光照强度和光照时间对铁皮石斛生长发育的影响

中国农业大学学士学位论文 摘要毕 业 论 文论文题目光照强度与光照时间对铁皮石斛生长发育的影响学 院 水利与土木工程学院 专业年级 农业建筑环境与能源工程05级 姓名学号 次仁拉珍 指导教师 贺冬仙 职 称 副教授 （2009年6月）中国农业大学教务处制摘要铁皮石斛（Dendrobium officinate Kimura et Migo）具有很高的药用和经济价值，是濒危灭绝的国家三级保护植物。现有的温室设施栽培虽然解决了人工栽培问题，但还存在生产周期过长、品质难以控制的缺点，为此，非常需要开发一种能缩短生产周期的新型人工栽培模式。本研究以在温室培育1-2年的铁皮石斛栽培苗作为试验材料，以荧光灯为人工光照源设置了光照强度为60、90、120、150 mol m-2 s-1和光照时间为9 h d-1和12 h d-1的8个人工光试验区，并以双层保温玻璃温室培育的作为自然光对照试验区，培育了16周进行了光合特性和叶绿素荧光特性的测量。铁皮石斛栽培苗的净光合速率在光照强度为60-90 mol m-2 s-1没有显著性差异，且与自然光对照区持平；在光照强度为120-150 mol m-2 s-1时也没有显著性差异；但这两个光照水平之间有显著性差异。光照时间对人工光下栽培的铁皮石斛的净光合速率、叶绿素含量、茎节数、干物率等都没有影响；对叶片数和株数有显著性影响，光照时间为12 h d-1的试验区要优于9 h d-1试验区。各试验区的叶绿素荧光特性指标也表现出同样的趋势。因此，选择光照强度120-150 mol m-2 s-1和光照时间12 h d-1的人工光照环境适于铁皮石斛栽培苗的生长发育。关键词：叶绿素含量 叶绿素荧光 光照环境 净光合速率毕 业 论 文论文题目光照强度与光照时间对铁皮石斛生长发育的影响学 院 水利与土木工程学院 专业年级 农业建筑环境与能源工程05级 姓名学号 次仁拉珍 指导教师 贺冬仙 职 称 副教授 （2009年6月）中国农业大学教务处制AbstractDendrobium officinale Kimura et Migo is a rare and endangered medicinal plant and has been listed as national third-class protection plant in China. Since cultivated D. officinale couldnt meet the need of curatorial and hygienical markets because of the slow growth and low quality, it is necessary to develop a new technique instead of conventional greenhouse cultivation to reduce the production period and control the plant quality. The D. officinate planted in greenhouse for 1 and 2 years after tissue culture was as experimental materials, 8 treatments with photosynthetic photon flux (PPF) of 60, 90, 120, 150 mol m-2 s-1 and photoperiod of 9 h d-1and 12 h d-1 using florescent lamps as the artificial lighting resource and 1 conventional treatment using natural lighting with greenhouse were used to culture D. officinale for 16 weeks then measure the photosynthetic and chlorophyll fluorescence characteristics. There were no