（微生物学专业论文）不同表型的酵母工程菌对植酸酶表达的影响.pdf

两南大学硕士学位论文 摘要 两种表型的酵母工程菌对植酸酶表达的影响 微生物学硕士研究生李健 指导教师彭远义教授 摘要 植酸酶是一类催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸的酶，添加f 食品和饲料中，可 以提高磷的吸收利用率，提高食品和饲料的营养价值：减少植酸对微鬣元素的整合消除植 酸所引起的抗营养作用；同时也减少了动物粪便中植酸磷的含鼙，降低了磷对环境的污染， 有利丁二保护环境等。因此，植酸酶的研究与戍用具有重大的理论和现实意义。 目前国内外对植酸酶及其基因进行了大量研究，构建了表型为甲醇利用型和非甲醇利用 型的酵母亡程菌表达植酸酶。本实验室己构建了一株表型为甲醇利用璎的菌株，研究发现， 重组植酸酶的表达晕以及酶学性质与出发菌表达的植酸酶相比具有较大的变化，特别是p h 的 适用范围得到了较大的拓宽。试验通过原生质体法把外源表达载体转化到毕赤酵母中，然后 外源表达载体双交换整合剑毕赤酵母染色体上，获得表犁为非甲醇利用型的酵母一l ：程菌来表 达植酸酶，从而研究两种表型的酵母下程菌对植酸酶表达的影响，为进一步研究影响植酸酶 基冈在毕赤酵母中表达的因素奠定理论基础；也为植酸酶的= 业化生产提供更为优良的菌株 奠定基础。因此试验在实验室前期研究的基础上，做了如卜研究： 1 质粒d n a 的提取及线性化 用质粒少量制备试剂盒提取p p i c 9 k - p h y a 质粒d n a ，用d r ai 酶酶切p p i c 9 k - p h y a 质粒， 电泳检测表明已彻底酶切后，用酚氯仿抽提，无水乙醇进行沉淀同收，并崩1 0 肚t e 溶解， 经紫外分光法检测d n a 浓度达5 0 0 n p l 。 2 毕赤酵母( g s l l s ) 原生质体的制备及转化 用z y m o l y a s e 在高渗缓冲液中处理酵母细胞制备原生质体，在p e g 和c a c h 存在下与外源 d n a 温育，将外源d n a 导入原生质体，再经高渗选择性培养基进行再生培养，在培养2 4 小 时后，平板上出现较多的小菌落，表明利用原生质体转化也可获得较多转化子。 3 转化子的表型筛选和p c r 鉴定 - t - 3 0 c 培养箱内培养原生质体转化的细胞，直至长为人小适中的单菌落，在m m 和m d 平扳 上进行表型筛选。在m d 平扳上生长正常而在m m 平板上生长缓慢的初步鉴定为m u t 5 型。提取 初步鉴定为m u t s 型转化子的总d n a ，用5 a o 引物和3 a o 引物进行p c r 扩增，p c r 产物电 泳出现一条约1 8 k b 掣j 目的带，表明此转化子为m u t 3 礁，共获得2 1 个m u t s 型重组子。 4 m u t s 重组子和m a t * 重组子表达植酸酶的量以及酶学性质比较。 ( 1 ) m a t + 重组子在诱导培养1 6 8 小时之内，植酸酶的表达量随时间的延长而增加，到1 6 8 小时接近高峰，最高酶活达到1 4 3 9 5 8 3 u m l ；m u t s 重组子在诱导培养1 9 2 小时之内植酸酶的 两南大学硕十学伊论文摘要 表达量随时间的延长而增加，到1 9 2 小时接近高峰，最高酶活达剑1 4 1 0 5 8 3 u m l 。两种表型 t 程菌株表达产物的分子母都介于7 0 k d a - - 9 7 k d a 之间。 ( 2 ) 最适p h 研究结果表明，两种重组酵母表达的植酸酶最适作用p h 值都有两个( 3 7 条 件下反应1 小时) ，分别为2 5 3 0 和5 0 - 5 5 ，p h 2 5 与p h 3 0 峰值相当，p h 5 0 与p h 5 5 峰值 相当，在p h 4 5 , - 6 5 之间均有相当高的酶活性，p h 7 0 时酶活性急剧f 降，两种重组酵母表达 的植酸酶适应范嗣都得到显著拓宽：在p h 5 5 、不同温度条件卜的酶活性测定结果表明，两种 重组酵母表达的植酸酶最适作用温度为5 5 左右，二者在5 0 5 5 之间均有较高的酶活性， 说明两种j 二程菌的植酸酶温度适应范围有所提高；耐热性研究的结果表明，两种重组酶耐热 性都比天然植酸酶有所改善。 试验结果表明，两种表型的酵母r = 程菌对植酸酶的表达鼙以及酶学性质无显著影响。 关键词：植酸酶p h y a 基因毕赤酵母m u t 5 重组子m u t + 重组子 l i m a s t e rd i s s e r t a t i o no f s o u t h w e s tu n i v e r s i t y a b s t r a c t e f f e c to np h y t a s ee x p r e s s e db yt w o 够p e e n g i n e e r e dy e a s t s c a n d i d a t e ：l ij i a n s u p e r v i s o r ：p e n gy u a n y i a b s t r a c t p h y t a s ei sac l a s so