木瓜蛋白酶的活力检测标准研究.doc

木瓜蛋白酶的活力检测标准研究张兴灿，陈朝银*，李汝荣（昆明理工大学-清华大学生物资源开发研究所 ，云南昆明 650224）摘 要：分 别 按 国 家 标 准 和 企 业 标 准 中 紫 外 分 光 光 度 法 测 定 了 两 个 酶 制 剂 企 业 生 产 的 木 瓜 蛋 白 酶 酶 活 力 ，结 果 表 明 ，企 业 标 准 与 国 家 标 准 测 定 的 酶 活 力 两 种 方 法 测 定 的 结 果 差 别 高 达 几 十 倍 ，原 因 可 能 与 底 物 溶 液 的pH、反 应 条 件 和 巯 基 还 原 剂 半 胱 氨 酸 盐 酸 盐 有 关 。关键词：木 瓜 蛋 白 酶 ，酶 活 测 定 ，标 准Study on determination standards of papain activityZHANG Xing-can, CHEN Chao-yin*, LI Ru-rong（Institute of Bioresource R&D of Kunming University of Science and Technology-Tsinghua University, Kunming 650224, China）Abstract：The determination standards of enzyme activity of papain got from two companies depended onNational standards and Enterprise standards was studied respectively，found that the results had great differences. Then possible reasons were analyzed，the main influential factors may be pH of substrate，reaction conditions and cysteine hydrochloride.Key words：papain；determination of enzyme activity；standard中图分类号：TS207.2文献标识码：A文 章 编 号：1002-0306（2011）10-0435-03木瓜蛋白酶（Papain，EC 31412212）是一种具有广泛底物专一性的含巯基蛋白酶，有很强的分解蛋 白质的能力，此外也具有水解酰胺键和酯键的特性1。由于它具有适用pH范围广、热稳定性好等优点，广泛 应用于医药、食品、纺织、制革、饲料、染料等工业生 产中。活力是蛋白酶最重要的质量指标，目前国家仅有蛋白酶制剂的通用标准2，由于对各类蛋白酶制剂 尚无标准规定，企业、生产厂商通常根据国家蛋白酶 制剂通用标准制定自己公司特定蛋白酶的企业标 准。例如，目前我国的一些植物蛋白酶制剂工厂已在生产木瓜蛋白酶，但对于木瓜蛋白酶的质量检测，特 别是酶活性检测的方法、条件和标准比较混乱，使产 品保存和销售受到严重影响3。为了提高产品质量， 增强国际市场的竞争能力，亟待加强管理和统一检测标准。经我们研究发现，企业标准与国家标准测定 的酶活力的差值竟然高达几十倍，这说明我国的酶 制剂市场存在着较大的漏洞。释放出的三氯乙酸可溶物在280nm处的消光值相当于浓度为1g/mL酪氨酸消光时所需的酶量，为一个 酶活力单位（U）。Ultrospec2100 型 紫 外 分 光 光 度 计AmershamPharmacia公司；HH-S型恒温水浴锅郑州长城科工贸有限公司；实验所用试剂 均为分析纯。1.2国标GB/T 23527-2009规定的方法41.2.1 试剂与溶液1.2.1.1 三氯乙酸称取三氯乙酸65.4g/L，用水溶解 并定容至1000mL。1.2.1.2 缓冲溶液 因为木瓜蛋白酶是中性蛋白酶，采 用磷酸缓冲液（pH=7.5），分别称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH PO2H O）0.5g，加水22 4 2溶解并定容至1000mL。1.2.1.3 L-酪氨酸标准储备溶液（100g/mL） 精确称 取预先于105干燥至恒重的L-酪氨酸（0.10000.0002）g， 用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐 酸溶液定容至100mL，即得到100g/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。1.2.1.4 氢氧化钠溶液（20g/L） 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900mL并搅拌溶解。待溶液到室温后，以 水定容至1000mL，搅拌均匀。1.2.1.5 盐酸溶液 浓度为1mol/L及0.1mol/L，按GB/ T 601配制。材料与方法11.1材料与仪器样品 选用两个酶制剂公司生产的木瓜蛋白酶 产品，以酪蛋白为底物，测定木瓜蛋白酶的酶活性；酶活力单位定义 在测定条件下每分钟水解酪蛋白收稿日期：20101008 * 通 讯 联 系 人作者简介：张 兴 灿 （1987-），男 ，在 读 硕 士 ，研 究 方 向 ：生 物 技 术 制 药 。