（植物学专业论文）机械化学法在植物有效成分提取中的应用.pdf

机械化学法在植物有效成分提取中的应用 摘要 天然植物中含有丰富的活性物质 被广泛用于药品 保健品和化妆品中 我国拥有丰富的中药资源 但中药提取物的国际市场占有率还不足5 目前 我国中药提取物生产多采用乙醇 甲醇 丙酮等传统有机溶剂加热 回流提取 效率低 成本高 工艺复杂 难以提高商业价值 而且 多数有机溶剂具有毒 性 污染环境 且易燃易爆 存在生产安全隐患 因此 如何实现药材的高效 利用 开发绿色环保 低成本 技术成熟度高的提取技术无疑是一个亟待解决 的问题 本研究采用机械化学法 以水作溶剂提取穿心莲内酯和银杏叶总黄酮 首 先 筛选和确定了机械化学辅助提取的最佳助剂 其次 初步考察目标提取物 与助剂间的作用情况并比较不同预处理方法对目标提取物的形态及提取率的影 响 最后 在单因素试验基础上 通过正交试验优化提取工艺并与热回流提取 比较 结果表明 经固态研磨后 穿心莲内酯及芦丁可能分别与最佳助剂n a 2 c 0 3 n a 2 c 0 3 n a 2 8 4 0 7 反应成盐 芦丁可能与羟丙基 b 环糊精 h p b c d 形成复合 物 以水作溶剂 机械化学法的提取率显著高于物理混合及超微粉碎辅助提取 物料的粒度及扫描电镜分析表明经机械化学处理后穿心莲及银杏叶的大部分细 胞可能被充分破碎 机械化学辅助提取穿心莲内酯的最佳工艺为 n a 2 c 0 3 用量3 w w 研磨 时间为4 5 r a i n 水 乙醇浓度0 v v 作溶剂 料液比为1 6 0g m l 此时穿心 莲内酯提取率为1 5 9 比粗粉蒸馏提取率提高2 5 2 机械化学辅助提取银杏叶中总黄酮的最佳工艺为 1 碱作助剂 n a 2 c 0 3 n a 2 8 4 0 7 用量9 w w 研磨时间3 5 m i n 物料粒度d 9 5 3 和m 乙醇浓度为 2 0 m 料液比为1 5 0g m l 以水替换乙醇 其提取率与乙醇提取相当 2 h p b c d 作助剂 用水提取 h p b c d 用量1 8 w w 循环水温度6 0 c 研 磨时间2 5 m i n 最佳工艺条件下与热回流提取比较 以n a 2 c 0 3 n a 2 8 4 0 7 及 h i 1 3 c d 作助剂的机械化学辅助提取 总黄酮提取率分别提高1 5 4 9 和 1 8 9 0 以水作溶剂 室温下提取 大大缩短了提取时间 关键词 机械化学辅助提取 穿心莲内酯 银杏总黄酮 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 a b s t r a c t n a t u r a lp l a n tc o n t a i n sad i v e r s eg r o u po fb i o a c t i v es u b s t a n c e sw i t hab r o a d r a n g eo fa p p l i c a t i o n si nm e d i c i n e h e a l t h c a r ep r o d u c ta n dc o s m e t i c c h i n ai sr i c hi n m e d i c a lh e r br e s o u r c e s b u th a saw e a km a r k e ts h a r e 1 e s st h a n5 f o rp l a n te x t r a c t i nt h ew o r l dm a r k e t a tp r e s e n t h e a to rh e a tr e f l u xe x t r a c t i o nw i t hc o n v e n t i o n a l o r g a n i cs o l v e n t ss u c ha se t h a n o l m e t h a n o la n da c e t o n ei sw i d e l yu s e di n t h e i n d u s t r i a l s c a l ep r o d u c t i o no fh e r be x t r a c t si nc h i n a t h i sm e t h o dw i t hl i m i t a t i o n s s u c ha s h i g h c o s ta n dc o m p l e xp r o c e d u r e s r e q u i r e d h a sg r e a t l yd e c r e a s e dt h e p r o d u c t i o ne f f i c i e n c ya n dp r o f i t s m o r e o v e r t h er e q u i r e m e n t sf o rh a z a r d o u so r g a n i c s o l v e n t sw h i c hi si n f l a m m a b l e e x p l o s i v ec o u l da l s oi n c r e a s et h ep r o b a b i l i t yo fs a f e t y r i s k si n p r o d u c t i o na n de n v i r o n m e n t a lc o n t a m i