（应用化学专业论文）葛根美白活性物质的分离提取及在化妆品中的应用.pdf

捅费 辅孽 1 1 本课题主要对中草药葛根中含有的对皮肤具有美白活性的物质进行了研究，包括葛 根有效成分的提取，提取工艺的优化，和对美白活性成分进行分离纯化，并进一步探讨 了葛根提取物对酪氨酸酶抑制作用的类型和机理，最后对葛根提取物作了一些应用研 究。 对葛根，金银花，六月雪和柿叶四种常用中草药分别通过水和乙醇回流提取、浓缩、 低温烘干。采用生化酶法测定各提取物的美白活性。分别测定它们的水提取物和乙醇提 取物的美白活性，得到葛根的水提物和乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用强于其它几种 中草药的提取物。采用单因素实验法，考察了缓冲溶液的p h 值、l ，酪氨酸的量、酪氨 酸酶的量、恒温时间和反应时间这五个因素对美白功效实验体系的影响，得到最佳实验 条件是：p h 值为6 8 5 、l 酪氨酸溶液的量为1 0 m l 、酪氨酸酶的量为0 4 0 m l 、恒温时 间为1 0 m i n 、反应时间为5 m i n 。 采用三因素四水平正交试验法对葛根乙醇提物的提取条件进行优化，得到最佳工艺 条件为：乙醇浓度为7 5 、回流时间4 h 、料液比1 ：8 、提取次数2 次。并绘制了葛根 素标准品的标准曲线，测定了正交实验中9 次实验得到的葛根提取物的黄酮含量。 将葛根的乙醇提取物通过不同极性的溶剂萃取，浓缩后得粗提物，对各粗提物进行 酪氨酸酶抑制率的测定，得到葛根的乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶的抑制作用最强。然后 用常压硅胶柱层析法对该萃取物作梯度洗脱，用硅胶g 薄板进行t l c 检测，跟踪沈脱 情况，得到a j 共l o 个洗脱物，再分别对这些洗脱物进行酪氨酸酶抑制率的测定。从 测定结果得到，从葛根中分离得到两个组分b 和d 对酪氨酸酶的抑制率较高，分别为 6 5 7 和7 9 2 。对b 进行第二次柱层析，得到了对酪氨酸酶抑制竹：用明显的b 3 ，它对 酪氨酸酶的抑制率为9 2 3 。对d 组分进行第二次柱层析后，得到对酪氨酸酶抑制作用 最强的是d 4 ，它对酪氨酸酶的抑制率达9 8 5 。 对b 3 和d 4 进行高效液相色谱、紫外色谱，液质联用色谱检测，并与标准品对比， 推断大豆苷元和葛根素分别为中草药葛根中的主要美白成分。 研究葛根提取物抑制酪氨酸酶活性的动力学，发现葛根素对酪氨酸酶的抑制类型为 非竞争性抑制。 将葛根素添加入膏霜中，用0 【熊果苷作阳性对照，通过对1 5 位实验者进行3 个月 的人体实验，得到添加葛根素的膏霜具有较好的皮肤美白效果。 采用滤纸片法测定葛根提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果，得到葛根 素对两种菌的抑菌效果影响不明显，而葛根醇提物对大肠杆菌的抑菌效果更明显。 关键词：葛根；美自；酪氨酸酶；化妆品；提取；分离； 江南人学硕i ：学位论文 a b s t r a c t t h i sp a p e rf o c u s e do ns t u d y i n gt h es k i n w h i t e n i n ga g e n tf r o mr a d i xp u e r a r i a ea n di t s i n h i b i t o r yc a p a b i l i t ya g a i n s tt y r o s i n a s e t h ea c t i v ea g e n t sw e r ee x t r a c t e df r o mr a d i xp u e r a r i a e a n dt h ep r o c e s s i n gc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e dw i t ht h eo r t h o g o n a ld e s i g nt e s t a f t e rt h e p r o c e s so fs e p a r a t i o na n dp u r i f y i n g ，t h es k i n - w h i t e n i n ga g e n tw a so b t a i n e d ，a n dt h ei n h i b i t o r y e f f e c to fp u e r a r i no nt y r o s i n a s ew a ss t u d i e d ，u s i n ge n z y m o l o g i c a lk i n e t i cm e t h o d t h ew a t e ra n de t h a n o le x t r a c t so fr a d i xp u e r a r i a e ，l o n i c e r aj a p o n i c at h u n b ，a r t e m i s i a a n o m a l as m o o r ea