f p h o s p h a t a s e st h a tc a l lc a t a l y z et h eh y d r o l y s i so f p h y t a t ei n t om y o i n o s i t o l a n dp h o s p h a t e ，w h e na d d e dt of o o da n df e e d ，t h e yc a nd e c r e a s ec h e l a t i o no fm i c r o e l e m e n t sb y p h y t a t e ，r e l i e v ea n t i - n u t r i t i o no fp h y t a t e ，i n c r e a s ea b s o r p t i o na n du t i l i z a t i o no fp h o s p h o r u s ，i m p r o v e n u t r i t i o n a lv a l u eo ff e e da n df o o d ，a n ds i m u l t a n e o u s l ya l l e v i a t ee n v i r o n m e n tp o l l u t i o nc a u s e db y p h o s p h o r u s t h e r e f o r e ，t h es t u d ya n da p p l i c a t i o no fp h y t u s ei 1 1f o o da n df e e dh a sd r a w ne x t e n s i v e a t t e n t i o ni nt h ew o r l d p h y t a s eh a sb e e ns t u d i e de x t e n s i v l yi no t h e rc o u n t r i e s ，h o w e v e r , n a t i v es t u d yo np h y t a s ei s r e l a t i v e l yl i m i t e df o ri t sl a t es e to u t , m o s tr e s e a r c h e r sh a v ec o n s t r u c t e de n g i n e e r e dy e a s ts t r a i n st o e x p r e s sp h y t a s e ，a n dt h e s es t r a i n sa r em o s t l yn o n m e t h a n o lu t i l i z i n gp h e n o t y p e w eh a sc o n s t r u c t e da s t r a i no fm e t h a n o lu t i l i z i n gp h e n o t y p e ，a n df o u n dt h a te n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i c so ft h er e c o m b i n a n t p h y t a s ew ee x p r e s sw i t ht h i ss t r a i ni sd i f f e r e n tf r o mt h a to fw i l dt y p eo rt h a to b t a i n e db yo t h e r r e s e a c h c r s ，e s p e c i a l y , t h ef u n c t i o n a lp hr a n g ei sb r o a d e r t h i ss t u d yc o n c e n t r a t e do nt h ee f f e c t so f t r a n s f o r m a t i o nm e t h o da n di n t e g r a t i o nt y p eo ne n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i co f p h y t a s e ，a n di sab a s i cw o r k f o re x p r e s s i o no fp h y t a s eg e n ei np i c h i ap a s t o r i s b a s e do nt h el a b o r a t o r y sf o r m e rr e s e a r c h ，w e c a r r i e do u tt h ef o l l o w i n gs t u d i e s ： 1 i s o l a t i o na n dl i n e a r i z a t i o no f p l a s m i dd n a p l a s m i dp p i c 9 k - p h y aw a se x t