n a t i o n t h e r e f o r e e n v i r o n m e n t a l f r i e n d l ya n di n d u s t r y r e a d yt e c h n i q u ew i t hl o wc o s ta n de n h a n c e de f f i c i e n c yi s r e q u i r e di no r d e rt oa c c e l e r a t et h ed e v e l o p m e n to f h e r be x t r a c ti n d u s t r yi nc h i n a t h ep r e s e n ts t u d yw a sf o c u s e do nt h em e c h a n o c h e m i c a la s s i s t e de x t r a c t i o n m c a e o fa n d r o g r a p h o l i d ea n dt o t a lf l a v o n ef r o mg i n k g ob i l o b a lw i t hw a t e ra s s o l v e n t f i r s t t h ec h e m i c a lr e a g e n tw a ss e l e c t e da c c o r d i n gt ot h ey i e l do ft a r g e t c o m p o u n d sb ym c a e s e c o n d ap r e l i m i n a r yi n v e s t i g a t i o nw a sc o n d u c t e do nt h e i n t e r a c t i o no ft h et a r g e tc o m p o u n d c h e m i c a lr e a g e n t d i f f e r e n tp r e t r e a t m e n tw a s c o m p a r e dw i t hr e s p e c tt ot h e i re f f e c t so nt h ep l a n tm a t e r i a lm o r p h o l o g ya sw e l la st h e t a r g e tc o m p o u n dy i e l d f i n a l l y t h em c a ep r o c e s sw a so p t i m i z e db a s e do nb o t h o r t h o g o n a la n do n e f a c t o re x p e r i m e n t a n dw a sc o m p a r e dw i t hc o n v e n t i o n a lh e a t r e f l u xe x t r a c t i o n p r e l i m i n a r yi n v e s t i g a t i o ns h o w e dt h a ta n d r o g r a p h o l i d ea n dl u t i nc o u l dp o s s i b l y b en e u t r a l i z e db yn a 2 c o s n a 2 c 0 3 n a 2 8 4 0 7r e s p e c t i v e l y a n dc e r t a i nc o m p l e x e s m a yh a v eb e e nf o r m e db e t w e e nl u t i na n dh y d r o x y p r o p y l b c y c l o d e x t r i n h p b c d a f t e rt h es o l i dg r i n d i n gp r o c e s s t h ey i e l do fm c a et r e a t e ds a m p l e s e x t r a c t i n gw i t h w a t e r w a ss i g n i f i c a n t l yi m p r o v e d p o 0 s c o m p a r i n gw i t hp h y s i c a lm i x i n ga n d s u p e r f i n eg r i n d i n gs a m p l e s b o t hp a r t i c l ea n a l y s i s a n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o g r a p h ss u g g e s t e dt h a tt h ep l a n tc e l lw a l lc o u l db cb r o k e nu pa f t e rt h e m e c h a n o c h e m c a lt r e a t m e n t t h eo p t i m u mp a r a m e t e r sf o rm c a eo fa n d r o g r a p h o l i d ew e r ea sf o l l o w s 