n dd i s p y r o s lk a k il f w e r eo b t a i n e db yr e f l u x i n gw i t hb o t hw a t e ra n d 7 5 ( v v ) e t h a n o l ，c o n c e n t r a t i o na n dd r y i n g ，r e s p e c t i v e l y n l ei n h i b i t o r yc a p a b i l i t yo fw a t e r a n d7 5 ( v v ) e t h a n o le x t r a c t sa g a i n s tt y r o s i n a s ew e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t e x t r a c to fr a d i xp u e r a r i a eh a st h es t r o n g e ri n h i b i t i o nt h a no t h e r s t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n so fs k i n w h i t e n i n ga g e n t si n h i b i t i o no nt y r o s i n a s e d e t e r m i n e db yt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tm e t h o dw e r ea sf o l l o w s ：t h ep hv a l u eo f p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p b s ) w a s6 8 5 。t h ev o l u m eo fl t y r o s i n ew a s1 。0 m l t h ev o l u m e o ft y r o s i n a s ew a s0 4 m l ，t i m ei nw a t e rb a t hb e f o r et y r o s i n a s ea d d e dw a s10m i n u t e sa n d r e a c t i n gt i m ew a s5m i n u t e s t h ep r o c e s s i n gc o n d i t i o n so fe t h a n o le x t r a c to fr a d i xp u e r a r i a ew e r eo p t i m i z e dw i t ht h e o r t h o g o n a d e s i g nt e s t t h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o nw a so b t a i n e da st h ec o n c e n t r a t i o n o fe t h a n o lw a s7 5 ：t i m ef o rr e f l u x i n gw a s4 h t h er a t i oo fm a t e r i a la n ds o l v e n tw a s1 ：8a n d r e p e a tt h ep r o c e s sf o r2t i m e s t h ea m o u n to ff l a v o n o i df r o me x t r a c to fr a d i xp u e r a r i a ew a s i n v e s t i g a t e d r e s u l t ss h o w e dt h a tt h el a r g e s ta m o u n to ff l a v o n o i dw a sl3 7 4 t h ee t h a n o le x t r a c tw a sf u r t h e r s e p a r a t e dw i t hs o l v e n t so fd i f f e r e n tp o l a rs u c ha s p e t r o l e u me t h e r ，t r i c h l o r o m e t h a n e ，e t h y l a c e t a t ea n dn b u t y l a l c o h 0 1a n dt h e i ri n h i b i t o r y c a p a b i l i t ya g a i n s tt y r o s i n a s ew e r ec o m p a r e d i th a sb e e nf o u n dt h a tt h ei n h i b i t o r yc a p a b i l i t y o fe t h y la c e t a t e - e x t r