r a c t e dw i t hp l a s m i dm i n ik i t , d i g e s t e dw i t hd r a i v e r i f i e dw i t h e l e c t o p h o r e s i s ，e x t r a c t e dw i t hp h e n o l c h l o r o f o r m , p r e c i p i t a t e dw i t he t h a n o l ，s o l v e di n1 0 止t e ，a n d m e a s u r e du pt o5 0 0 n u lw i t hu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t e r 2 p r e p a r a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o no f p r o t o p l a s t t h ep r o t o p l a s tw e r ep r e p a r e di nh y p c r o s m o t i cb u f f e rw i t hz y m o l y a s e ，i n c u b a t e dw i t hp l a s m i d d n aa tt h ep r e s e n c eo fp e ga n dc a c l 2 ，g r o w no nh y p e r o s m o t i cp l a t e sf o r2 4h o u r s ，a n dl o t so f c o l o n i e sa p p e a r e d ，t h i sr e s u l ti n d i c a t et h a ti ti sa c h i e v a b l et oo b t a i nl o t so ft r a n s f o r m a n t sw i t h p r o t o p l a s tt r a n s f o r m a t i o n 3 p h c n o t y l ma n dp c rs c r e e no f t r a n s f o r m a n t s a f t e rg r o w nt op r o p e rc o l o n ya t3 0 。c ，c o l o n i e sw e r es e l e c t e do nm ma n dm d p l a t e s ，t h es t r a i n s g r o w t hn o r m a l l yo nm dw h i l es l o w l yo nm mp l a t e sw e r ep r i m a r i l yi d e n t i f i e da sm u t s t h et o t a l 1 1 1 m a s t e rd i s s e r t a t i o no f s o u t h w e s tu n i v e r s i t y a b s t r a c t d n aw g t ee x t r a c t e da n da m p l i f i e dw i t hp r i m e r s5 a o x la n d3 a o x i ，a n d2 1s t r a i n sw i t ht a r g e t e d b a n di np c rp r o d u c tw e r ei d e n t i f i e d m u t st r a n s f o r m a n t s 4 c o m p a r a t i o no f e n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i c s ( 1 ) t h ep h y t a s ee x p r e s s i o no fm u t + r e c o m b i a n ti n c r e a s e da n da c h i v e dp e a ka f t e r1 6 8h o u r s i n d u c t i o n ，a n dt h ec o r r e s p o n d i n ge n z y m ea c t i v i t yr e a c h e dp e a kv a l u eo f1 4 3 9 5 8 ，3 u m l ，w h i l et h a t o fm u t 5r e c o m b i n a n ta c h i v e dp e a l 【v a l u ea f t e r1 9 2h o u r s ，a n dt h ee n z y m ea c t i v i t yr e a c h e dp c a k v a l u eo f1 4 1 0 5 8 3 u m l s d s p a g es h o w st h a tt h em o l e c u l a rw e