目筛 2 1 2 培养基 1 p d a 培养基 马铃薯2 0 0 9 琼脂2 0 9 葡萄糖2 0 9 水1 0 0 0 i l l p h 自然 保存菌种 制法 马铃薯去皮后切成块 煮到马铃薯能被玻璃棒戳破 约2 0 3 0 i n i n 用4 层纱布过滤 再加葡萄糖及琼脂 加热融化后再补足水至l o o o n l l 2 活化培养基 葡萄糖l o 可溶性淀粉2 酵母膏1 m g s 0 4 0 2 5 k h 2 p 0 4 0 5 0 k c l 0 0 5 琼脂2 p h 6 0 3 筛选平板培养基 葡萄糖1 0 酵母膏o 5 0 m g s 0 4 0 0 5 k h 2 p 0 4 0 1 0 f e c l 3 0 1 0 琼脂2 p h 6 o 4 种子培养基 沈阳农业大学硕士学位论文 同活化培养基 5 发酵培养基 玉米淀粉 o 豆饼粉 过6 0 目筛 0 5 0 m g s 伪d 0 5 砌 2 p 0 4 o 10 p h 6 d 2 1 3 摇瓶培养 接2 环孢子于装有4 0 i n l 发酵培养基的2 5 0 1 1 1 l 三角瓶中 3 0 1 9 0 r 抽i l l 振荡培 养7 d 后测曲酸产量 2 1 4 试验主要设备 超净工作台s w 二c j 1 f 型苏州安泰空气技术有限公司 全温振荡培养箱h z q f 型 哈尔滨东明医疗仪器厂 可见分光光度计w f j 7 2 0 0 型尤尼科 上海 仪器有限公司 手提式不锈钢蒸汽消毒器 2 8 0 a 型上海三申医疗器械有限公司 电子天平j d 2 0 0 2 2 型 沈阳龙腾电子称量仪器有限公司 酸度计p h s 2 5 型上海理达仪器厂 恒温磁力搅拌器8 5 2 型常州国华电器有限公司 离心机 l 一5 哦型上海安亭科学仪器厂 数显恒温水浴锅h h 6 型 常州国华电器有限公司 光学显微镜b x 4 l 型o 咖u s 光学有限公司 电热鼓风干燥箱d g f 3 0 型南京实验仪器厂 电热干燥培养箱h g 3 0 3 型 南京实验仪器厂 手提式高速中药粉碎机d f 7 1 0 0 型 温岭市大德中药机械有限公司 超声波清洗器k q 2 5 0 d b 型 昆山市超声仪器有限公司 电子万用炉 天津市泰斯特仪器有限公司 粉碎机 风城市农机制造有限公司 2 1 5 曲酸含量的检测方法 三氯化铁比色法 1 标准曲线的制作 0 1 曲酸标准样品溶液 准确称取曲酸标准样品o 1 0 垤溶于蒸馏水中 定容至 l o o m l l f e c l 3 一h c i 准确称取1 0 0 0 9 f e c l 3 溶于蒸馏水中 加入2 m l 浓盐酸 定容至 第二章魏黢生产蓊静选育 1 0 0 m l 用亥g 凌吸管蔽欷1 o 1 5 2 o 2 5 3 o 3 5 4 o 霹 5 5 o n 正标准样品溶液分装 于l o 溉也容量瓶巾 各加入2 m l l f e c b h c l 照色剂 定容至l o 呖l 反复摇匀后于 7 2 0 0 型分光光度计在5 0 0 n m 处测不同浓度标准液o d 5 0 0 值 以蒸馏水加2 m l 显色剂作 为窆鑫对照 张理憩等 勰 将缝果绘残标猴魏线冕熬2 l 00 511 5 z 2 533 5 44 555 5 标样量 m d s 岬l ea o u n t 1 围2 1 曲酸标准曲线 f i g 2 1s 协i l d a r dc i l f v c0 f k q j i c 髓i d 2 发酵液中曲酸含量的测定 将发酵液离心除菌丝后稀释1 0 倍 取1 d 也稀释液与标准曲线制作同样处理测 o d 5 2 1 6 诱变条件及方法 2 1 6 1 u v 诱变方法 1 孢子悬浮液的制备 在p d a 斜面培养基上培养4 d 的新鲜 成熟的孢予上加入l0 l l l l 无菌水 轻轻振荡 然后转移到1 8 0 1 8 n m 无菌试管中 经玻璃球振荡打散后用7 层无菌擦镜纸过滤得到分 散的孢子悬浮液 