significantly difference between treatments of PPF 60-90 mol m-2 s-1 and conventional treatment, and between treatments of PPF 120-150 mol m-2 s-1, the significantly difference of net photosynthetic rate was found in the two PPF levels. Effect of photoperiod was found on numbers of leaves and plant numbers, but didnt found on net photosynthetic rate, chlorophyll contents, node number, and dry matter ratio. The chlorophyll fluorescence characteristics were agreed with above results. Therefore, PPF of 120-150 mol m-2 s-1 and photoperiod of 12 h d-1 is suitable to produce D. officianle under controlled environment with artificial lighting. Key words: Chlorophyll content; Chlorophyll fluorescence; Lighting environment; Net photosynthetic rate中国农业大学学士学位论文 目录目录 第一章 前言 11.1 研究背景和意义 11.2 国内外研究现状 31.3 研究内容和技术路线 5第二章 光照强度与光照时间对人工光下栽培的铁皮石斛生长发育的影响 62.1 前言 62.2 材料与方法 72.3 结果与讨论 102.4 本章小结 14第三章 铁皮石斛在不同光照条件下的荧光特性 163.1 前言 163.2 材料与方法 173.3 结果与讨论 193.4 本章小结 22第四章 结论和建议 23参考文献 25致谢 26 图表目录图 1-1 技术路线 8图 2-1 叶绿素含量的测量9图 2-2 铁皮石斛光合作用和荧光特性的测量装置10图 2-3 光照强度与光照时间对铁皮石斛的植株形态影响12图 2-4 光照强度与光照时间对铁皮石斛的净光合速率的影响 14图 3-1 光照强度与光照时间对铁皮石斛的叶绿素荧光特性的影响 21表 2-1 光照强度和光照时间的试验区设置7表 2-2 铁皮石斛人工栽培用营养液配方8表 2-3 光照强度与光照时间对铁皮石斛生长发育的影响13表 2-4 光照强度与光照时间对铁皮石斛叶绿素含量的影响15表 3-1 荧光特性测量的参数设置18 中国农业大学学士学位论文 第一章 前言 第一章 前言1.1 研究背景和意义1.1.1 铁皮石斛的生物特性铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）别名铁皮兰、黑节草，是兰科石斛属（Dendrobium）植物，多年生草本植物，其生境独特，对小气候环境要求十分严格。铁皮石斛主要生长在热带、亚热带原始森林及相类似的温暖湿润的环境，在我国主要分布于陕西、四川、湖北、广东、广西、贵州、云南、台湾等省区1。铁皮石斛常生于地形多是悬崖峭壁，下临深潭，并有斜射阳光反射，山岭重叠，沟壑纵横的小生境。自然分布较多的地区，多属于温暖带和亚热带，海拔在600-1800 m之间，年平均气温为12-20，积温达3000-4200，生长季节温度为20-25。相对湿度在60-85 %之间，最适光照为20000Lux左右,无霜多雾，年均降雨量为1000-1900 mm。铁皮石斛常附生于满布苔鲜树干上，以及少数上述环境的岩石上，地质基础多为白云岩和石灰岩土壤为富含有机质的腐殖土壤。生长地有经过林冠过滤的散射光以及从间隙透入的短暂的直射光斑，林间透光度在30 %左右，为耐荫性的阴生植物。铁皮石斛的繁殖方式有分蘖繁殖和种子繁殖，分蘖力较强，常丛状生长，具有无性繁殖的性能。