a c t e df r a c t i o na g a i n s tt y r o s i n a s ew a st h es t r o n g e s t t h ee x t r a c to fe t h y l a c e t a t ew a sp u r i f i e db ys i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n dt r a c k e db yt l c 10e l u a n t s w e r eo b t a i n e da n dt h ei n h i b i t o r yc a p a b i l i t yo fe a c he l u a n ta g a i n s tt y r o s i n a s ew a s i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n h i b i t i o no fbw a s6 5 7 a n dt h ei n h i b i t i o no fdw a s7 9 2 b a n ddw a sf u r t h e rp u r i f i e db ys i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n dt r a c k e db yt l c i th a s b e e nf o u n dt h a tt h ei n h i b i t i o no fb 3o b t a i n e df r o mbw a s9 2 3 a n dt h ei n h i b i t i o no fd 4 o b t a i n e df r o mdw a s9 8 5 t oi d e n t i f yt h es k i n - w h i t e n i n ga g e n tf r o mr a d i xp u e r a r i a e ，h p l c ，u va n dl c m sw e r e u s e d i th a sb e e nc o n f i r m e dt h a td a i d z e i na n dp u e r a r i nw e r et h et w om a i ns k i n w h i t e n i n g a g e n t so b t a i n e df r o mr a d i xp u e r a r i a e t h em e c h a n i s mo fp u e r a r i n si n h i b i t i o no nt y r o s i n a s ew a ss t u d i e d u s i n ge n z y m o l o g i c a l k i n e t i cm e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp u e r a r i nw a sa n o n c o m p e t i t i v ei n h i b i t o rp r o v e db yi t s l i n e w e a v e r - b u r kp l o t s p u e r a r i nw a sa p p l i e di nc o s m e t i c t h er e s u l t sc o n f i r m e dt h a tp u e r a r i nh a ss k i n l i g h t e n i n g e f f e c ta f t e r3m o n t h so ft r i a lb v15p e o p l e t h ea n t i m i c r o b i a le f f e c to fr a d i xp u e r a r i a ee x t r a c ta n dp u e r a d nw e r es t u d i e d r e s u l t s s h o w e dt h a tr a d i xp u e r a r i a ee x t r a c th a sb e t t e ra n t i m i c r o b i a le f f e c tt h a np u e r a r i n i i 摘要 k e y w o r d s ：r a d i xp u e r a r i a e ；s k i n w h i t e n i n ga g e n t ；t y r o s i n a s e ；c o s m e t i c ；e x t r a c t i o n ；s e p a r a t i o n l i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是各人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：匀塾挚 日期：文问占后毕 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件乖磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 魁整堡 导师签名： 日 期： 象，移7 i ( 汐驴8 6 t 第一章综述 第一章综述 前言 化妆品的使用具有非常悠久的历史，并伴随着人类自身的存在和发展而流传至今i l j 。 