i g h t so fb o t hp r o d u c t sw e r e a m o n g7 0 k d aa n d9 7 k d a ( 2 ) m e a s u r e m e n to fo p t i m u mp hs h o w st h a tb o t l lp h y t a s e sh a v et w oo p t i m u mp h s ， r e s p e c t i v e l y2 5 - 3 0a n d5 0 5 5 ，m cp e a l 【v a l u ea tp h 2 5i se q u a lt ot h a ta t3 0 ，w h i l et h ep e a kv a l u e a tp h 5 0i se q u a lt ot h a ta t5 5 ，b o t ha c t i v i t i e so ft h et w op h y t a s e sw e r eh i g hw i t h i nt h ep hr a n g eo f p h 4 5 6 5a n dd e c r e a s e dd r a m a t i c a l l ya tp h 7 0 ，a n dt h ef u n c t i o n a lp hr a n g e so ft h et w op h y t a s e s w e r eb o t hb r o a d e ds i g n t f i e a n t l y a c t i v i t ym e a s u r e m e n ta tp h 5 5a n dd i f f e r e n tt e m p e r a t u r es h o w s t h a tt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e so ft h et w op h y t a s e sw e r eb o t ha r o u d5 5 c ，a n db o t hd i s p l a y e dh i g h a c t i v i t yw i t h i nt h et e m p e r a t u r er a n g eo f 5 0 c - 5 5 c ，i n d i c a t et h a tb o t ho f t h ef u n c t i o n a lt e m p e r a t u r e r a n g e sw e r eb r o a d e d m e a s u r e m e n to ft h e r m o t o l e r a n c es h o w st h a tt h e t h e r m o t o l e r a n c eo fb o t h p h y t a s ew e r eh i g h c rt h a nt h a to f w i l dt y p e t o g e t h e r l y , t h ep h y n o t y p e o fe n g i n e e r e dy e a s th a sn os i g n i f i c a n te f f e c to ne n z y m a t i c c h a r a c t e r i s t i co f t h ep h y t a s ei te x p r e s s e d k e yw o r d s ：p h y t a s e p h y ag e n e ，p i c h i a p a s t o r i s ，m u t 5 r e c o m b i n a n t ， m u t + r e c o m b i n a n t 独创性声明 学位论文题目：不同表型的酵母工程菌对植酸酶表达的影响 声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 ， 学位论文作者：茜陡7 签字日期： 7 年岁月2 2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：毒健 签字日期：加力 年夕月2 - 2 ，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期：月冶日 邮编： 两南大学硕十学何论文第一章文献综述 第一章、文献综述 1 1 植酸酶及分子生物学研究进展 1 1 1 植酸简介 植酸，又名人磷酸肌醇，是一种强酸性的黄色液体，是植物体内磷的主要储存方式， 占植物中总磷的6 0 8 0 ，在种子和果实中含革较多，其含链商达l 3 。在中性p h 条 件下，植酸分子的磷酸基团上至少有一个或两个负氧离子，它可以通过阳离子将两个磷酸基 团络合起来形成螯合物，这些螯合物不易分解，因而植酸分子上的磷和金属阳离子不易被动 物所利用，而且它也是一种重要的抗营养因子( n a g a s h i m a t ，1 9 9 9 ) ，它可以降低植酸磷的 利用率1 2 1 ( 于炎湖，1 9 9 9 ) ，降低矿物元素纠( 黄遵锡等，。