在自然条件下，主要以分蘖繁殖，且生长、繁殖速度都很慢2。种子小，无胚乳，一般生长3年后才能开花，植株也不断产生萌蘖，茎的基部或茎节在接触地面或在适宜的条件下能分蘖新芽，便形成了新的个体2。1.1.2 铁皮石斛的药用价值石斛在我国历史上是一种重要的中药材，一直沿用于药用开发领域，研究发现石斛的有效药用成分主要是多糖和生物碱类物质。石斛中提取的两种菲类化合物是有抗人体肺癌、卵巢腺癌和前髓细胞白血病的作用3。近些年备受关注的石斛多糖也具有显著的免疫增强活性和抗癌、防癌、抗衰老、抗辐射等多种功效4,而铁皮石斛具有抗癌和提高人体免疫力的功能，有试验证实，铁皮石斛多糖能促进免疫系统淋巴细胞产生抑制因子，抵消环磷酰胺加入所引起的外周白细胞的剧烈下降，是一种很有价值的中药类免疫增强剂，在临床及中药复方中，铁皮石斛被广泛应用56。铁皮石斛既是我国名贵中药，也是美丽的观赏兰花，具有很高的药用和经济价值，其需求量逐年增加。在我国的76种石斛属植物中，有近40种作药用，且不少药用石斛品种长期出口7。但是近年来由于环境污染和大量掠夺性采挖，铁皮石斛赖以生存的野生生境遭到严重破坏，资源量骤减，已被列为中国濒临灭绝的三级保护植物，严禁采挖，另外由于铁皮石斛在自然环境下生长缓慢，人工栽培的铁皮石斛资源远远不能满足药材市场的需求。巨大的供需逆差和昂贵的价格导致该药材市场混乱，假冒伪劣泛滥，其主要原因是生产时间长、难度大、产量小、投资回报周期长，传统的生产方式不宜规模化生产，导致人工栽培成本远高于采收野生石斛，因此为满足中药发展的需求，人工栽培铁皮石斛以扩大铁皮石斛的产量显得十分重要。所以，改进组培+温室/大棚栽培的现有生产模式，开发一种能够缩短栽培周期、控制药草质量的新型生产模式将促进铁皮石斛人工栽培标准化、规模化、产业化发展，利用人工光型密闭式植物工厂技术明确铁皮石斛的生长发育与环境要素之间的动态关系，有效地调节人工光可控环境下铁皮石斛的生长发育、提高其药草品质。1.1.3 光照环境对铁皮石斛生长发育的影响光照是影响植物生长发育的重要生态因子之一：是植物进行光合作用的能量来源，影响组培苗光合作用和生长的内在因素。光环境因子包括光照强度、光周期、光质三个因子，这三个因子都与组培苗的生长发育有着密切的关系。光照时间影响植物的光合作用和形态建成。根据植物光照时间可把植物分为长日照植物、短日照植物和中性植物。光照时间越长越能促进生长发育的植物属于长日照植物，如萝卜、菠菜等。光照时间越短越能促进生长发育的植物属于短日照植物，如水稻、玉米等；对光照时间不敏感的植物属于中性植物，如番茄、月季等；还有一类植物称为中间植物，它们只有在最适的光照时间下才能保持旺盛的生长速度，其他光照时间下则会抑制其生长。现阶段的研究中，对石斛栽培的光照时间几乎设置为12小时，少有人对石斛生长的光照时间长短进行研究，有待进一步研究。因此，了解铁皮石斛对光照时间的需求规律和植物在不同光照强度下的生理变化，找出铁皮石斛生长所需的适宜光照强度范围，在铁皮石斛的的栽培过程中选择适宜的光照时间和强度，对促进铁皮石斛的生长和品质提高有重要意义。光照强度对植物生长的影响主要是通过影响植株的光合作用，进而影响到有机物的积累，而有机物是植物生长的物质基础；而且光对植物的生长有抑制作用，这与光对生长素的破坏有光。因此，若光照强度较低，光合产物积累较少，对植物的生长产生了抑制作用；若光照强度过高，可能出现光抑制现象而降低光合速率，造成植物生长速率下降，甚至死亡。光照强度对石斛新生茎、新生叶干物质重量的影响：强光照条件下,石斛可以充分利用光能,加强它的光合能力,促进了石斛生长发育,石斛的新生茎和新生叶生长旺盛，它的干物质重量显然要比弱光照高，光照强度对金钗石斛根部生长的影响：弱光照条件下,虽然石斛地上部生长缓慢,但它的地下部根系生长速度较快,它的根系的干物质量,弱光照比强光照多。所以石斛在生长过程中必须保证一定的光照强度,才能有利于石斛吸收营养液和木屑培养基质中的氮素,充分利用光能进行光合作用,促进石斛生长发育而达到生长旺盛,积累更多的干物质,提高它的产量。光照强度对铁皮石斛叶绿素的影响：叶绿素从光中吸收能量并被用来将二氧化碳转变为碳水化合物。因此，叶绿素是与光合作用 (Photosynthesis) 有关的最重要的色素。