考古学家们相信，人类自旧石器时代即己开始使用化妆品，这一时期大约自5 万年前开 始。皮肤美白最早开始于2 0 世纪5 0 年代，当时主要是外用汞制剂。由于其安全性问题， 汞制剂在7 0 年代被禁用。此后，人们的美白观念从借助物理性的遮盖美白( 如粉饼、粉 底和增白粉蜜等) 逐渐向黑色素还原的生理性美白转变。美白祛斑化妆品市场近年来日 趋活跃，销售快速增长。美白剂作为美白化妆品的功能性原料因此受到极大关注，它的 开发与应用研究不断深入。各国对皮肤美白剂作用机理、新的美白剂的开发和美白剂的 应用投人了大量的人力、物力，并取得了明显的进展，已有很多新的美白剂被应用到产 品当中。近年来，美白护肤品越来越被人们所重视，其安全性和功效性评价自然成为消 费者和生产厂家所关注的重点【2 】。通过美白护肤品的使用，东方人想要得到白晰、光洁 的皮肤，而欧美消费者希望减轻和消除老年斑、黄褐斑等色素沉积。 中草药在几千年内n # i - 敷的应用中已经积累了许多药效记录，对它们的用量、安全 性和副作用也有很多验证，这是任何一个合成化合物无法与之相比的。天然活性物从中 草药、动物器官和微生物的天然原料中提取分离，化学结构和生物活性没有改变，而其 又有多重效能，药效持久稳定，适用面广，无副作用或副作用很小，因此是顺应回归自 然，科学美容、科学护理这一趋势的。 并且以天然活性物作为化妆品原料和添加剂的优点是p j ： ( 1 ) 可大大提高有效活性物的浓度，针对性强，疗效明显，丝毫不在合成药物之下。 副作用小，特别适用于预防性的化妆品助剂。 ( 2 ) 在精制和纯化过程中除去了天然原料共有的淀粉、糖分、油脂、色素、蜡等无效 成分，这些成分又恰恰是微生物生长的营养物质，便于化妆品防腐。也可以除去 残余农药。 ( 3 ) 制品色浅，有利于用入膏霜类化妆品中。 ( 4 ) 提供了可检测的活性物含量指标和方法，以便化妆品的防假和防伪。 ( 5 ) 有利于迸一步的药理研究。 我国是中药的发源地，中药、天然产物资源丰富，而且中草药的应用已有几千年的 历史，与其它国家相比我们具有得天独厚的优越条件，也给开发和利用美白的天然产物 提供宽广的空间。从中草药中提取的有效成分具有独特的功能和疗效，由于它们具有很 好的美白功能，一直受到国内外研究者的密切关注。越来越多的研究者倾向于从中草药 中寻找安全高效的美白祛斑活性物质，对天然提取物在医疗保健和化妆品等领域的应用 研究也越来越多。 近年来随着人们对黑色素生成生物学机制的不断认识，加之化学美白剂存在的安全 性问题，从天然产物中寻找安全高效的美白活性物质己成为化妆品研究的热点，具有很 望堕叁堂婴：! ：堂竺笙兰 好的发展前景，已经成为美白化妆品的发展方向。 第一节黑色素形成机理及美白机理 皮肤的颜色取决于黑色素的含量及分布。黑色素形成的生理过程基本概括为：黑色 素细胞产生黑色素；黑色素颗粒通过黑色素细胞树枝状突起向角朊细胞转移；转移至角 朊细胞的黑色素颗粒随表皮细胞上行至角质层，并随角质层脱落而排泄【4 】。 对美白剂的开发和应用应建立在对美白机理深入了解的基础上，而皮肤黑色素抑制 机理是美白机理的中心内容，因此，了解黑色素的生成原因与机理是首要的。 1 1 黑色素形成的化学机理1 5 j 据调查，约有7 0 的被调查者认为女性美容的最大的忧虑之一是老人斑、雀斑的产 生。老人斑、雀斑的形成，实际上是体内酪氨酸代谢的失调、色素的异常沉积造成，根 本原因就是酪氨酸酶的活性高于正常状况。 在黑色素细胞中，黑色素的形成发生在黑色素细胞内的某一特定细胞器上，该细胞 器被称为黑素体，其中含有酪氨酸酶( 因该酶中含有c u 2 + 而有时被称做铜酪氨酸酶) ， 该酶是一多酚氧化酶，属于氧化还原酶类，是黑色素形成过程中必不可少的酶之一。 黑色素的合成必须有三种物质参与：酪氨酸为制造黑色素的主要原料；酪氨酸酶是 酪氨酸转变为黑色素的主要限速酶；酪氨酸在酪氨酸酶的作用下产生黑色素，此种作 用为氧化过程，必须与氧结合才能转变为黑色素。 目前公认的黑素合成途径是：酪氨酸一多巴_ 多巴醌_ 多巴色素叶二羟基吲哚一酮 式吲哚_ 黑素，此途径合成的黑素为真黑素。此外，多巴醌还可通过另一途径经半胱氨 酸催化生成褐黑素，但褐黑素在皮肤中的功效尚未深入了解。 目前得到共识的黑色素的形成过程如图1 1 所示：存在于黑色素细胞组织中的酪氨酸 酶( t y r o s i n a s e ) 等酶的作用经多巴( d o p a ) 、多巴醌( d o p a q u i n o n e ) 、多巴色素( d o p a c h r o m e ) 、 二羟基吲哚( d i h y d r o x y i n d o l e ) 等中间体逐步转化为真黑素；多巴醌通过另一途径由半 胱氨酸( s c y s t e i n y l d o p a ) 参与反应形成褐黑素。