1 9 9 9 ) 和蛋白质的利用率，抑制消 化酶的活性。因单胃动物体内缺乏植酸酶，所以很难利用植酸磷，其利用率不剑4 0 ，造成 许多问题：首先，饲料中的磷源不能得剑有效利用，造成磷资源的巨人浪费。其次，饲料中 8 5 左右的植酸磷会被动物以粪便形式直接排出体外，造成环境中的磷污染。 1 1 2 植酸酶的酶学性质 植酸酶( p h y t a s e ，e c3 1 3 8 ) 是催化植酸( 或植酸盐) 水解成肌醇与磷酸( 或磷酸盐) 的一类 酶总称。植酸酶是一种塘蛋白，现在已知的植酸酶有3 种类氆：3 植酸酶( e c 3 1 3 8 ) 、6 - 植酸 酶( e c 3 1 3 2 6 ) 和非特征性的正磷酸单酯磷酸水解酶( e c 3 1 3 2 ) 【4 】( 王红一2 0 0 0 ) 。植酸 酶冈来源不同，它们的氨基酸组成、分子晕、糖基化程度、k m 值、最适p h 值、等电点、底物 专一性、热稳定性等有一定差异【5 】( r o d r i g u e ze ，2 0 0 0 ) 。一般曲霉植酸酶分子质鼙较大，细 菌植酸酶分子质鹫较小；真菌植酸酶的最适p h 值为2 5 6 0 ，细菌的为4 o 7 5 。总体 看来，当p h 值在3 o 7 5 时，植酸酶的稳定性较高，超出这个范嗣植酸酶的稳定性就会降 低。另外，植酸酶在5 0 7 0 的温度范围内表现出高活性，且最适温度大都在4 5 6 0 c 之间。 目前研究最多的是微生物来源的植酸酶，表达植酸酶的微生物有细菌、霉菌、酵母菌等。细 菌中的枯草杆菌( b a c i l l u s s u b a l i s ) 可以产生胞外植酸酶【6 1 ( k e r o v u oj ，1 9 9 8 ) ，但产鼙较低， 最适p h 为弱碱性，难以用作饲料添加剂。自然界中植酸酶产量最高的微生物是真菌，具有p h 范围广、活性高、耐热性强等优点，是生产商品植酸酶的主要米源。目前，在提高植酸酶热 稳定性方面的研究已取得一定进展。p a s a m o n t e s l i t l 等( 1 9 9 7 ) 将来自a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s 的 植酸酶p h y a 基因导x a s p e r g i l l u s 岫弘r 中，表达出了热稳定的植酸酶，该酶往1 0 0 处理2 0 分 钟仍保持9 0 的活性。b e r k a 【8 1 等( 1 9 9 8 ) 将来源于豫p m o e 目l a n u g i n o s u s 的p h y a 基冈转入 f u s a r i u mv e n e n a l u m 中，表达出了最适温度为7 5 的植酸酶。 1 1 3 植酸酶的来源及研究应用 植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中。不同来源的植酸酶可分为两大类：3 植酸酶 ( e c 3 1 3 8 ) 和6 一植酸酶饵c 3 1 2 6 ) 。植物来源的植酸酶均为6 一植酸酶，不适合在单胃动物酸 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 性的胃中起作用，而且在植物中含量极低。目前，唯一报道的植物来源的植酸酶是m a u g e n s e t 等从萌发的玉米种子中分离的。研究最多的是微生物来源的3 植酸酶。s h i e h 等发现所用的2 2 株黑曲霉菌中有2 1 株能产生植酸酶。从此以后，陆续从十几种微生物中分离剑植酸酶，如枯 草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母、曲霉、隔孢伏革菌等。植酸酶主要存在于微生物， 植物和动物中含量极少。所以，植酸酶的开发主要来自丁- 微生物。植酸酶是一类催化植酸及 植酸盐水解成肌醇和无机磷酸的酶，添加f 食品和饲料中，可以提高磷的吸收利川率，减少 植酸对微晕元素的螯合，消除植酸所引起的抗营养作用提高食品和饲料的营养价值，保护 环境。冈此，植酸酶的研究己成为酶制剂研究的热点之一。早在上个世纪7 0 年代，植酸酶就 吸引了人们的注意力，但由于成本很高而并没有得到，“泛应用。直到9 0 年代，美国、芬兰、 德国，荷兰等国家先后开发出商用植酸酶之后。植酸酶才开始被添加到饲料中去。此后，随 着生产成本进一步降低，植酸酶在饲料中的应川也日益推广。我国市场上的植酸酶大部分要 依靠进口，价格昂贵，限制了植酸酶在我国饲料行业中的广泛虑_ l j 。随着人们对绿色饲料和 环境保护的日益重视，以及我国加入w t o 的要求，在饲料中用植酸酶代替磷酸氢钙已成为必 然的发展趋势，因此我国也在9 0 年代后期开始了植酸酶产品的开发研究，最初是通过诱变筛 选植酸酶高产菌株来生产植酸酶。但由于其天然菌株产植酸酶酶鼙低，直接_ l j 其生产出的植 酸酶成本较高。另一方面，天然植酸酶的抗逆性，尤其是热稳定性不能完全满足饲料及饲料 加工的要求。通过基因工程构建植酸酶 程菌提高植酸酶的产量，降低生产及麻用成本，已 成为植酸酶研究的热点唧。 