光强过强，叶绿素会受到光氧化而被破坏；光强太弱会影响叶绿素的形成，使植株呈黄白色，叶片发黄。在环境因素基本相同的情况下，铁皮石斛组培苗的叶绿素a、b 及叶绿素总含量随着光照强度的增强而显著增加，同时叶片变小，叶色加深。同样,光照强度影响石斛吸收木屑培养基质中氮素，石斛除了从营养液中吸收氮素外,还从木屑培养基质中吸收氮素, 由于强光照石斛吸收营养液和木屑培养基质中的氮量均高于弱光照,所以石斛在强光照条件下吸收总氮量也明显高于弱光照。另外，铁皮石斛光的光合特性是受光照强度影响的一个光生物化学反应，净光合速率是反映铁皮石斛组培苗生长最重要的指标。在一定范围内,光合速率随光照强度的增加而加快，但光照过强会抑制光合作用，致使光合速率下降、光合产物减少，并最终影响药用有效成分的含量。然而在自然界中，光照条件随纬度、海拔高度、坡向、昼夜和季节变化的影响而不同，在自然光下, 随着光强的增加, 石斛发生严重光抑制；在室内进行植物栽培和组织培养时，光照条件可以人工控制，为保持旺盛的生长速度调节最适的光照时间和光照强度8。1.2 国内外研究现状国内很多专家学者的研究都表明光照强度对铁皮石斛的生长有很重要的影响作用，适宜的光照强度能够促进铁皮石斛的快速生长和繁殖，从而能够缩短生长周期降低成本，获得人工种植的最大收益。丑敏霞等（2000）研究了光照强度对铁皮石斛生长的影响：不同光强下，石斛鲜重的增长大多以25处理更快，繁殖力则以20与25处理较高；各光强下的MDA含量随温度升高而先降后生，且均以25最低20。证明了高温和弱光照条件有利于石斛的株高生长，会使石斛茎杆相对纤弱，利于产量和质量提高，当生长在较高的温度范围内时需要较高的光照强度，保证较高的光合强度供给生长的需要。张世筠等（1987）也说明了石斛是喜温植物，在保证光强和相对湿度的条件下对高温具有一定的耐受力。徐云鹃等 (1993) 对霍山石斛的光合特性进行了研究，认为其生长要求低光强和散射光，石斛的生长需要半阴半阳的气候环境。据查资料石斛的光呼吸和暗呼吸相等, 两者共占1/2 总光合, 而一般植物的呼吸占总光合的1/101/20。由此可见, 石斛同化物被呼吸消耗较多, 影响积累, 因而生长慢, 生物产量低, 这也许是石斛净光合速率低的主要原因。此外, 从石斛生长的潮湿、背光的野生环境来看, 其对光的需求是长期系统发育的结果, 属阴性植物对光的反应。这种低光照需求也是造成光合作用低的原因之一20。西南农业大学生理生化实验室及华南师范大学兰花中心有关人员研究了光照强度对石斛生长和繁殖、叶绿素含量、净光合速率、呼吸速率及可溶性总糖含量等的影响24。研究表明，光强对石斛生长的影响表现在增高和增重两方面，就光照强度为80 molm-2s-1和320 molm-2s-1、640 molm-2s-1相比较茎杆、叶片都受光照强度影响，证明了320 molm-2s-1是较适宜的光环境。叶绿素含量随光照强度的增加而先增后降。净光合速率随光照强度的升高也先升后降, 与叶绿素含量高低呈正相关，呼吸速率则随光强升高而升高。推测高光强下(如640 molm-2s-1) 石斛净光合速率的降低可能是高光呼吸作用所致。高光照强度有利于石斛可溶性糖的合成, 而低光照强度有利于蛋白质的合成。各种光强下的暗呼吸速率均随温度升高而增大。在不同的光照条件下，石斛生长的适宜温度均在25左右。光温处理引起石斛生理生化过程明显的相应变化表现出；高温和弱光照条件有利于石斛的株高增长，但不利于产量和质量提高。蔡永萍等 (2005) 对霍山石斛叶片光合速率和叶绿素荧光参数的日变化进行了研究2。研究表明,霍山3种石斛的光饱和点为270400 mol m-2s-1，光补偿点为 4050 mol m-2 s-1，光饱和点低，光补偿点和CO2补偿点较高，净光合速率、表观量子效率较低，石斛为阴生植物响应型。研究指出，霍山3种石斛光合作用的适宜光强在400 mol m-2s-1。苏文华等 (2003) 对铁皮石斛叶片光合作用的碳代谢途径进行了研究18。在晴天和阴天条件下分别测量铁皮石斛叶片24h中CO2吸收的动态过程以及CO2吸收对光照强度和温度的响应。研究发现，光照强度在500 mol m-2s-1时CO2的吸收速率是最高的。当光照强度超过500 mol m-2 s-1时，随着光强的增加CO2吸收速率开始下降，气孔导度也明显下降，表现出光抑制现象。