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H7在脑损伤后血脑屏障损害中的作用 2010-01-15 李良平徐如祥王清华杨志林 摘要：目的探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂H7在脑损伤后血脑屏障损害中的作用。方法雄性SD大鼠48只，随机分为正常对照组、假手术组、脑损伤组和治疗组。治疗组于大鼠脑损伤后0.5小时腹腔注射PKC抑制H7(1mg/kg),12小时重复注射1次，伤后24小时应用分光光度计定量检测伊文氏兰渗出。结果脑损伤后伊文氏兰明显渗出，治疗组渗出明显减少。结论应用PKC抑制剂H7能明显阻止血脑屏障开放，可望在血脑屏障保护作用中提供新的治疗措施。 关键词：脑损伤；血脑屏障；信号转导 中图分类号：R651.102文献标识码：A 文章编号：1009-4237(2000)04-0210-03 Effects of H7 on blood-brain barrier damage in brain injury LI Liang-ping,XU Ru-xiang,WANG Qing-hua,et al. (Department of Neurosurgery,Zhujiang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou 510282) Abstract:ObjectiveTo explore the effects of H7,a protein kinase C(PKC) inhibitor,on BBB damage in brain injury.MethodsForty-eight male SD rats were devided into 4 groups:control one,sham-operation one,brain injury one and H7-treatment one.The rats of the treatment group were peritoneally administered H7(1mg/kg)0.5h after brain injury and did the same 12h after brain injury.The permeation of Evans blue was observed quantitatively with a spectrophotometer.ResultsEvans blue was significantly permeated in the injured group while insignificantly in the H7-treated rats.ConclusionH7 can prevent BBB opening,which may provide a new way in BBB protection. Key words:brain injury;blood-brain barrier;signal transduction 细胞内蛋白激酶C(PKC)激活可导致细胞通透性增加，脑微血管内皮细胞的PKC激活可导致血脑屏障的开放，脑水肿形成。研究脑损伤后PKC的信息转导通路可阐明血脑屏障损害的机理。 本研究采用伊文氏兰定量观察，探讨PKC抑制剂H7在脑损伤后血脑屏障损害中的作用。 材料与方法 1实验分组 雄性SD大鼠48只，体重(25030)g，随机分为正常对照组、假手术组、脑损伤组和H7治疗组，每组12只。治疗组于伤后0.5小时腹腔注射H7(1mg/kg)，12小时后重复注射1次，H7的剂量选择参照Joo的方法1。动物均于伤后24小时处死。 2脑损伤模型的建立 采用改进的Feeney氏2自由落体硬膜外撞击方法。实验动物用10%水合氯醛(0.35g/kg体重)腹腔内注射麻醉后，头部固定于立体定向仪上，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后，沿中线左侧切开头皮，分离骨膜，用牙科钻于中线旁2mm处，紧挨冠状缝后开一直径5mm的圆形窗，硬膜保持完整。用20g砝码于30cm高处通过一金属导杆坠落，撞击置于硬膜上的5mm直径的圆形锥上制成脑损伤模型，致伤冲击力为600gcm，硬膜外置明胶海绵止血，骨窗用锌汀粉封闭，缝合头皮，置鼠笼畏养。 正常对照组不做任何处理。假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不致脑损伤，术后24小时处死。 3脑组织伊文氏兰含量的测定 大鼠均于处死前1小时股静脉注射2%伊文氏兰3ml/kg。取脑时，为清除血液中染料，用生理盐水左心室灌注至右心耳流出清亮液体。取损伤侧皮质、海马，对侧皮质、海马分别称重，加入二倍体积二甲基甲酰胺，50C水浴中孵育72小时，1500g离心10分钟，取上清，应用分光光度计在伊文氏兰最大吸收光谱635nm处检测吸光度，从标准曲线上查得伊文氏兰含量结果以g/g脑组织表示。 4统计学处理 应用单因素方差分析和各组均数t检验处理，P0.05为显著性差异。 结果 脑组织伊文氏兰定量测定结果：脑损伤后损伤侧皮质、海马，对侧皮质、海马伊文氏兰含量都明显高于正常对照组和假手术组。治疗组损伤侧海马、对侧皮质、海马，伊文氏兰含量接近正常，损伤侧皮质伊文氏兰含量明显高于正常对照组和假手术组，但明显低于脑损伤组(见附表、附图)。 附表H7治疗后脑组织伊文氏兰含量的变化(s) 组别 n 伊文氏兰含量(g/g脑组织) 左侧皮质 右侧皮质 左侧海马 右侧海马 正常对照组 12 10.151.06 10.311.22 10.620.89 11.670.84 假手术组 12 10.960.43 10.870.37 10.610.66 10.550.49 脑损伤组 12 237.4115.48* 20.970.38 20.380.79* 15.671.19* H7治疗组 12 75.648.21* 11.671.31 11.960.76 10.430.85 *：P0.05，*：P0.01，与正常组相比较；：P0.05，：P0.01与脑损伤组相比较 L-左侧皮质R-右侧皮质LH-左侧海马RH-右侧海马 N-正常组S-假手术组B-脑损伤组H-H7治疗组 附图H7治疗后脑组织伊文氏兰含量的变化 讨论 PKC是内皮细胞信息转导通路的一个重要环节，调节内皮细胞通透性，在脑微血管内皮细胞中参与了血脑屏障通透性调节，与脑水肿的发生发展密切相关。Patterson3报道，在牛肺动脉内皮细胞单层，应用PKC抑制剂和下调PKC都能明显抑制百日咳毒素诱发的细胞间裂隙形成和通透性增加。Joo1报道在大鼠脑缺血模型中双侧颈内动脉结扎后，脑组织明显水肿，应用PKC抑制剂H7后，脑水肿明显减轻，提示PKC参与了血脑屏障开放的调节作用。本文通过对大鼠脑损伤后伊文氏兰渗出的定量研究，证明H7能明显阻止血脑屏障的开放。脑损伤后血脑屏障破坏分为可逆性损害和不可逆损害。各种介质作用的非直接损伤区，如同侧海马，对侧皮质、海马，血脑屏障可逆性开放，H7几乎能完全阻断血脑屏障可逆性开放。从本实验结果可知损伤侧周围皮质不可逆性损伤严重，存在血管断裂，伊文氏兰渗出最明显，H7部分阻断伊文氏渗出，达到60%。H7在脑损伤后血脑屏障损害中起着重要作用，有明显阻断血脑屏障开放的作用。 脑损伤后血脑屏障开放的主要方式是内皮细胞间裂隙形成，通透性增加，可能有二方面调节机制：(1)轴向的收缩，主要由肌球蛋白轻链激酶(MLCK)调节作用；(2)束缚力量，即细胞-细胞，细胞-基质粘附作用。PKC可使粘着斑蛋白激酶激活，作用于粘着斑蛋白和踝蛋白(vinculin and ta