然后制成浓度为1 1 0 6 的孢子悬浮液 2 u v 诱变 吸取l o m l 浓度为1 1 0 6 孢子悬浮液置于直径为9 锄的培养皿中 在2 0 w 紫外灯下 距离3 0 c m 磁力搅拌 采用不同时间进行紫外照射 将诱变后的孢予悬液进行适当稀 释 吸取0 1 m l 红灯保护下在筛选平板上涂布 同时将未诱变的原菌液采用相同的操 作做对照 然后用黑纸将培养皿包好 放入3 0 培养箱中进行培养 3 d 后菌落计数得 出致死率并依次挑选显色快 色斑深的菌株进行摇瓶发酵计算正突变率 裴疆森 1 9 9 7 3 6 0 c o 诱变 将u v 诱变后的正突变菌株制成浓度为l 1 0 6 孢子悬浮液 将装有1 0 m l 孢子悬浮 姿里壅些查堂堡圭堂壁堡壅 液的试管用6 0 c o 以不同剂量照射后 适当稀释后吸取0 1 m l 在筛选平板上涂布 同时 将未照射的原菌液采用相同的操作做对照 培养3 d 后先进行菌落计数得出致死率 再 依次挑取色斑深 大的菌株进行摇瓶发酵得出正突变率 孙微与陶文沂 1 9 9 7 2 1 7 筛选方法 先将适当稀释后的孢子悬浮液在筛选平板上涂布 3 0 培养4 d 后挑取显色深的菌 株 再经摇瓶发酵筛选出曲酸产量高的菌株 沈卫荣 2 0 0 3 2 1 8 遗传稳定性试验 将菌株u c 6 1 2 u c 6 9 传代数次及保藏后测定其产酸能力 2 2 结果与分析 2 2 1 诱变出发菌株的筛选 将米曲霉2 3 3 6 2 3 3 7 在活化培养基上活化使其恢复活性 经4 种培养基摇瓶振荡 培养后发现米曲霉2 3 3 6 在以玉米淀粉糖化液为碳源的培养基中产曲酸较高 可达 9 8 4 9 几 而米曲霉2 3 3 7 产曲酸较低 7 d 后仅3 9 0 9 几 因此将米曲霉2 3 3 6 作为出发菌 株进行诱变 据文献报道曲酸与三氯化铁反应星红色 故将米曲霉2 3 3 6 制成孢子悬液 再适当稀释后在筛选平板培养基上涂布 然后3 0 倒置培养 3 d 后 挑选色斑大 深 的菌株进行摇瓶发酵复筛 最终获得一株产酸稳定的菌株米曲霉c 2 3 3 6 摇瓶发酵7 d 后可产曲酸1 2 3 4 9 l 2 2 2 菌种的诱变 2 2 2 1 紫外线诱变的效应 最佳诱变剂量的确定 以c 2 3 3 6 作为出发菌株 根据2 1 6 1 中u v 诱变方法采用5 1 0 1 2 1 5 1 8 2 0 2 5 l i l i n 进行紫外照射 依次挑选出显色快 色斑又大又深的红色 菌株继续摇瓶发酵 到7 d 测定曲酸含量 结果见表2 1 从表2 1 中可以看出5 2 5 m i l l 的诱变处理 致死率都达到了9 9 以上 有的菌株 呈现负向突变 曲酸产量降低 但1 0 2 0 1 i l i l l 诱变时间的正突变率较高 曲酸产量提高 的多 其中2 0 m m 处理时正突变率最高 诱变效果最好 致死率达到9 9 9 7 菌丝体 形态没有明显的变化 曲酸产量有了明显的提高 经过诱变获得的突变菌株u 2 0 9 发 酵7 d 可产曲酸3 4 6 7 9 几 是原菌株的2 8 倍 我们将其作为6 0 c o 诱变的出发菌株 希 望获得更高的曲酸产量 第二章曲酸生产茵的选育 寰2 曲酸生产蕾w 诱銮结果 t 曲1 e 2 1r e 蚰to f l v 删i a g e 删so f k o j i c 撕却训n gs 廿出 c 2 3 3 6 1 5 u 5 1 01 4 8 0 u 5 一1 8l o 0 0 鲫 3 25 0 2 lu lo 22 2 6 3 u i o 1 52 1 7 3 u 1 0 2 32 7 8 0 9 9 5 65 0 2 4u 1 2 72 9 1 6 u 1 2 t 52 9 3 4 u 1 2 4 52 5 3 1 9 9 9 25 0 4 3 6u 1 5 33 1 8 6 u 1 5 1 8 2 8 7 7 u 1 5 4 02 4 2 3 9 9 9 55 01 2