CO2的吸收速率除了光照强度的影响外还受温度的影响。在500 mol m-2 s-1的光照条件下，20时CO2的吸收最多；但在夜里无光的条件下，25出现CO2吸收最大值，超过25时CO2吸收速率迅速下降。研究还指出，铁皮石斛为兼性CAM植物，随着环境条件的变化，其光合作用在景天酸代谢途径（CAM）与C3途径间变化。同时他们也对金钗石斛的光合途径进行了研究，发现金钗石斛表现出与铁皮石斛相同的途径，对温度和光照强度的响应也相似。此外，西南农业大学张明等 (1999) 应用32P研究了温度和光强对金钗石斛吸收磷素的影响24。结果表明,25和40处理植株吸磷量分别为10处理的2. 3和2. 5倍。25处理, 茎中32P 放射性比活度最高。在中度光(20,000 Lux) 和高光强(50,000 Lux) 下，植株吸磷量较弱光(5,000 Lux) 相比分别增加74%和23%。在中度光下,茎中32P放射性比活度最高。磷是药用植物必需营养元素之一，是许多重要有机化合物的组成成分，并积极参与各种代谢过程, 被称为“能量元素”。因此,促进药用植物对磷素的吸收,具有重要意义。温度、光强和磷素吸收关系密切,在所采用的几个处理中,最适宜金钗石斛吸收磷素的温度为25,光强为中度光(20,000 Lux)。中国农业大学 （2005-2007）在人工光型密闭式植物工厂中，针对光照强度对铁皮石斛组培苗生长发育的影响进行了研究，但是该研究在光照环境对铁皮石斛栽培苗的生理、生长代谢的影响方面没有作进一步研究。该研究取鲜重约300 mg的铁皮石斛单腋芽作为外植体在温度241、湿度655%、光照时间12 h/d、及光期CO2浓度80050 mol mol2的环境条件下，设置光照强度为37、68、92、120 mol m-2 s-1的4组试验区。在人工光型密闭式植物工厂中培育92d后，对培育后的组培苗的生理和生长指标进行检测，研究结论显示铁皮石斛组培苗的生长发育和生理活性在光照强度为68 mol m-2 s-1时最佳，超过92 mol m-2 s-1时呈现明显的光抑制; 多糖含量随着光照强度的增强而增加，超过92 mol m-2 s-1时呈下降趋势，但是68和92 mol m-2 s-1光照强度试验区的多糖含量没有显著性差异。研究结论指出铁皮石斛组培苗在人工光型密闭式植物工厂内培育的适宜光照强度60-70 mol m-2 s-122。国外对石斛的研究，主要侧重于观赏石斛，如通过转基因技术改变石斛的花色等6。近年来，石斛作为观赏植物在世界上发展迅速，已成为新兴的独立产业。但是观赏石斛的栽培技术与药用石斛的差异较大，依靠国外的石斛生产来满足我国药用石斛的大量需求是十分不实际的，因此只有依靠我们自己的研究，弄清楚药用石斛的生理特性，探讨药用石斛生长的适宜环境，使其像观赏石斛一样走上产业化发展的道路，解决药用原材料缺乏的矛盾。1.3 研究内容和技术路线1.3.1研究内容为此，本课题通过测量在人工光型密闭式植物工厂中的人工光可控环境下不同光照强度和光照时间对铁皮石斛栽培苗生长发育、光合速率、叶绿素荧光特性的影响，并与在温室的自然光栽培的相对比，明确铁皮石斛栽培苗在人工光可控环境下对光环境的响应机制，从而为确定铁皮石斛在人工光下栽培的适宜光照强度和光照时间提供理论依据和数据支持。1.3.2 技术路线查阅文献并确定研究目标前期预备实验并确定试验方案进行不同光照强度与光照时间下栽培的铁皮石斛对比试验，确定适宜的光照条件明确光照环境对铁皮石斛生长发育的影响撰写毕业论文，准备毕业答辩进行铁皮石斛在不同光照条件下的荧光特性对比试验图1-1 技术路线Fig. 1-1 Flowchart on this study.26中国农业大学学士学位论文 第二章 光照强度与光照时间对人工光下栽培的铁皮石斛的生长发育的影响第二章 光照强度与光照时间对人工光下栽培的铁皮石斛生长发育的影响2.1 前言光是植物光合作用的动力，是影响苗生长的重要因素，也是形成叶绿素、叶绿体及正常叶片的必要条件。光照时间影响植物的光合作用和形态建成，能够调节光合酶的活性与气孔开度，可直接制约着光合速率的高低。