1 1 4 植酸酶基因 1 1 4 i23 - 植酸酶基因 近年来对编码3 植酸酶( e c 3 1 3 8 ) 的基因的研究取得了一系列的进展，目前已分 离、鉴定并克隆了多个来自真菌的3 一植酸酶基冈，它们普遍具有以下特点：存在一个开放阅 读框( o r f ) ，长度1 4 k b 1 5 k b 不等，两个外显子被一个公认的真菌内含子隔开 ( h a r t i n g e r s v e l d tw , 1 9 9 3 ) 内含子的长度从4 8 b p 1 l l b p 不等，但所有的内含子均含有相同的特 征保守序列：供体序列( d o n o r ) - - g t r n g c ：索套序列( l a r i a t ) - - r c t r a c ：受体序歹u ( a c c e p t o r ) 一y a g 。u l l a ha h t l 2 等( 2 0 0 3 ) 通过对来自a f i c u u m 及p e n i o p h o r a 咖甜的p h y a 基因产物性 质的研究得出结论：虽然都是p h y a 基因，但表达产物也会因来源不同而表现山较人的性质差 异。e h r l i c h k c 等( 1 9 9 3 ) 从a s p e r g i l l u s n i g e r ( f u m i g a t u s ) 中分离出p h y b 基因与p h y a 基 因有较大差异，它全长1 6 0 5 b p ，编码4 7 9 个氨基酸，包含有4 个外显子，与来自a s p e r g i l l u sn i g e r 的p h y a 基因虽只有2 5 的同源性，但也属丁二组氩酸酸性磷酸酶家族，也有组氮酸酸性磷酸酶 的活性保守区r h g x r x p ( x 为任意氨基酸) 。 1 1 4 2l 6 植酸酶基因 l a s s e ns f t “肄( 2 0 0 1 ) 从4 株担子菌中克隆出了5 个新的6 植酸酶基冈，并在米曲霉 2 西南大学硕十学伊论文 第一章文献综述 ( a s p e r g i l l u s o r y z a e ) 中表达了这些基因。m a u g e n e s t l ”l 等( 1 9 9 7 ) 首次分离了玉米的植酸酶基 因p h y s l l ，它全欧1 3 3 5 b p ，包含了一个编码3 8 7 个氨基酸的开放阅读框，该酶的氨基酸序列 与黑曲霉植酸酶差别较大，但有3 3 个氨基酸的同源区，该区包含了组氨酸酸性磷酸酶的活性 保守区r m g x r x p ( x 为任意氨基酸) ，它铍认为是磷酸酯的接受位点。 1 1 4 3 酸性磷酸酶，植酸酶基因 1 9 8 5 年d a s s a i ”1 等通过对不同大肠杆菌突变株的研究并根据其它佐证，推断新发现的 a p p a 基因是编码酸性磷酸酶( 最适p h 值2 5 ) 的结构基因。d a s s aj a n i e i ”1 等( 1 9 9 0 ) 首次对 米自大肠杆菌的a p p a 基因进行了测序( g e n e b a n ka c c e s s i o nn o m 5 8 0 7 8 ) ，发现a p p a 基因全 长1 , 2 9 8 b p ，有一个较大的o r f ，与葡萄糖一1 磷酸酶有较大的同源性，a p p a 基因的起始密码 子a t g 的上游有一个类似fs d 的序列- - a a g c c g g ；终e 密码子t a a 的下游不远处有一个 与a p p a 基因反向的不依赖r h o 因子的终止序列。1 9 9 8 年k e r o v u o 【l ”等首次从b a c i l l u s s u b t i l i s 中分离出完整的植酸酶基因p h y c ( g e n e b a n k a c c e s s i o n n o a f 0 2 9 0 5 3 ) ，全长1 ，1 5 2 b p ，编码3 8 3 个氨基酸其中n 端的2 6 个氨基酸是信号肽。随着生物学的不断发展，新的生物资源不断的 被开发，相信必将会发现更多新的植酸酶基因。r o d r i g u e ze i 等( 1 9 9 9 ) 从猪结肠大肠杆菌 中克隆出酸性磷酸酶植酸酶基冈a p p a 2 ，全长1 , 4 8 2 b p ，并在pp a s t o r i s 中成功表达了编码区 的1 , 2 4 1 b p 的结构基因。o o l o v a n s ( 2 0 1 等( 2 0 0 0 ) 等在犬肠杆菌中成功表达了a p p a 基冈，并真 实了a p p a 基因实际上编码一种双功能酶，既表现出植酸酶活性，有表现出酸性磷酸酶活性。 此外，最近还发现了来源于细菌的另类植酸酶，编码基因较短，编码蛋白的分子母也较小， 且与已经报道的植酸酶及己知的磷酸酶无同源性，也无己知植酸酶基因上的活性位点保守序 列。 1 1 5 植酸酶的分子结构 1 1 5 1 植酸酶分子结构与空问构象 h a r t i n g e r s v e l d t l 2 1 1 等利用基因t 程技术将无花果曲霉似f i c u u m ) 植酸酶的基因进行测序， 从其d n a 碱基推断出氦基酸序列，首次将植酸酶一级结构完整列出。