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 n a 2 c 0 3c o n t e n t 3 w w m i l l i n gp e r i o d 4 5 r a i n e x t r a c t i o ns o l v e n t w a t e r o v 旭 a q u e o u se t h a n 0 1 l i q u i d s o l i dr a t i o l 6 0 9 m 1 n ew a t e re x t r a c t i o ny i e l db ym t i sh i g h e r t h a nt h a to fh e a tr e f l u xe x t r a c t i o nf r o mc r u d ep o w d e r b y2 5 2 t h eo p t i m u mp a r a m e t e r sf o rm c a eo ft o t a lf l a v o n ef r o mg i n k g ob i l o b a lw e r e 弱f o l l o w s 1 a l k a l ir e a g e n t n a 2 c 0 3 n a 2 8 4 0 7c o n t e n t 9 w 细 m i l l i n g p e r i o d 4 5 m i n p a r t i c l es i z e d 9 5 一 2 0 双黄酮化合物有6 种 极性低 分别是银杏黄素 异银杏黄素 白果黄素 阿曼托黄素 西阿多黄素和5 甲氧基白果黄素 儿茶素根据母核2 位碳原子旋光度不同及5 位是否含有羟基分为4 种 儿茶素 表儿茶素 没食 子酸儿茶素和表没食子酸儿茶素嗍 b o 儿茶素 r i h r 2 h 槲皮素 r l h r 3 o h 异鼠李紊i r i h r 2 o m e 图1 4 银杏叶中主要的黄酮类物质的结构 f i g 1 4t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo ff l a v o n e si ng i n k g ob f l o b a l 黄酮 f l a v o n e s 是广泛存在于自然界的一大类化合物 目前 黄酮类化合物 泛指由两个芳香环 a 或b 通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物 一般 具有c 6 c 3 c 6 的基本骨架 如图1 5 所示 根据中央三碳链的氧化程度 三碳链 是否构成环状以及b 环的连接位置 2 或3 位 等特点 可将黄酮化合物分为1 0 多个类别 9 3 1 其中黄酮和黄酮醇是植物界分布最广的黄酮类化合物 已经证明 它是许多中草药的有效成分i 舛 黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基 故显酸 性 可溶于碱性水溶液中 酸性强弱与酚羟基数目的多少和位置有关 以黄酮 为例其酚羟基酸性由强至弱的顺序是 7 4 二o h 7 或4 o h 一般酚羟基 5 o h 其中7 和4 位同时有羟基者 p p 共轭效应影响下 使酸性增强而可 溶于碳酸氢钠水溶液 7 或4 位有羟基者 只溶于碳酸钠水溶液 此性质可用 于提取 分离及鉴定工作 槲皮素及其相关的黄酮苷类化合物分子中含有7 4 二o h 呈酸性 可被碱中和 成盐 使黄酮水溶性增加 常规操作中往往采 用碱水加热提取 9 0 9 5 1 1 8 机械化学法在植物有效成分提取中的j 澎用 o c 6 c 3 c 6 图1 5 黄酮类物质的基本结构 f i g 1 5t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo ff l a v o n e s 环糊精 c d 具有疏水性的内腔和亲水性的表面 是超分子化学中的基础物 质之一 它具有的包合特性使其在理论和实际应用中得到迅速发展瞄 尤其在 医药方面 c d 及c d 衍生物与传统药物载体材料相比 无毒 性质稳定 结构 独特 可用于提高药物溶解度和稳定性 增强药物利用率 9 7 9 8 研究表明 c d 及其衍生物对多种中药有效成分有增溶作用 9 9 1 0 1 1 c d 的包合方法主要有饱和 水溶液法 固态研磨法 冷冻干燥法等 其中研磨法是指将结晶c d 与液态或 结晶态客体分子机械混合 在一般湿度 相对湿度 6 0 7 5 条件下强力研 磨 即可形成包结物 9 6 1 环糊精 c d 在研磨或溶液搅拌下对芦丁 槲皮素等多 种黄酮类物质有包合或吸附作用 可显著提高黄酮的水溶性1 9 9 1 0 2 目前黄酮类物质的提取多采用醇提法和水浸法1 5 6 j 醇提法过程中乙醇挥发 性强 易燃 操作过程繁琐 生产成本较高 水浸法即直接以水为溶剂 由于 黄酮在水中溶解度较低 提取效果不理想 因此 选择合适的增溶剂以提高水 提法的效率具有重要的意义 1 5 3 银杏黄酮的药理作用 银杏叶作为药用植物由来已久 对其黄酮类化合物的研究开发也越发重视 以下即从银杏叶黄酮类化合物的药理作用方面来阐述其应用现状 1 5 3 1 提高免疫力 抗癌防癌 黄酮类化合物主要通过影响细胞的分泌过程 有丝分裂及细胞间的相互作 用而起抗炎及提高免疫功能 多数黄酮类化合物能抑制肥大细胞和嗜碱性细胞 对多种刺激引起的组胺及慢反应物质的释放 抑制透明质酸酶的活性 