光照时间与纬度、坡向、季节有密切关系, 如在一定范围内,随纬度的升高, 日照时间相应延长,对于药用植物的某些有效成分,延长光照时间对提高其含量有积极的影响，因此，不同地区人工控制光照时间，成为提高药用植物的有效成分含量的途径之一，而现阶段的研究中，对石斛栽培的光照时间几乎设置为12h，少有人对石斛生长的光照时间长短进行研究。绿色植物通过光合作用制造有机物,经过植物体内的运输和转化产生各级代谢产物,因此,光照对有效成分的形成和积累是必须的。根据植物对光照强度的要求不同,可将其分为阳生植物、阴生植物和中间类型的耐阴植物。阳生植物物要求充足直射日光,才能生长或生长良好,阴生植物要求适宜生长在荫蔽环境中,在完全日照下生长不良或不能生长9，而光照对阴生植物而言，成为了决定其分布、生长发育和有效成分含量的重要条件。对于光照强度，过去采用照明领域的光照强度进行度量，单位为lx(勒克斯)。这是在380-760的可见光范围内，以对人眼视觉效应最强的555nm光为基准，按人眼的视觉效应对不同波长的光区别计算进行度量的。进一步研究表明，植物光合作用强度与所吸收的光量子数量有关，因此更合理的单位是单位时间、单位面积上照射的光合有辐射范围的光量子数，称为光合有效光量子流密度（Photosynthetic Photon Flux, 简称PPF）,单位为mol m-2s-1。植物的光合作用是CO2的排放过程，这两种生理活动是同时进行的，所以光合器官叶片内外的CO2交换速度也就是等于光合速率减去呼吸速率，称为净光合速率，其中的呼吸速率则是暗呼吸速率和光呼吸速率的总和，净光合速率常用单位mol m-2s-1表示。光照强度不仅与组培苗的生长发育有着密切的关系，它也是影响植物光合速率的重要因素。当光照强度为0时，净光合速率等于当时的暗呼吸速率；当光照强度的增强，净光合速率逐步增加，当净光合速率为0，此时的光合速率等于呼吸速率，称此时的光照强度为光补偿点；随着光照强度的增强，当净光合速率不再增加时，这个现象叫光饱和现象(Light Saturation)，此时的光照强度叫做光饱和点 (Light Saturation Point)。当光照强度减弱时，光合速率随之降低，当光照强度减弱到光合作用所吸收的CO2等于呼吸作用释放的CO2时，这时的光照强度成为光补偿点 (Light Compensation Point)。当光照强度超过光饱和点时，植物会引起抑制作用。所谓光抑制即为植物在生长发育过程中，光照过高，超过光和机构作用所能吸收的利用的光能，导致植株光合活性降低的现象。若植物处于光补偿点之下，有机物消耗多于积累，作物生长缓慢，严重时会导致植株枯死。因此，有效地调控植物适宜的光照强度范围,能促进植物的快速健康生长。2.2 材料与方法2.2.1 植物材料本试验选用位于浙江省金华市的浙江枫禾生物有限公司于2008年4月中旬提供的在组培苗驯化后在温室培育了1-2年铁皮石斛栽培苗。2.2.2 试验区设置与环境条件（1）试验区设置本试验采用了培育1-2年的铁皮石斛苗作为实验材料，在双层保温玻璃温室培育的作为自然光对照试验区，以荧光灯为人工光照源培育的设置了光照强度为60、90、120、150 mol m-2 s-1和光照时间为9 h d-1和12 h d-1的8个人工光试验区。人工光照试验区的环境条件为温度241、相对湿度605%，CO2浓度未控制。温室内采用风机和内、外遮阳网进行粗放的环境控制。各试验区的铁皮石斛苗培育16周后各取每区8钵植物对其生长发育和光合特性指标进行测量。表 2-1 光照强度和光照时间试验区设置Table 2-1 The treatment design of photosynthetic photon flux and photoperiod光照强度 光照时间9（h d-1） 12（h d-1）60 mol m-2s-190 mol m-2s-1120 mol m-2s-1150 mol m-2s-1对照区 H1)9-PPF2）H9-PPF90H9-PPF120H90-PPF150CK3) (自然光)H12-PPF60H12-PPF90H12-PPF120H12-PPF150注：1) H代表光照时间（Photoperiod (h d-1), H）；2)PPF代表光合有效光量子流密度（Photosynthetic photon flux，PPF）；3）CK表示在自然光下（温室）栽培作为对照区。