在该系列反应中，多巴从还原型到氧化 型结构反复进行，这些中间产物，在还原型时颜色很淡或无色，在氧化型时颜色增加， 最终形成许多有醌式结构的不同吲哚联结的杂聚合物，即为黑色素。 2 第一章综述 ( o ) 褐黑素一 h o h o h o h y 0 0 m + 苯并噻唑衍生物 5 - s - 半胱氨酰多巴 ( o ) + o h c o o h o h 2 一s 一半胱氨酰多巴 h o ( o ) 真黑素一 h o i h c o o h 1 一 h o h o i 无色多巴色素 j ( o ) h 5 ，6 一二羟基吲哚一2 一羧酸 多巴色素 图l - 1 黑色素形成过程 f i g 1 1t h ep r o c e s so fm e l a n i ns y n t h e s i s h 导致黑色素细胞功能异常的原因有很多种，目前认为可能的因素有遗传、口服避孕 药、妊娠、自身免疫性疾病、紫外线、废气、活性氧等环境因素。某些食物也是皮肤变 黑的祸根，如富含铜、铁、锌等金属的食物易使人的皮肤变黑，这是因为这些金属可直 接或间接地增加与黑色素生成有关的酪氨酸酶及多巴醌等物质的数量与活性。不少药物 也会改变正常肤色，如氯喹对黑色素的亲和力特别强，会加重肤色变黑。不少疾病也会 改变正常肤色，使其变黑，如营养不良性疾病，体内氧化与抗氧化平衡失调；内分泌失 江南火学顾i ：学位论文 调；微生态失衡；代谢紊乱；机体微量元素含量异常等【6 1 。 1 2 化妆品美白剂的美白机理 皮肤美白剂就是作用于皮肤黑色素生成、代谢过程中抑制黑色素生成且符合规范的 物质。美白机理即黑色素的抑制机理，黑色素的抑制机理可分为胞内抑制和胞外抑制1 7 j 。 黑色素细胞的胞内抑制：在黑色素形成过程中酪氨酸酶是主要限速酶，该酶活性大 小决定着黑色素形成的数量。酪氨酸酶是一种多酚氧化酶，属氧化还原酶类，该酶主要 催化两类不同的反应：( 1 ) 一元酚羟基化，生成邻二羟基化合物；( 2 ) 邻二酚氧化，生成 邻二苯醌。这两类反应中均有氧自由基参与反应。当前化妆品市场上的美白产品，几乎 绝大多数以酪氨酸酶抑制剂为主。依据抑制机理的不同，可将该类化合物分为两类：( 1 ) 酪氨酸酶的破坏型抑制；( 2 ) 酪氨酸酶的非破坏型抑制。所谓酪氨酸酶的破坏型抑制，就 是寻求某种美白剂，使该美白剂直接对酪氨酸酶进行修饰、改性，使之失去对黑色素前 体一酪氨酸的作用，从而达到抑制黑色素形成的目的。所谓酪氨酸酶的非破坏型抑制， 即不对酪氨酸酶本身进行修饰、改性，而是通过抑制酪氨酸酶的合成或取代酪氨酸酶的 作用底物，从而达到抑制黑色素形成的目的。根据非破坏型抑制剂的美白机理，目前研 究大致有下列3 种形式：酪氨酸酶的合成抑制剂；酪氨酸酶糖苷化作用抑制剂； 酪氨酸酶作用底物替代剂。 在黑素的形成过程中，除了酪氨酸酶以外，多巴色素异构酶( d o p a c h r o m et a u t o m e r - a s e ，t r p 2 ) 和5 ，6 二羟基吲哚2 羧酸氧化酶( d h i c ao x i d a s e ，t l 冲1 ) 也起作用， 这就是三酶理论。多巴色素异构酶r 口t r p 2 ，是一种与酪氨酸酶有关的蛋白质，其抑制 机理是促使所作用的底物发生重排，生成底物的某一同分异构体，最终生成另一黑色素。 即在多巴色素自发脱羧、重排生成5 ，6 二羟基吲哚( d h i ) 的同时，黑色素细胞内部分多巴 色素由于多巴色素异构酶的存在而发生重排生成5 ，6 二羟基吲哚2 羧酸。因此该酶主要 调节5 ，6 二羟基吲哚一2 羧酸( d h i c a ) 的生成速率，从而影响所生成的黑色素分子的大小、 结构和种类【8 】。对该酶的抑制目前认为主要是竞争性抑制。有关t l 冲2 的抑制，目前研 究报道较少。对d h i c a 氧化酶( t r p 1 ) 和过氧化物酶抑制机理的研究就更少了。 黑色素细胞的胞外抑制：黑色素的形成不仅是黑色素细胞的胞内行为，同时也是胞 外物质作用的结果。内皮素是一类由2 1 个氨基酸组成的多肽物质，其中内皮素i ( e t - 1 ) 、 内皮素2 ( e t 2 ) 和内皮素3 ( e t 3 ) 均已可分离。近来研究发现，内皮素1 和内皮素- 2 也是 黑色素的形成过程中两种不可缺少的胞外物质。 第二节化妆品美白剂的美白功能和功能评价方法 。z * 2 1 化妆品美白剂的美白功能 目前要求的皮肤美白剂应该符合两个标准：一是对酪氨酸酶活性有较高的抑制率， 能显著地减少黑色素的生成；二是有较高的安全性，对人体皮肤无毒无刺激。 化妆品的美白功能可以归纳为以下几个方面一j ： ( 1 ) 抑制黑色素细胞( m e l a n o c y t e ) 增殖。 4 第一章综述 。- 。1 。_ 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。- 。_ - - _ _ _ - - l - 。