抑制中 性粒细胞溶酶体酶的释放及其脱颗粒 1 吲 黄酮类化合物是通过促进肿瘤坏死因 1 9 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 子 抑制致癌剂及抗氧化等多途径发挥疗效的 1 5 3 2 改善血管循环 防治血管疾病 银杏叶中的黄酮类化合物 具有扩张血管的作用 它能增加脑的血流量 促进脑部血液循环 对脑缺血 缺氧损伤有保护作用 黄酮类物质还具有降血 脂 抑制脂质过氧化 降低血液中总胆固醇和增加高密度脂蛋白的作用 使血 液黏稠度降低 增加冠状动脉血流量 减少动脉硬化的发生 1 0 4 1 黄酮类化合物 对于抑制血小板凝集也有显著作用 黄酮类化合物对凝血因子具有较强的抑制 作用 故表现出较好的抗凝血作用 黄酮类化合物还可降低血管内皮细胞羟脯 酸代谢 使内壁的胶原或胶原纤维含量相对减少 利于防止血小板粘附凝集和 血栓形成 有利于防治动脉粥样硬化 1 0 5 j 实验表明 不同浓度的黄酮类化合物 对抑制血小板凝集有不同程度的作用 1 叫 另外还可以使处于异常状态下的血管 功能恢复正常水平 坩 1 5 3 3 抗氧化 清除自由基 自由基性质活泼 有极强的氧化反应能力 对人体有很大的危害性 在体 内自由基和脂质过氧化作用导致细胞结构改变和功能破坏 从而引起癌症 衰 老及心血管等退变性疾病 瑚 近代分子生物学研究证明 银杏叶提取物能降低 过氧化脂质 提高清除自由基的s o d 的活性 有明显的抗氧化能力 能有效消 除人体衰老过程中的不饱和脂类 蛋白质类等氧化而成的自由基 防止脑细胞 和脑功能受到损害 从而延长人的寿命 因此 银杏叶有抗衰老和延长寿命的 作用 1 5 3 4 美容 减肥 银杏叶所含黄酮类化合物能清除体内存在自由基 降低过氧化脂质形成速 度 具有s o d 作用 可使皮肤光润 减少黑色素形成 从而抑制老年斑形成 埘j 有关对类黄酮作用的大量研究表明 类黄酮物质对动物的脂质代谢具有调节作 用 目前在韩国 日本市场上已出现含有银杏叶提取物的化妆品 比如非常受 广大女士们欢迎的婵真品牌 在使用过此产品的人群中有较佳的口碑 1 6 本研究的目的及意义 植物药用成分提取的研究对中药生产现代化具有重大意义 第一 拓展了机械化学技术的应用范围 植物有效成分的机械化学辅助提 2 0 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 取是建立在传统提取技术之上 研究超微粉碎机械力与固相化学反应相结合对 中药有效成分提取及工艺的影响 机械化学辅助提取技术是对天然植物有效成 分提取理论的丰富和发展 同时也是该技术在一个全新领域 中药有效物质 提取中的应用 拓展了机械化学技术的应用范围 第二 充分利用原料 节省成本 在实际应用方面 开发植物有效物质提 取技术可为基础性药理研究提供大量纯品 机械化学法提取中药有效成分具有 显著提高提取率 简化生产工艺 提高特异性 充分利用原材料 节省成本等 优点 第三 提高了植物有效成分提取的安全性 经机械化学处理后 有效物质 在特定溶媒 通常为水或稀醇 中的溶解度增大 多数有效物质可以用水或稀 醇将其提取出来 从而避免了使用大量有机溶剂带来的环境污染 提高了产品 使用安全性 本研究从以下几个方面开展研究 1 以穿心莲内酯和银杏叶总黄酮为目标提取物 以提取率为指标 筛选 机械化学辅助提取的最佳助剂 2 初步考察目标提取物与助剂的作用情况 3 比较不同预处理方法对穿心莲和银杏药材形态的影响以及对穿心莲内 酯和银杏总黄酮提取率的影响 4 单因素实验 考察不同预处理方法对提取率的影响 5 在单因素试验基础上 通过正交试验优化提取工艺 6 最佳工艺条件下与热回流提取比较 7 考察机械化学法在提取内酯类和黄酮类化合物中的适用情况 2 1 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 第二章机械化学辅助提取穿心莲内酯 本章首先采用x 射线衍射 x r d 及紫外分光光谱 u v 分析初步考察研钵中 研磨前后穿心莲内酯一助剂的作用情况 以穿心莲内酯提取率为指标 筛选出 机械化学法辅助提取的最佳助剂 其次 比较不同预处理方法对穿心莲粉末形 态及内酯提取率的影响 最后 在单因素试验基础上 通过正交试验确定机械 化学法辅助提取穿心莲内酯的最佳工艺条件 并与热回流提取比较 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 2 1 1 1 实验仪器 w z j b f m 6 j 型高能振动研磨机 外型如图2 1 所示 另配有循环水系统 主要技术参数 外形尺寸 1 1 5 0 7 6 0 1 5 0 0 m m 公称容积 6 3l 装料量 1 2u 次 装机容量0 7 5k w 工作时研磨钢制介质棒 d 1 8 m m l 1 7 4 m m j j h 速 度 7 8 4m s 2 量急 图2 1 w z j b f m 6 j 型高能振动研磨机 f i g 2 1w z j b f m 一6 ji n t e n s i v eg r i n d i n ge q u i p m e n t 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 名称 高能振动研磨机 高效液相色谱仪 分析 高效液相色谱仪 制备 e p sc 1 8 色谱柱 e p sc 1 8 色谱柱 质谱分析仪 紫 b 可见光谱仪 x 