基金项目：云 南 省 科 技 计 划 项 目 （2009EB081）。1.2.1.6 酪蛋白溶液 （10.0g/L） 称取标准酪蛋白1.3.1 溶剂（NICPBP国家药物标准物质）1.000g，精确至0.001g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中加热煮沸30min，并不时搅拌至酪 蛋白全部溶解。冷却到室温后转入100mL容量瓶中， 用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。定容前检查并调 整pH至相应缓冲液的规定值。此溶液在冰箱内贮存， 有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。1.2.2 分析步骤1.2.2.1 标准曲线的绘制 L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。表1 L-酪氨酸标准溶液1.3.1.1 0.05mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取8.955g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）到500mL容量瓶，用纯水 溶解并稀释至刻度，摇匀备用（加一滴甲苯防腐）。1.3.1.2 酶缓冲液（现配现用） 称取0.528g L-半胱氨酸盐酸盐、0.2236g乙二胺四乙酸二钠（EDTA），用 0.05mol/L磷酸氢二钠溶液分别溶解（共加入约90mL），合并混 匀，用0.1mol/L氢氧化钠溶液或0.1mol/L盐酸调pH6.0， 定容到100mL。1.3.1.3 酪蛋白溶液（现配现用） 称取0.600g酪蛋白（标准至0.001g），加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液 80mL，60水搅拌溶解，用0.1mol/L 盐酸调pH6.0，用纯水 定容到100mL，（400.2）保温备用。1.3.1.4 三氯乙酸溶液 称取2.994g乙酸钠，1.982g乙酸，1.798g三氯乙酸，用纯水分别溶解后混合，定容 到100mL容量瓶中，摇匀备用。1.3.1.5 待测酶溶液称取待测木瓜蛋白酶适量（精确到0.001g），置100mL容量瓶中，加5mL酶缓冲液浸 泡20min，加水至刻度，摇匀后，吸取1.0mL到25mL容 量瓶中，加酶缓冲液至刻度，摇匀。1.3.2 测试步骤1.3.2.1 待测酶溶液的测试 量取1.0mL待测酶溶液 置于具塞试管中，在（400.2）水浴锅中水浴10min，迅速加入酪蛋白溶液5.0mL，振荡使之充分混合后封 口放回水浴，精确计时10min，加入三氯乙酸溶液5.0mL，立即摇匀，过滤。用纯水作为空白，在275nm下测定滤液的吸光度A1。1.3.2.2 待测酶的空白测试 量取1.0mL待测酶溶液 置于具塞试管中，在（400.2）水浴锅中水浴10min，迅速加入三氯乙酸溶液5.0mL，振荡使之充分混合后 封口放回水浴，计时10min，加入酪蛋白溶液5.0mL， 立即摇匀，过滤。用纯水作为空白，在280nm下测定溶液的吸光度A2。1.3.2.3 酪氨酸标准液配制和测试 称取0.050g L- 酪氨酸标准品（精确至0.001g）至1000mL容量瓶中， 用0.1mol/L 盐酸溶解并稀释到刻度 （此为50g/mL的标准液）。以纯水作空白，在280nm波长处测吸光 度A3。1.3.3 结果计算 试样中酶活力X1（u/g）按下式计算：酪氨酸标准溶液（g/mL）酪氨酸标准储备液体积（mL）加水体积（mL）管号012345010203040500123451098765分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。以吸光度 A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲 线。利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（g），即为吸光常数K值。其K值应在130135范围 内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。1.2.2.2 样品的测定 待测酶液的制备：称取酶样品12g，精确至0.0002g。然后用相应的缓冲溶液充分溶 解，然后取滤液（慢性定性滤纸）稀释至适当的浓度。测定：先将酪蛋白溶液置于（400.2）恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）加酶液2.00mL（400.2），2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）（400.2），10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）加酶液2.00mL（400.2），2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）（400.2），10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）测滤液吸光度X1（ A1A2）/A350（11/10）（n/m）式（2）式（2）中：A1待测酶溶液测试滤液的吸光度；A2待测酶空白测试滤液的吸光度；A3酪氨酸标 准液的吸光度；n待测酶样品的稀释倍数；m待测酶样品的质量，g。