- _ _ _ _ _ _ _ _ 一l _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一 ( 2 ) 抑制黑色素形成：抑制酪氨酸酶、多巴互变酶( d e p a c h r o m e t a u t o m e r a s e ) 、二羟基 吲哚酸( d h i c a ) 氧化酶活性；还原黑色素形成过程各中间体，或与之结合以阻断黑色 素形成。阻断二羟基吲哚( d h i ) 聚合为黑色素。 ( 3 ) 抑制黑色素颗粒转移至角朊细胞。 ( 4 ) 加速角朊细胞中黑色素向角质层转移；软化角质层和加速角质层脱落。 ( 5 ) 减少外源性因素如紫外线、氧自由基等对黑色素形成生理过程的负面影响。 现在化妆品美白剂的主要功能是抑制酪氨酸酶活性。但由于黑色素的形成主要是由 黑色素细胞内的四种酶：酪氨酸酶、多巴色素异构酶( t r p 2 ) j 过氧化酶、5 ，6 二羟基吲 哚一2 羧酸且i d h i c a 氧化酶( t p p 1 ) 等酶单独或协同作用的结果。所以有研究者认为应利 用协同与综合效应原理研制复合化妆品美白剂 1 0 - l l 】。 2 2 化妆品美白剂的美白祛斑功效评价方法1 1 2 - 1 3 1 美白祛斑功效评价方法可分为生物化学法、细胞生物学法、动物实验法和人体试验 法等，前两种方法主要用于美白活性添加剂的体外快速筛选，而美白化妆品的功效评价 则主要采用后两种方法。 2 2 1 生物化学法 生物化学方法常以l 酪氨酸或l 多巴为底物，通过试管试验检测美白祛斑成分对酪 氨酸酶活性的抑制作用。此种方法测定时间短、操作简便、所需费用低，适用于对美白 祛斑剂进行大面积的初步筛选。 从国外文献来看，评价美白化妆品的功效主要以检测添加化妆品美白成分后，是否 抑制酪氨酸酶活性为主要手段，而酪氨酸酶活性检测方法有放射性同位素法、免疫学法 和生化酶法，其中以生化酶法较为简单成熟。酶的材料来源可以从蘑菇中得到的酪氨酸 酶，也可以从b 1 6 黑色瘤细胞或动物皮肤中得到。 2 2 2 细胞生物学法 细胞生物学法是利用细胞培养技术，体外测定美白祛斑添加剂对黑色素细胞内酪氨 酸酶活性及黑色素生成的影响。该方法对细胞数量、环境温度、测定时间等因素要求高， 操作步骤比较复杂【1 4 1 。b 。1 6 黑色素瘤细胞株的基本结构，特别是黑色素合成功能与人正 常的黑色素细胞基本一致，在人体原代皮肤黑色素细胞培养非常困难的情况下，国外化 妆品生产企业的科研部门在筛选美白剂的过程中，广泛采用该细胞株作为美白祛斑添加 剂功效测定的受试细胞【l 引。 2 2 3 动物实验法 用棕色或黑色成年豚鼠1 0 只，均于背部二侧剃毛成若干1 c m x 2 c m 大小的去毛区。用 棉棒将化妆品依次涂布一圈，每同2 次，并设空白对照。2 8 d 后取豚鼠皮肤活组织进行检查， 固定、包埋和切片，对基底细胞中含黑色素颗粒细胞计数及多巴阳性细胞计数，与空白 区进行对照比较。该方法采用黄棕色豚鼠，其皮肤黑素细胞和黑素小体的分布近似于人 类，试验结果重复性。 2 2 4 人体实验法 人类的肤色有白色、黄色、黑色、棕色等不同种类。对于皮肤颜色变化的判定，最 江南大学硕i ：学位论义 初采用目测法【l6 。，但此法受观察者的光感差异、观测时的照明光源影响很大。后来，采 用照相的方法【l ，在照片上分析皮肤灰度值的变化来评价皮肤颜色的变化。但此法受照 相时光线及冲印条件的影响很大，且反映的皮肤颜色变化单一。肤色的变化以简单的黑 自概念不能概全，故以往肤色量化采用的灰度值不适用肤色的判断。近年来，国外普遍 采用国际照明委员会( o e ) 规定的色度系统( l a b 色度系统) 测量皮肤颜色的变化【1 8 】， 认为该法量化比较准确，反映了皮肤颜色空间多维变化，使肤色的量化更可靠。l a b 色 度系统表明了颜色在色空间的位置，并加以量化，使颜色变化可以以数值的形式表达。 通过量化，肉眼不能看见的细微变化也可以反映出来。 除此之外，美白祛斑化妆品的美白功效评价还可采用德国c k 公司生产的皮肤黑色素 测试仪，该仪器测量的是人体皮肤中黑色素和血红素的含量，测量数值越高，说明皮肤 中黑色素和血红素的含量越高。该仪器是基于光谱吸收的原理，通过测定特定波长的光 在人体皮肤上照射后的反射量来确定皮肤中黑色素和血红素的含量。相对于l a b 色度系 统而言，此方法使用更为方便，但测定的数值较单一，不能反映皮肤颜色空间的多维性 变化【1 9 】。 迄今为止，美白祛斑添加剂的体外筛选仍然延续使用过去惯用的检测法，如酪氨酸 酶活性测定、细胞中黑色素含量测定等方法，最常用的仍为生化酶法。 第三节化妆品美白剂的种类和发展 传统的皮肤美白剂，往往采用过氧化氢、氯化氨基汞以及各种酚类衍生物，这些化 合物能使黑色素组织迅速瓦解，达到快速美白之功效。但因其对皮肤的腐蚀性、细胞毒 性和过敏性，使其具有极大的危险性，在许多国家的卫生规范中己禁用【2 0 1 。目前要求的 皮肤美白剂应该符合两个标准：一是对酪氨酸酶活性有较高的抑制率，能显著地减少黑 色素的生成；二是有较高的安全性，对人体皮肤无毒无刺激。熊果苷、维生素c 及其衍 生物等是目前国内外美白化妆品中较常使用的美白成分。一些具有很好美白效果的中草 药目前越来越受到消费者的青睐，如甘草、桑树、芦荟的化学成分等。 