射线衍射仪 扫描电镜 激光粒度分析仪 中草药小型粉碎机 m i l i q 纯水系统 旋转蒸发器 台式高速离心机 标准筛 磁力搅拌器 电热恒温干燥箱 电热套 循环水式真空泵 低温冷冻离心机 型号 w z j b f m 一6 j a g i l e n t11 0 0 l c 1 0 2 5 0m m 4 6m m 5 z m 2 5 0m m 1 2m m 1 0 t m 1 1 0 0m s d v 5 5 0 d 瓜厦a x 2 4 0 0 j e m 1 2 0 0 e x l s l 0 0 q 1 f w l 7 7 s y n t h e s i sa 1 0 r e 5 撇 t g l l 6 g 网孔2 3 6 0 0 3 71 1 1 1 1 1 7 9 1 1 0 1 2 a b x h w s h z o i i i 5 8 0 4 r 厂家 济南倍力粉技术工程有限公司 美国a g i l e n t 公司 大连江申分离科学技术公司 大连江申分离科学技术公司 大连江申分离科学技术公司 美国h p 公司 日本j a s c o 公司 日本r i g a k u 公司 日本电子株式会社 美国b e c k m a nc o u n t e r 公司 天津市泰斯特仪器有限公司 美国m i l l i p o r e 公司 上海亚莱生化仪器厂 上海医用分析仪器厂 新乡市康达新机械有限公司 常州国华电器 上海阳光实验仪器 巩义市英峪予华仪器厂 巩义市英峪子华仪器厂 德国e p p e n d o f f 公司 2 1 1 2 试剂 穿心莲内酯标准品 纯度 9 5 购于中国药物生物制品检定所 甲醇 色 谱纯 购于美国t e d i a 公司 无水乙醇 分析纯 沈阳新兴试剂厂 其他试 剂均为分析纯 2 1 1 3 供试材料 穿心莲 根及根茎 购于大连开发区大药房 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 2 1 2 方法 2 1 2 1 供试品溶液的制备 用小型中药粉碎机将穿心莲药材粉碎至6 0 目 6 0 下干燥3 h 备用 即粗 粉 以下同 取粗粉2 0 0g 与一定量助剂混合研磨 精确称取研磨后的粉末5 0 g 按生药计 加入一定量溶剂 室温 2 0 3 c 搅拌一段时间 离心 取上 清 沉淀重复提取2 次 合并上清液 用稀盐酸调节p h 值为3 o 静置过夜 离心 取沉淀 干燥并研碎后加入2 0 m l 9 5 乙醇 超声充分溶解 过滤 用 乙醇定容滤液至1 0 0 m l 得供试样品 提取工艺见图2 2 旁i 莲粗粉j 机械研磨 叫细粉 溶剂提取 调p h 值 离心 厂上清 l 沉淀 生穿心莲内酯粗提物 图2 2 机械化学法辅助提取穿心莲内酯的提取工艺 f i g 2 2f l o wc h a r to ft h em e c h a n o c h e m i c a la s s i s t e de x t r a c t i o no f a n d r o g r a p h o l i d ef r o ma n d r o g r a p h i sp a n i c u l a t a 2 1 2 2 穿心莲内酯标准曲线建立 精密称取1 2 0 减压干燥至恒重的穿心莲内酯标准品1 0 m g 置l o m l 容量 瓶中 用甲醇稀释至刻度 摇匀 再精密吸取l m l 至1 0 r a l 容量瓶中 加甲 醇稀释至刻度 摇匀 得标准品溶液 o 1 m g m l 分别精密进样2 4 8 1 2 1 6 2 0 比l 色谱条件 色谱柱 e p sc 1 8 色谱柱 2 5 0 m m x 4 6 m m 耻m 流动相 甲醇 水溶液 6 5 3 5 v v 检测波长 2 2 5 n m 时间 3 0 r a i n 流速l m l m i n 柱 温 室温 得线性回归方程为y 3 2 8 2 1x 一2 7 4 9 相关系数r 2 0 9 9 9 4 表明 色谱峰的峰面积积分值y 与进样量x 以蓟呈良好的线性关系 精密度实验 在选定的色谱条件下 用0 1m g m l 的穿心莲内酯对照品溶 液连续进样5 次 按峰面积计算出r s d r s d 为0 7 8 表明该检测方法精密 度良好 回收率实验 精确量取已知含量的供试品溶液5 份各1m l 分别加入0 2m l 标准品溶液 分别测定穿心莲内酯含量 回收率均在9 2 5 9 7 8 之间 平均 回收率9 4 8 r s d 为0 6 5 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 2 1 2 3 穿心莲内酯的含量的测定 按照2 1 2 2 的方法测定供试样品中穿心莲内酯的含量 进样量1 0 l 穿 心莲内酯的提取率按下式计算 e m m 1 0 0 e 提取率 m 经换算后提取液中穿心莲内酯质量 m 曲 m 穿心莲样品质量 m 曲 2 1 2 4 机械化学辅助提取助剂的筛选 选用三种碱 分别为n a o h n a 2 c 0 3 及n a h c 0 3 作为备选助剂 每种助剂 分别选取2 9 4 9 两个用量水平 确定机械化学辅助提取的最佳助剂 2 1 2 5 穿心莲内酯与助剂作用情况的初步考察 根据助剂筛选结果 选用n a 2 c 0 3 作助剂 分别将研磨成约3 0 0 目的穿心 莲内酯和n a 2 c 0 3 按摩尔比1 1 称量后 在小试管中上下翻滚混合8 次 作供 试样品1 