1.2.3 结果计算 从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。样品的酶活力按下式计算：X2= X1Vn8 1式（1）2m 10结果与讨论2式（1）中：X1由标准曲线所得的样品最终稀释液的酶活力，u/mL；X2样品的酶活力，u/g；V溶解 样品所使用容量瓶的体积，mL；n稀释倍数；8反应试剂的总体积，mL；2吸取酶液的体积，mL；m样品的质量，g；1/10反应时间10min，以1min计。1.3按两个公司各自的企业标准进行测定5-6其中一个公司的企业标准为Q/JWLSW 01-2007（木瓜蛋白酶），另一个公司的企业标准为Q/NPB 01-2009（木瓜蛋白酶），两个标准的内容基本一致。2.1由所配制的酪氨酸稀释液测定的吸光度数据标准曲线由标准曲线所得的回归方程为：Y=0.0077X，相 关系数R=0.9979，经计算吸光常数k=130，符合实验 要求。2.2两个标准测得的酶活力结果对比表2和表3可以看出，在两个不同的标准下 测定的酶活力值有着高达几十倍的差值。436 2011年第10期表4 企业二的木瓜蛋白酶的酶活力结果酪氨酸质量（g）酪蛋白质量（g）试样质量（g）溶解体积（mL）试样酶活（u/g）酶活均值（u/g）方法再次稀释倍数A1A2A30.3840.3850.3940.2190.221969809758910332973237812QN/PB01-20090.05020.59980.9997250200.2320.43399299GB/T1.00001.0650250200.189773023527-2009 0.222 8056 酸盐，这也是影响最后结果的一个重要原因。半胱氨酸是一种还原剂，它通过改变蛋白质分子之间和蛋 白质分子内部的二硫键，减弱了蛋白质的结构，这样 蛋白质就伸展开来，从而使酶分子更易作用于折叠 的蛋白质肽键，使肽链更易被水解。0.40.30.20.1结论目前对于动植物组织提取的蛋白酶制剂，国家 还没有制定相应的标准，像蛋白酶制剂国标GB/T23527-2009中明确规定该标准不适用于动植物组织 提取的蛋白酶制剂。由于国家还没有制定相应的标准，就使动植物组织提取的蛋白酶制剂的酶活力测 定没有依据可循，造成其市场比较混乱。关于木瓜蛋白酶活力测定的标准，方焕3等人早 就已经讨论过，他们比较讨论了木瓜蛋白酶的三种活性检测方法，结果表明，以酪蛋白为底物的紫外分 光光度法操作简便、成本低廉，适于酶纯化过程中的 活性比较和木瓜蛋白酶系列产品及国内商品酶的活性测定；以BAEE为底物的光学法反应稳定、重复性 好，适于酶学性质的理论研究和出口商品酶的活性 测定；以酪蛋白为底物的茚三酮显色法，虽然操作烦 琐，但所需仪器简单，测定结果误差较小，非常适用于条件简陋的地区。本文中测定木瓜蛋白酶的活力 均是采用上面的第一种方法，即以酪蛋白为底物的 紫外分光光度法，正是由于这种方法操作简便、成本 低廉，当前我国许多关于酶制剂的标准几乎都采用的是这种方法。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂 主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备，但 是像木瓜蛋白酶这样的动植物组织提取的酶制剂也 占据巨大的市场份额，因此国家有必要制定关于动 植物组织提取的蛋白酶制剂的统一标准，以便人们 能够在市场更加方便的进行质量检测。参考文献40.001020304050L-酪氨酸标准溶液的浓度（g/mL）图1 酪氨酸溶液的标准曲线表2 企业一提供的三种木瓜蛋白酶样品按国标测定的 酶活力结果质量（g）稀释 吸光度 稀释液酶活 样品的酶 酶活均值样品倍数力（u/mL） 活力（u/g）（u/g）0.6080.6070.5980.5860.5890.5830.2860.2850.28781.60081.46680.25478.63979.04378.23638.26238.12839.397815681438021628556317862533917379141692061A1.00052508107B1.0009200062855C1.0010600091738表3 企业一提供的三种样品按其企标测定的酶活力结果稀释 倍数酶活力值 酶活均值样品 质量（g）A1A2（u/g）（u/g）0.3670.3690.3680.8130.8270.8170.7440.72050016504645023913768751405320138540132119673083702A0.10051000.14450240B0.100810000.1671389200C0.100525000.1433156742 0.737 3174556 讨论酪蛋白溶液配制方法的