3 1 对苯二酚 对苯二酚即氢醌，呈白色针状结晶，是一种传统且有效的美白祛斑成分，它具有凝 结蛋白质的作用，通过凝结酪氨酸酶中的氨基酸，使酶冻结而失去催化活性。另外，氢 醌在一定浓度下可致黑色素细胞变性、死亡。美国f d a 认为对苯二酚为安全、有效的美 白剂1 2 。欧共体批准的使用量为2 。我国1 9 9 9 年1 1 月版的化妆品卫生规范允许其在局 部皮肤美白产品中使用，限用量也为2 ，并要求在产品包装说明上标注“含有氢醌 等字样。c t f a 2 0 0 0 年版的化妆品成分评审概要中明确指出，禁止氢醌用于驻留性化妆 品中。一般认为，2 的氢醌用量对皮肤是安全的，祛斑药品中用量可达3 5 ，超过 5 ，有可能引发“白斑现象，并可致敏。 3 2 曲酸及其衍生物 曲酸的应用及发现，是源于古代民间医疗。曲酸由葡萄糖或蔗糖在曲酶作用下发酵、 提纯而成，其美白机理是抑制酪氨酸酶的活性，同时又能抑制二羟基吲哚酸( d h i c a ) 氧 6 第一章综述 化酶活性，阻断二羟基吲哚( d h i ) 聚合。这是很少的一种能同时抑制多种酶的单一美白 剂，因此是非常值得研究的一类美白剂。长期使用曲酸具有细胞毒作用，并可增加卵巢 细胞染色体互换及染色体畸变的概率。曲酸因口服具有致癌性，故在同本被禁用，外用 曲酸在同本也被暂停进口及生产。曲酸由于对光、热及金属离子不稳定，而且皮肤吸收 性较差，人们开发了大量的曲酸衍生物来改进它的使用性能，如曲酸二棕榈酸盐。曲酸 二棕榈酸盐与曲酸相比，不易变色，不受酸碱度的影响，对皮肤的刺激性较低。 目前认为曲酸衍生物的作用机制与曲酸相同，且其对酪氨酸酶的抑制作用比曲酸强。 曲酸衍生物是从曲酸上的两个羟基入手，一般进行酯化和烷基化。酯化可以形成曲酸的 单酯，也可以形成双酯。 3 3 熊果苷 熊果苷( a r b u t i n ) 是从多种植物中分离得到的天然活性物质，其化学名为4 羟苯基 p d 吡喃葡萄糖苷( 简称p 一熊果苷) 。p 熊果苷去色素作用机制已有报道，它是酪氨酸酶 抑制剂，主要阻断多巴及多巴醌的合成，从而遏制黑色素的生长，因而具有皮肤增白作 用。目前p 熊果苷在化妆品中添加量约为3 ，小于此量对皮肤中酪氨酸酶的催化活性的 抑制作用较弱，增白效果不明显。 仅熊果苷是p 熊果苷的差向异构体，其化学名为4 羟苯基0 【d 一吡喃葡萄糖苷。同本 学者n i s h m u r a 研究发现：( i t 熊果苷抑制酪氨酸酶的强度和安全性大大优于目前正逐渐广 泛使用的p 熊果苷。f u n a y 锄a 等【2 2 】比较0 【熊果苷和b 熊果苷对来自蘑菇和小鼠黑色素瘤 酪氨酸酶活性的影响，结果表明：p 熊果苷抑制来自蘑菇和小鼠黑色素瘤的酪氨酸酶， 0 【熊果苷仅抑制黑色素瘤的酪氨酸酶，其机制推测为混合型抑制，而b 一熊果苷的机制是非 竞争性的。0 【熊果苷抑制强度为p 熊果苷的1 0 倍。 2 0 0 2 年p e u t a h a r m 、日本资生堂先后推出了含有0 t 熊果苷的新型活性皮肤增白剂。研 究发现，0 【熊果苷对紫外线灼伤所形成的瘢痕具有明显的效果，其化学性质也比d 一熊果 苷更稳定，能够更方便地加入到各种美白亮肤化妆品中【2 3 1 。 3 4 维生素c 及其衍生物 维生素c 由生物发酵制备得到，是人们心理上极易接受的美白剂。维生素c 对除去后 天性黑色素沉积有明显效果，并且具有抗氧和清除自由基作用。维生素c 及衍生物，直 接还原黑色素，将黑色素直接破坏瓦解，从而迅速增白。维生素c 的美白机制主要是将 黑素还原而淡化色斑，但因经还原的黑色素仍可能再次氧化，因此必须长期保持足够的 浓度才有效。另外，由于黑色素的生成过程是一种氧化过程，维生素c 可以通过本身的 抗氧化特性，并可抑制过氧化酶作用。维生素c 是水溶性的，不易渗透到皮肤角质层， 且本身易氧化并不稳定，故它的应用受到限制。对维生素c 衍生物的开发主要是在同本， 最常用的有：维生素c 磷酸镁、维生素c 棕榈酸酯等。维生素c 的磷酸酯盐主要有维生素 c 磷酸酯镁和维生素c 磷酸酯钠。维生素c 磷酸酯镁的美白效果较维生素c 磷酸酯钠好， 价格也较后者低，在维生素c 类美白剂市场中占有主导地位。另外一个重要维生素c 的 衍生物是维生素c 2 0 0 【吡哺葡萄糖，它的稳定性很好，易于作配方，但它是发酵法生 产，价格昂贵。 7 江南人学硕。t - q ：位论义 3 5 内皮素拮抗剂 内皮素拮抗剂是2 0 世纪9 0 年代发现的重要皮肤美白剂。它可以从天然植物洋甘菊中 提取，也可以用生物发酵法制备。国外有人从欧洲草本植物洋甘菊中提取内皮素拮抗剂， 经体内及体外实验表明具有以下三方面作用：高效性：在洋甘菊提取物这种内皮素拮 抗剂的作用下，内皮素不能与黑皮素细胞上的受点联结，因此，不会再有额外的黑色素 形成；快速去色素作用：由于酪氨酸酶存在于黑色素细胞的黑色素内，因此酪氨酸酶 抑制剂必须通过4 层( 即角质层、表皮深层、黑色素细胞膜和黑色素膜) 障碍才能起到 抑制作用，由于内皮素拮抗剂的作用点在黑色素细胞膜之外，因此，它仅需通过两层障 碍即可发挥效用，这就是为什么针对紫外线引起的色素沉着的祛除，采用内皮拮抗素要 比酪氨酸酶抑制剂快4 倍的原因；均匀黑色素分布：由于紫外线照射引起细胞外黑色 素的生成，导致皮肤色斑及不均匀色素分布，而使用内皮素拮抗剂后，这一状况会得到 根本改善【2 4 】。 