另取未经研磨 摩尔比1 1 的穿心莲内酯和n a 2 c 0 3 混合物 在玛瑙 研钵中研磨1 5m i n 作为供试样品2 将供试样品1 2 分别做x 射线衍射 m 和紫外分光光谱分析 考察 穿心莲内酯是否与助剂在研磨的情况下发生化学反应 工作条件 x 射线衍射 x r d c u k a 靶 培0 1 5 4a m 管压4 0k v 管流1 0 0m a 扫描速度6 o r a i n 一 扫描范围 2 6 0 2 0 紫外分光光谱图 u 分析 扫描波长范围2 0 0 3 0 0n l l l 回收率实验 取2 0m g 供试样品2 用1 0 0m l 水超声充分溶解 用稀盐酸 调节p h 值至3 5 蒸去溶剂得残渣 干燥后加入1 0 0m l 无水乙醇 超声1 0m i n 过滤 用乙醇定容滤液至1 0 0m l 取1m l 置5 0m l 容量瓶中 用乙醇定容至 刻度 得供试品溶液 测定穿心莲内酯含量 计算回收率 2 1 2 6 穿心莲粉末的粒度与形态分析 采用激光粒度仅分析机械化学处理后穿心莲细粉 n a 2 c 0 3 用量 4 d 9 5 4 4g m 的粒度分布 采用扫描电镜 s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e s e m 观察 穿心莲粗粉 超微粉碎 d 9 5 4 4g m 及机械化学处理后穿心莲细粉 n a 2 c 0 3 用 量4 w w d g s 4 4 m 的形态 其中粗粉放大倍数为5 0 0 倍 超微粉碎 及机械化学处理后的穿心莲细粉放大倍数为2 0 0 0 倍 加速电压均为4 0k v 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 2 1 2 7 机械化学辅助提取穿心莲内酯的单因素实验 分别考察助剂用量 研磨时间 乙醇浓度 料液比对机械化学辅助提取穿 心莲内酯提取率的影响 试验条件 n a 2 c 0 3 用量4 研磨时间4 0 m i n 水作 溶剂 料液比1 5 0 g m l 搅拌l o m i n 在其他条件不变的情况下 改变其中 一个因素探讨其对穿心莲内酯提取率的影响 每组测定三份样品 来自三次同 等试验条件下的不同试验 n 3 试验数据采用牙丛d 表示 用s p s s l 0 0 统计 软件单因素方差分析 s n k 检验处理 2 1 2 8 机械化学辅助提取穿心莲内酯的正交实验 根据单因素试验结果 选b 3 4 做正交实验 考察不同因素对提取率的综 合影响 因素水平见表2 1 表2 1b 3 4 正交设计因素水平表 t a b 2 1i o 3 4 f a c t o r l e v e lt a b l eo fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t 2 1 2 9 超微粉碎辅助提取 取穿心莲粗粉2 0 0g 研磨至粒度d 9 5 一 4 4p m 精确称取研磨后的粉末5 og 加入2 5 0 m l 7 5 乙醇 室温 2 0 3 搅拌1 0 r a i n 离心 取上清 沉淀 重复提取2 次 合并上清液并浓缩 得浸膏 真空干燥 研碎后加入2 0m l 9 5 乙醇 超声充分溶解 过滤 用乙醇定容至l o o m l 得供试品溶液 2 1 2 1 0 物理混合样品的提取 取超微粉碎后的穿心莲粉5g d 9 5 4 4 9 m 与0 2 0 8n a 2 c 0 3 占总物料干 重的4 粒度d 9 5 4 4 m 均匀混合 直接加入2 5 0m l 水 室温 2 0 3 搅拌提取1 0m i n 离心 取上清 沉淀重复提取2 次 合并上清液 用稀盐酸 调节p h 值至3 5 蒸去溶剂得残渣 干燥并研碎后加入2 0m l 9 5 乙醇 超 声充分溶解 过滤 用乙醇定容至1 0 0 m l 得供试品溶液 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 2 1 2 热回流提取 精确称取穿心莲粗粉5 0 9 用2 5 0 m l 7 5 乙醇回流3 h 离心 取上清 沉淀重复提取2 次 合并上清液并浓缩 得浸膏 真空干燥 研碎后加入2 0 m l 9 5 7 醇 超声充分溶解 过滤 用乙醇定容至1 0 0 m l 得供试品溶液 2 1 2 1 2 穿心莲内酯提取物的鉴定 在最佳工艺条件下进行提取 利用半制备液相色谱对粗提物进行分离纯化 得到目标提取物 然后利用w a t e r sq u a t t r oh p l c m s 对目标提取物进行鉴定 色谱柱为s h i m p e c kv p o d s 2 0 m mx 1 5 c r n 流动相为甲醇 水 6 5 3 5 v v 检测波长2 2 5 n m 流速0 2 m l m i m 进样量2 u l 2 2 结果与讨论 2 2 1 助剂的筛选 不同助剂对穿心莲内酯提取率的影响结果见表2 2 表2 2 不同助剂对穿心莲内酯提取率的影响 m e a n s d 1 1 3 t a b 2 2e f f e c to fd i f f e r e n tr e a g e n to nt h ee x t r a c t i o no fa n d r o g r a p h o l i d e 口 d 9 5 4 4 m 水作溶剂 料液比1 5 0g m l 搅拌1 0 r a i n b 7 5 乙醇作溶剂 搅拌1 0 m i n 由表可知 