u l l a h 2 2 1 等( 1 9 9 3 ) 用 内切蛋白酶g l u - c 、溴化氰、梭菌蛋白酶等五种方法断裂无花果曲霉植酸酶，从多肽的重叠区 推断出植酸酶的氨基酸组成及其二级结构。在氨基酸组成中，是由3 7 的非极性的氨基酸、 4 2 的极性氨基酸、1 1 5 的酸性氮基酸及9 5 的碱性氮基酸组成，推断出的二级结构包括 1 7 3 的a 螺旋、2 9 1 的b - 折叠、3 2 6 的转角及2 4 7 线圈。由丁二大部分植酸酶属丁酸性 磷酸酶家族，所以其空间结构与酸性磷酸酶有很大的相似性，基本上都有两个结构域组成。 k o s t r e w a t 2 3 i 等( 1 9 9 7 ) 利用2 ，5 a 分辨率x 射线对无花果曲霉植酸酶的晶体结构进行了研究， 结果表明无花果曲霉植酸酶的结构是由一个较大的、b 结构域和一个小的a 结构域组成的， 、1 3 结构域是由5 个a 螺旋和8 个b 一折叠构成，a 结构域是由4 个m 螺旋组成。1 9 9 8 年j i a 【“l 等用2 2 a 分辨率的x 一射线对大肠杆菌幔c d 矗) 植酸酶晶体结构进行了分析，该酶晶体的空间群 3 两南大学硕+ 学何论文 第一章文献综述 属于p 2 1 型，单位分子的尺寸为a = 7 4 9a ，i ) = 7 2 2a c = 8 2 4 a ， 3 = 9 2 0 0 。 1 1 5 2 植酸酶的活性部位 在植酸酶的空间构象中，都有一个结合底物的口袋。一般都是活性部位的些保守氮 基酸形成的口袋。植酸酶的活性部位包括两个功能部位，一是位于n 端的“r h g x r x p ”元件 的结合部位，另一个是位于c 端的“h d ”元件的催化部位。在1 9 9 3 年u l l a h 2 5 1 等用1 , 2 环己 二二酮修饰无花果曲霉植酸酶的精氨酸后，植酸酶完全失活，说明有精氦酸位丁该酶的活性中 心把含精氨酸的植酸酶片段与已报道的各种来源的酸性磷酸酶进行序列比较，发现有一段 同源序列s r h g a r y p ，该片段是酸性磷酸酶的活性中心。1 9 9 3 年u l l a h 2 ”等用溴化氰等断裂 来自无花果曲霉最适p h 为2 5 的酸性磷酸酶确定了与真菌植酸酶活性部位同源的2 3 个氨基 酸残基，这一段中第l l r ，1 2 h 。1 3 g ，1 5 r 。1 7 p 是高度保守的，其中第1 l 、1 5 位的氨基酸 涉及到底物磷酸基团与酶活性中心的最初排列，第1 2 位组氨酸与底物形成磷酸h i s “e s ”复 合物，第1 3 位甘氨酸的作用还不清楚，但由于它高度保守，可能在结构上起重要作坩。第2 、 4 ，5 和2 0 位的氨基酸残基是亲水性的，第8 、1 6 、2 2 位的氨基酸残基是疏水性的，这些残基 构成了酶的催化环境。实验表明，c a 2 + 对维持b a c i l l u s 植酸酶活性和稳定性都起很重要的作用， s h i n 2 6 1 等在2 0 0 1 年发现b a m y l o l i q u e f a l e n s 植酸酶的活性部位不仅有4 个c a 2 “而且还有两个 不同的磷酸根离子( p h o l 和p h 0 2 ) 结合位点，一个是“切割位点( p h o l 位点) ”负责对底物 的水解；另一个是“亲和位点( p h 0 2 位点) ”，可提高底物对酶的亲和性。该酶的4 个c a 2 + 与结合在p h o l 位点的磷酸根离子发生螫合，在亲和位点的l y s 7 6 、a r 9 1 2 2 、t y r l 5 9 、l y s l 7 9 残基侧链与结合在p h 0 2 位点的磷酸根离子发生相互作用。 i 1 5 3 植酸酶作用底物的机制 当植酸酶的活性部位与底物的磷酸群体接触时，活性中心的r h g x r x p 中的两个精氨 酸与底物的磷酸基团相互作用，形成了酶底物的复合物，r h g 中组氨酸的咪唑基对磷酸基团 的磷原子发生亲核攻击，同时，c 端“h d ”元件中的天冬氨酸为底物离去基团提供一个质子， 使底物以醇或酚的形式离去，磷酸基团从底物上脱离，与r h g 中组氨酸形成磷酸一组氨酸复 合物，环境水分子中的氧原子对磷原子再次进行亲核攻击，活性中心某一推断的残基b 为组 氨酸的咪唑环提供质子，使磷酸集团离开植酸酶分子，r h g 中组氩酸恢复原来的状态，进行 下一个磷酸的水解。 1 1 5 4 植酸酶降解植酸的途径 植酸酶对植酸的降解途径有多种，b a r r i c n t o s 2 7 1 等在研究被钙激活的来自百合花粉( 1 i l y p o l l e n ) 碱性植酸酶时，运用核磁共振技术证明该酶从第5 位o p 键上开始水解植酸，最终产物为 肌醇1 ，2 ，3 一三磷酸，不能彻底水解成肌醇。在2 0 0 0 年，g r e i n e r i ”1 等阐明了e c o l i 以植酸酶p 2 降解植酸是一种具有立体专一性、有序的过程：经过d + 肌醇1 ，2 ，3 ，4 ，5 - 五磷酸，d 一肌醇 2 ，3 ，4 ，5 - 四磷酸，d 肌醇2 ，4 ，5 - 三磷酸，肌酵2 ，5 二磷酸，最终产物为肌醇2 一磷酸。 