3 6 胎盘素 胎盘素是从人体、牛、羊的胎盘中提取的生物制剂，是高级化妆品用的营养保湿剂， 对加快皮肤新陈代谢的同时对皮肤黑色素新陈代谢亦会加速。市场上不少美白产品都含 有此成分，并辅以诸如维生素e 、维生素c 衍生物等美白活性组分。由于仅有2 0 的人用 胎盘素美白有效，而且一些消费者在使用时害怕受到疯牛病的传染，心存疑虑，所以胎 盘素虽然已改由从猪提取，但一些生产化妆品的国际性大公司，已不再使用胎盘素。 3 7 植物类黄酮 黄酮类化合物广泛存在于植物界，其中许多具有清除皮肤中自由基、促进皮肤新陈 代谢、减少色素沉着、润泽肌肤等作用。在我国，已产业化丌发出许多植物黄酮类提取 物，如银杏提取物、竹叶提取物、甘草黄酮、大豆异黄酮等，一些已应用于化妆品行业 皿引。现已证明，甘草除具有镇痛、镇咳、抗炎、抗溃疡、抗变态反应等作用外，还能增 强机体免疫功能，防治病毒性肝炎、抗癌、抗艾滋病。从甘草中提取的甘草黄酮在美容 化妆品中具有多种功效【2 引。研究表明，甘草黄酮是一种很好的美白成分，其美白作用主 要来自其对酪氨酸酶、对多巴色素互变异构酶( t r p 2 ) 活性的抑制，和对5 ，6 二羟基吲哚 ( d h i ) 聚合的阻断。植物美白皇后甘草提取物，在帮助抗紫外线的同时还抑制酪氨酸酶 的活性，还能改善粗糙、缺水及发炎的皮肤，是功能齐全的一种植物美白成分【2 7 】。 此外，我国传统的中药，许多具有良好的美白祛斑作用，有许多治疗面斑的药方流 传至今。这种绿色植物成份具有优异的美白效果，是这类化妆品今后的发展方向。当归： 活血生机、抗菌消炎、祛水增。爵，含有多种维生素和活性组份，有皮肤增白功效。辛夷： 治面容疾患、痤疮、皮肤瘙瘁等症。化学成份主要为蒎烯、莰烯及葡萄苷等，有抗菌消 炎抗过敏作用。川芎：行气活血、祛风止痛、长肉排脓、消淤血，其化学成份为内酯、 生物碱、挥发油及维生素。具有皮肤抗衰老和增白的作用。丹参：治各种面部皮肤病， 有去淤生新、活血除烦功效，化学成份主要有酮类、醇类及多种氨基酸、维生素和微量 元素等，它可清除自由基，改善血循环，即抗皮肤衰老及美容和增白的功效。此外还有 自附子、自芷茯苓、鲜皮、白芍、自术、菟丝子等均有一定的皮肤增白作用。 8 第一章综述 第四节中药葛根的资源和生物活性 4 1 葛根资源 葛根为豆科植物野葛p u e r a r i al o b a t a ( w i l d ) o h w i 或甘葛藤p u e r a r i at h o m s o n i lb e n t h 的 干燥根，甘葛藤又习称为粉葛。葛属植物全世界约2 0 种，我国共有葛属植物1 1 种，其学 名、资源情况等见表1 1 。野葛是分布最广、产量最高和资源最多的品种。1 1 种葛属植物 除粉葛以人工栽培为主外，其余均以野生为主。中国药典( 1 9 9 0 年版) 收载了野葛和粉葛 两种葛属原植物2 8 1 。 表1 1 国产葛属植物的种类与分布 t a b 1 1r e s o u r c e so fr a d i xp u e r a r i a ei nc h i n a 4 2 葛根的化学成分 葛根的主要组成是：淀粉、纤维素、蛋白质和总黄酮，另外还含有少量的脂肪、果 胶、鞣质和生物碱等。葛根淀粉中具有1 1 种氨基酸，l1 种矿质元素，其中人体必需的微 量元素有f e 、c u 、z n 、m n 、s i 等。葛根总黄酮中含有异黄酮成分，它是葛根的主要活 性成分【2 9 - 3 。 异黄酮类：包括苷和苷元，主要有大豆甙元、大豆甙、葛根素和大豆甙元一4 ，7 二葡 萄糖甙等异黄酮类化合物，结构如下： r 2 0 o 9 o r 3 江南人学硕： ：学位论文 图l 一2 葛根黄酮类化合物的分子结构图 f i g 1 - 2t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fr a d i xp u e r a r i a ef l a v o n e 其中，不同基团所对应的不同物质见图1 2 。 葛根甙类( p u e r a s i d e ) 葛根甙( p u e r a s i d e ) ，认为是二氢查尔酮的衍生物。 芳香类n o h a r a 等【3 2 l 对葛根进一步分离得到两个芳香类化合物，为葛根苷a 、b ( p u e r o s i d e a 、b ) 。 三萜类：k i n j o 等【3 3 】从葛根醇提液过柱后的皂苷部分分离到七个三萜类化合物：槐二 醇、2 1 p 一羟基槐二醇、大豆苷元( a 、b ) 、葛根苷元( a 、b 、c ) 。 其它成分：葛根中还含有氯化胆碱、二氯化乙酰胆碱、长塞因、d 甘露醇、( + ) 乳 酸镁、6 谷甾醇、胡萝卜苷、6 ，7 二甲氧基香豆素、5 甲基海因、胆碱和乙酰胆碱。 4 3 葛根的应用 4 3 1 葛根的药理研究及医学应用 葛根的药用始载于我国汉代神农本草经，列为中品，是常用的传统中药，并且 属于我国卫生部公布的药食资源。葛根具有解肌退热、生津、透疹