三种不同碱助剂比较 以n a 2 c 0 3 的提取率效果最好 提取率 显著高于其它两组及超微粉碎辅助提取 p 0 0 5 n a o h 作助剂时提取率较 n a 2 c 0 3 低 p o 0 5 这可能是由于n a o h 的碱性较强 可能会增加杂质溶出量 从而影响穿心莲内酯的溶出 以n a h c 0 3 为助剂的提取率也低于n a 2 c 0 3 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 p o 0 5 可能是由于n a h c 0 3 的碱性偏低 在本试验条件下可能未与穿心莲 内酯充分作用 所以本实验选用n a 2 c 0 3 作为机械化学辅助提取穿心莲内酯的 最佳助剂 2 2 2 穿心莲内酯与助剂作用的检测结果 研磨前穿心莲内酯与n a 2 c 0 3 混合物呈白色 随研磨时间延长逐渐变为黄色 研磨前后样品的x r d 分析结果见图2 3 研磨后穿心莲内酯一n a 2 c 0 3 体系衍射峰 较研磨前有较大变化 表明研磨后体系中有新的晶态形成 提示二者可能发生 化学反应 即穿心莲内酯与n a 2 c 0 3 使发生反应 使穿心莲内酯开环成盐 2 q r j t 岫i 图2 3 穿心莲内酯 n a z c 0 3 体系研磨前后的x 射线衍射图 f i g 2 3x m yd i f f r a c t i o ns p e c t r u mo fa n d r o g r a p h o l i d e n a 2 c 0 3s y s t e m b e f o r ea n da f t e rg r i n d i n g u v 分析结果见图2 4 由图表明研磨前穿心莲内酯一n a 2 c 0 3 体系在 2 8 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 2 2 0 3 r i m 处有最大吸收 研磨后在2 2 8 5 r i m 处出现新的吸收峰 吸收峰红移 可能是由于穿心莲内酯开环 从而推断研磨后穿心莲内酯可能与n a 2 c 0 3 发生 中和反应 成盐 图2 4 穿心莲内酯 n a 2 c 0 3 体系研磨前后的紫外可见分光光谱图 f i g 2 4u vs p e c t r u mo fa n d r o g r a p h o l i d e n a 2 c 0 3s y s t e mb e f o r ea n da f t e rg r i n d i n g 将研磨后样品2 用酸还原 穿心莲内酯的回收率为9 1 6 1 5 表明穿心 莲内酯与碱研磨后 用水提取 酸还原的方法可行 2 2 3 穿心莲粉末的粒度与形态关系 常规植物细胞的尺寸一般在1 0 1 5 0 u r n 范围内 激光粒度仪分析表明 经 机械化学处理后 d 9 5 蛳m 的穿心莲细粉 n a 2 c 0 3 用量为4 物料粒径 d 7 0 2 私m d 2 0 l o p m 提示大部分细胞可能被完全破碎 电镜分析结果如图 2 5 所示 由图可知过6 0 目筛的穿心莲粗粉在放大5 0 0 倍的电镜下仍可观察到 较完整的植物组织结构 大部分细胞未被破碎 而经超微粉碎和机械化学处理 后 在放大2 0 0 0 倍的电镜下已观察不到完整细胞 提示研磨到粒度d 9 5 o 0 5 这表明在本试验条件下 添加2 5 n a 2 c 0 3 占物料干重 即可使穿心莲内酯与 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 n a 2 c 0 3 充分作用 s 1 冰 v 莒 圣 裂 避 墨 j l f 0 钛 t o1 52 0 2 53 o3 5 o n a 2 c 0 3 用量 w w 图2 6n a 2 c 0 3 用量对穿心莲内酯提取率的影响 m e a n s d n 3 f i g 2 6e f f e c to fn a 2 c 0 3c o n t e n to nt h ee x t r a c t i o no fa n d r o g r a p h o l i d e 2 2 5 2 研磨时间对提取率的影响 研磨时间对提取率的影响结果见图2 7 喜 毋 得1 4 娶 裂 隘1 2 翟 捌 钛1 0 l o2 0 3 0 4 0 研磨时间 m i n 图2 7 研磨时间对穿心莲内酯提取率的影响 m e a n s d n 3 f i g 2 7e f f e c to fm i l l i n gp e r i o do nt h ee x t r a c t i o no fa n d r o g r a p h o l i d e 3 1 6 4 2 o 机械化学法在植物有效成分提取中的麻用 由图可知 研磨时间由1 0 r a i n 粒度为d 9 5 1 2 5 肛m 增加至4 0 r a i n 物料 粒度为d 9 5 4 4 p m 穿心莲内酯的提取率提高了3 9 p 0 0 5 故研磨时间选用4 0 m i n 即物 料粒度d 9 5 4 4 z m 2 2 5 3 乙醇浓度对提取率的影响 不同浓度的乙醇为溶剂 考察其对机械化学处理后穿心莲内酯提取率的影 响 并与粗粉热回流及超微粉碎辅助提取比较 结果见图2 8 由图可知 穿心 莲粗粉和超微粉碎的细粉在6 0 及8 0 乙醇中提取率较高 水作溶剂时的提取率 较低 p 0 0 5 机械化学处理后 穿心莲内酯在乙醇浓度为零即水中的提取率 