一种皮肤刺激体外替代新方法.doc

介绍一种皮肤刺激体外替代新方法在医疗器械生物学评价方面，皮肤刺激试验目前仍采用家兔法进行安全性试验，而运用减少（Reduction）、替代（Replacement）、优化（Refinement）动物试验的3R原则和采用动物试验替代方法进行安全评价，已成为欧洲社会努力实现的目标之一，皮肤刺激体外替代新方法EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTMRHE方法通过ECVAM（欧洲替代方法验证中心）大约10年时间的验证，经历研究阶段发展阶段前期确认确认阶段多方专家独立回顾法规接受等阶段于2010年7月最终被OECD TG439采纳用来代替家兔Draize法来进行皮肤刺激试验。下面就简要介绍一下皮肤刺激体外替代新方法及其是如何被ECVAM验证的。体外重组人皮肤表皮模型，是法国欧莱雅集团经过20年研究，从一些乳房整形手术中获得表皮角化细胞(Keratinocytes)，在铺满胶原质(collagen)培养器中培养两到三周，具有较强繁殖功能的角化细胞不断分化、成层，最终成长为类似于人类表皮的皮肤组织。 图1正常人皮肤表皮结构 图2体外重组人皮肤表皮结构它具有原始皮肤细胞典型的器官结构和超微结构，可以像真实皮肤一样不断生长，有皮肤屏障功能，在阳光下暴露一定的时间会变黑，能表现一些人逐渐变老的特征，甚至还可以表现人愤怒时的迹象，非常适合用于皮肤刺激体外替代试验，已经商品化的有EpiSkinTM、EpiDermTMSIT和SkinEthicTMRHE图3 EpiskinTM标准试剂盒其试验原理是将受试物均匀涂布于皮肤模型上，接触一定时间后用MTT法测试细胞存活率，若存活率50%提示有刺激性。皮肤刺激替代方法的发展历程1998-2001 ECVAM对EpiSkinTM、EpiDermTM、 Prediskin、non-perfused pig ear和Skin Integrity Function Test (SIFT)的前期研究2002-2003 对EpiSkinTM、EpiDermTM 和SIFT进行优化2003-2007 ECVAM对EpiSkinTM、EpiDermTM 和SIFT进行验证2008 ESAC声明改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTMRHE方法在欧盟DSD范围有效2009 ESAC声明EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTMRHE方法可以在联合国全球化学品统一分类和标签制度GHS和欧盟化学品分类、标签和包装法规CLP范围执行2009.7 重组人皮肤表皮方法作为欧盟试验方法B.46被接受2010.7 OECD采纳了试验指南TG439（体外皮肤刺激试验：重组人皮肤表皮试验方法）ECVAM对优化的试验方法的验证（1）第一阶段：优化草案和测试模型的确认（用20种编码的化学物在顶尖实验室提前筛选）、皮肤模型审查、刺激物的选择和评估（可溯源）、参与实验室的培训。表1 EpiDermTM、 EpiSkinTM 和SIFT三种方法对比灵敏度 特异性 准确度EpiDermTM 56.0% 91.0% 75.0%EpiSkinTM 67.0% 91.0% 80.0%SIFT 22.0% 64.0% 45.0%最终SIFT由于灵敏度、特异性和准确度太低，被从优化草案中删除。（2）第二阶段：实验室内、实验室间测试方法的可重复性和可预见性评估，三个实验室各自用三种方法测试58种编码的化学物，每种方法循环测试3次。阳性对照和阴性对照必须符合测试标准要求（包括OD值或是存活率），对不符合要求的测试可以用重复测试结果来代替，允许重复两次。实验室内重复性应该85%，实验室间重复性应该80%，可预见率（因测试方法的目的不同而不同，如果是完全代替则要求假阴性、假阳性30%），确保获得足够的分析数据，85%以上的测试次数应该完成。表2 EpiDermTM和EpiSkinTM实验室内、间重复性比较实验室内重复性 实验室间重复性EpiSkinTM 94.6% 94.6% 92.6% 88.0%EpiDermTM 98.2% 93.8% 93.8% 92.9%表3 EpiDermTM、 EpiSkinTM和EpiSkinTM （IL-1法）比较灵敏度 特异性 准确度EpiSkinTM MTT法 72.0% 81.8% 77.6%EpiSkinTM MTT +IL-1法 92.0% 78.8% 84.5%EpiDermTM MTT法 60.0% 87.9% 75.9%最终EpiSkinTM MTT法被认为可以用来代替Draize皮肤刺激试验：R38，而EpiDermTM MTT法只特异性接受，不能作为替代方法。但后来经过对20种编码的化学物的跟踪研究表明， EpiSkinTM 、改良EpiDermTMSIT 、SkinEthicTM RHE可以代替Draize皮肤刺激试验：R38，被EU TM B.46 & OECD TG 439采纳。表4 EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTM RHE实验室内、间重复性比较实验室内重复性 实验室间重复性EpiSkinTM 89% 85%改良EpiDermTMSIT 95% 90%SkinEthicTM RHE 95% 100%表5 EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTM RHE比较灵敏度 特异性 准确度EpiSkinTM 70.0% 80.0% 75.0%改良EpiDermTMSIT 80.0% 80.0% 80.0%SkinEthicTM RHE 90.0% 80.0% 85.0%此方法经ECVAM验证并