k e r o v u o e 2 9 z 等( 1 9 9 8 ) 通过高效液相色谱( h p l c ) 研究口s u b t i l i s 植酸酶对植酸的降解时，推断 4 两南大学硕十学位论文第一章文献综述 出两条途径，一条为：先降解第l 或3 位磷酸，经过肌醇2 。4 ，5 ，6 - 四磷酸，再水解第5 位磷 酸，形成肌醇2 ，4 ，6 一三磷酸终产物；另一条为：先水解肌醇的第4 或第6 位磷酸，形成肌醇 1 。2 。3 ，5 一四磷酸，再水解第2 位磷酸，其终产物为肌醇一1 ，3 ，5 - 三磷酸。 1 1 6 植酸酶基因工程 植酸酶作为一种新犁饲料添加剂，无论在动物生产还是环境保护中都有重要的应用价 值，然而植酸酶在天然材料中表达水平低，加上天然植酸酶的某些性质( 如热稳定性，抗蛋 白酶性等) 不能完全适合饲料加工的要求。饲用植酸酶戍具备热稳定性、抗蛋白酶特性、广 泛的底物特异性及在动物胃肠p h 条件下的高酶活性等，随着生物技术的b 速发展，采用基因 工程手段，使酶的高产优质成为可能，这也上e 是植酸酶研究的热点。 1 1 6 1 植酸酶基因在植物中表达 p e nj 等人通过烟草的p i 卜一s 蛋白信号肽，在花椰菜花叶病毒( c a u l i f l o w e r m o s a i cv i r u s ) 3 5 s 启动子的转录控制f ，在烟草种子中表达了黑曲霉来源的植酸酶基因( p h y a ) ，生产出热稳定性 好、方便储存的植酸酶，可应用丁二动物饲料当中。v e r w o e r d t c t 3 0 l 等( 1 9 9 5 ) 将爿n t g e r 的植酸 酶c d n a 连同烟草p r - s 蛋白的信号肽在c a m v 的3 5 s 启动子控制f ，转移到烟草中，表达出一 个分子量约为7 0 k d a 的有生物学活性的蛋白质。r i c h a r d s o n a e 等人在黑曲霉的植酸酶基因前设 置了胡萝h 伸展蛋白基因的信号肽序列，并将其导人拟南芬，使拟南芥根中表达的植酸酶总 活力提高了2 0 倍，促进了拟南芥对土壤中植酸的利用。h e g e m a n ce 等人从l e 在萌发的大豆籽 叶中纯化了一种植酸酶，并根据多肽序列设计引物，克隆了该基冈，将其导人大豆组织后， 细胞中植酸酶的活性增强。u l l a h a h 3 t l 等( 2 0 0 2 ) 将来自a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s 的植酸f f g p h y a 基 因转入苜蓿，在苜蓿叶子中表达了稳定的植酸酶。 。 1 1 6 2 植酸酶基因在动物中的表达 g o l o v a n | ”1 等人在小鼠的唾液腺中表达了丈肠杆菌的植酸酶基因a p p a ，发现在唾液中含有 糖基化的蛋白。唾液腺中植酸酶的表达导致粪便中磷的降低，这表明它提供了种减少动物 饲料中磷的添加以及备牧中磷污染的途经。同年，g o l o v a n ”1 等义将植酸酶基因导入猪的唾液 腺，猪唾液腺分泌的植酸酶能够降解日粮中的植酸磷，因而减少了猪日粮中磷的添加量，最 终使猪粪便中磷的排出量与对照相比减少了7 5 ，这为控制养猪业磷污染提供了科学依据。 1 1 6 3 植酸酶基因在微生物中表达 1 1 6 3 1 在原核微生物中表达 姚斌p 4 肄( 2 0 0 1 ) 将通过p c r 的方法从芽孢杆菌基因组中克隆了中性植酸酶基因n p h y ， 去除信号肽编码序列，克隆到大肠杆菌i p t g 诱导表达载体p t y b 4 0 上，在大肠杆菌中得到了高 效表达，表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的4 0 以上，表达产物具有酶的生物活性。李弘剑 1 3 5 1 等( 2 0 0 1 ) 将来源于a n i g e r 的植酸酶基因导入大肠杆菌j m 1 0 9 中，并用i p t g 进行诱导表达， 表达出了分子量为5 2 1 0 4 的非糖基化胞内蛋白，虽具有降解植酸的能力，但植酸酶活性很低 5 西南大学硕十学忙论文 。 第一章文献综述 k e r o v u o 3 6 1 等( 1 9 9 8 ) 将且s u b 打l i sy 丌e - 6 8 0 1 3 的植酸酶基n p h y c ，克隆剑表达载体p q e 7 0 中， 表达了与天然植酸酶分子茸相同，但没有活性的蛋白质同样将p 砂c 基冈连同自身的信号肽 序列，克隆剑表达载体p q e 一7 0 中，表达产物仍无活性且不能分泌剑宿主外周质空间，而将p 砂c 基因连接在果胶裂解酶的信号序列之后，克隆剑表达载体中，表达产物与天然酶相同。1 9 9 7 年p h y i l i i p p y 等将一n i g e r 的植酸酶p 蜘基因克隆到大肠杆菌中，表达出了一个没有活性的胞内 蛋白，该蛋白质没有彼糖基化。在体外溶解和重折替后其活性只有天然植酸酶活性的1 。 1 1 6 3 2 在真核微生物中表达 l a s s e ns f 【37 】等( 2 0 0 1 ) 将来自四株担子菌p e n i o p h o r at y c i i , a g r o c y