最高 且好于其他样品在不同溶剂中的提取率 随乙醇浓度增加 提取率逐渐 降低 p 0 0 5 考虑生产成本和后续处理 料液比取l 5 0 g i l l l 事 譬 参 v 龉 吝 裂 疆 墨 捌 钛 1 3 01 5 01 7 01 1 0 0 料液比 g m 1 图2 9 料液比对穿心莲内酯提取率的影响 m e a n s d n 3 r i g 2 9e f f e c to fs o l i d l i q u i dr a t i oo nt h ee x t r a c t i o no fa n d r o g r a p h o l i d e 2 2 6 机械化学辅助提取穿心莲内酯的正交实验结果 正交实验结果见表2 4 由级差分析可知 各因素对提取率的影响次序为 乙醇浓度 物料粒度 助剂用量 料液比 机械化学辅助提取穿心莲内酯的最佳 工艺为a 3 8 3 c 1 d 3 即s a 2 c 0 3 助剂用量为3 w w 研磨时间4 5 m i n 水作为 溶剂 料液比为1 6 0 g m l 本实验在优化的工艺条件下进行了3 批原料的平行提取 平均提取率为 1 6 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 表2 4b 3 4 正交试验结果 t a b 2 4 l 9 3 4 r e s u l to fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t 2 2 7 穿心莲内酯的鉴定结果 分离纯化后的经液相色谱分离出的提取物纯度为9 1 液相色谱峰面积百 分比 质谱分析结果如图2 1 0 所示 检测到正模式 m n a m z3 7 3 3 及负模 式 m c l m z3 8 5 3 峰 质谱仪误差为 0 5 说明该物质的分子量为m 3 5 0 与 穿心莲内酯标准品的分子量 m 3 5 0 致 这表明穿心莲内酯分子在提取过程中 可能未发生变化 机械化学法在植物有效成分提取中的麻用 i 蜥 蹦 嘣 努1 3 j 吐 i 乃l 捌瞎 1 4 珏 ii4 3 9 3 删l嚼1 q 5 l t l 圈乜s 图2 1 0 机械化学辅助提取穿心莲内酯提取物的质谱分析 f i g 2 1 0m a s ss p e c t r o m e t r ya n a l y s i so fa n d r o g r a p h o l i d ee x t r a c t b ym e c h a n o c h e m i c a la s s i s t e de x t r a c t i o n 2 2 8 机械化学辅助提取与热回流提取比较 最佳工艺条件下将机械化学辅助提取与热回流提取比较 结果见表2 5 由 表可知 与热回流法相比 机械化学辅助法提取穿心莲内酯的提取率提高了 2 5 2 0 室温下提取 时间可由3 h 缩短到5 r a i n 表2 5 机械化学辅助提取与热回流提取比较 m e a n s d n 3 t a b 2 5c o m p a r i n gm e c h a n o c h e m i c a la s s i s t e de x t r a c t i o nw i t hh e a t r e f l u xe x t r a c t i o n 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 2 3 小结 本试验条件下 机械化学辅助提取穿心莲内酯的最佳助剂为n a 2 c 0 3 穿心 莲内酯 n a 2 c 0 3 体系的x 射线衍射 x r d 及紫外分光光谱 分析结果初步 表明 固态研磨条件下穿心莲内酯环可能与n a 2 c 0 3 发生开环反应 研磨后样 品的回收率为9 1 6 1 5 表明穿心莲内酯与碱研磨后 用水提取 酸还原的 方法可行 物料粒度及电镜分析结果表明 经机械化学处理后 物料粒径d g s 4 4 m 穿心莲药材细胞可能已被充分破碎 细胞内成分呈释放状态 机械化 学辅助提取的提取率显著高于超微粉碎及相同粒度和助剂用量的物理混合样 品 表明机械化学处理过程在促进n a 2 c 0 3 与穿心莲内酯的接触 反应 提高 穿心莲内酯水溶性方面可能起到重要作用 单因素试验基础上确定的机械化学辅助提取穿心莲内酯的最佳工艺为 n a 2 c 0 3 助剂用量为3 w w 研磨时间4 5 m i n 水作溶剂 料液比为1 6 0g m l 各因素对提取率的影响次序为 乙醇浓度 研磨时间 n a 2 c 0 3 用量 料液比 质 谱分析结果表明 机械化学辅助提取的目标提取物的分子量与穿心莲内酯标准 品一致 表明穿心莲内酯分子在提取过程中可能没有发生变化 该工艺条件下与热回流提取比较 机械化学辅助提取在室温下以水作溶剂 穿心莲内酯提取率比热回流高2 5 2 且大大缩短了提取时间 机械化学法在植物有效成分提取中的应用 第三章机械化学辅助提取银杏叶总黄酮 本章首先以总黄酮提取率为指标 筛选出机械化学辅助提取的最佳助剂 以芦丁作为银杏叶总黄酮的替代品 采用x 射线衍射 x l m 及紫外一可见漫反 射光谱 d r s 初步考察研钵中研磨前后芦丁一助剂的作用情况 其次 比较不同 预处理方法对银杏叶粉末形态及总黄酮提取率的影响 最后 在单因素试验基 础上 通过正交试验确定机械化学辅助提取银杏叶总黄酮的最佳工艺条件 并 与热回流提取比较 3 1 材料与方法 3 1 1 材料 3 1