（2）共通的栽培条件1) 试验地点：中国农业大学水利与土木工程学院5楼温室和密闭式植物工厂参观间。2) 栽培容器：10*12 cm的营养钵3) 栽培基质：松磷（粒径5-10 mm）松磷（3-8 mm）：松磷粉末：蛭石：木屑按照 1:1:1:1:0.5进行混合，加水高温发酵后使用。4) 栽培时间：16周（2009年2-5月）（3）肥水管理铁皮石斛自然生长速度较慢，所以要提高铁皮石斛生长速度，必须适时适量地提供养分。移栽后前2周用喷雾,保持叶面湿润状态,切勿浇水。移栽2周后浇水,按照保持基质湿润的原则，每周施1次营养液，每2d底面灌水一次。本试验用的营养液根据山崎园艺草莓配方修改后配备（表2-2），按照1：500比例稀释后浇灌。表 2-2 铁皮石斛人工栽培用的营养液配方Table 2-2 Nutrient solution for D. officinale cultivation.营养液配方中化学肥料的浓度（g/L）硝酸钙硫酸镁磷酸二氢钾硝酸铵0.2050.060.1360.082.2.3 测量参数及方法在不同光照时间和不同光照强度下进行管理20周后测量各实验区中铁皮石斛栽培苗的生长参数如有株高、茎粗、茎节数、叶片数、干物率，生理参数如有叶绿素含量和净光合速率的变化。测量过程及需使用的仪器有如下：1）形态参数的测量铁皮石斛栽培苗的株高用直尺测量，茎粗采用游标卡尺(0-150 mm）测量，鲜重用测量天平（BP221S, Sartorious Inc., Germany）称量后，放于80的烘箱中烘72小时后，再用同一天平称量其干重。叶片的活体叶绿素含量由便携式叶绿素仪（SPAD-502，日本美能达公司，日本）测量叶绿素相对含量SPAD值代替。2）测量叶绿素含量根据朗伯-比尔定律，有色溶液的光密度值与其中溶质浓度成正比，即：=k，为比例常数。当溶液浓度以白粉浓度为单位，液层厚度为1cm时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的光密度等于各组成份在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的相加性。本实验中，欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素、的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的光密度值，并根据叶绿素、在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素、时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光选择叶绿素在红光区（550 nm）的最大吸收峰。已知叶绿素、在1：1的乙醇-丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663和645 nm，又知在波长663 nm下，叶绿素、在该溶液中的系数分别为82.04和9.27，在波长645 nm下分别为16.75和45.60，根据加和性原则列出以下关系式：D663=82.04Ca+9.27Cb - 式 1-1 D645=16.75Ca+45.60Cb- 式 1-2 式（1-1）、（1-2）中D663和D665为叶绿素溶液在波长为663 nm和645 nm时的光密度，Caa、Cb分别为叶绿素a、b的浓度，以mg dm-3为单位。解方程组（1-1）和（1-2），经单位换算后得： Ca=12.72D663 -2.59D645 -式 1-3 Cb=22.88D645 -4.67D663-式 1-4 将Ca与Cbb 叶绿素总量CTCT= Ca+Cb=20.29D645+8.05D663-式 1-5根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度值，计算出提取液中各色素的含量（图 2-1）。本实验中叶绿素含量测定选取与测定光合作用相同位置和发育阶段的叶片0.2g，剪碎后加入1：1的乙醇-丙酮混合液中，定容至25 ml，在黑暗中常温浸提72小时然后将提取液摇匀，倒入干净的比色皿中，用分光光度计（UV-3150,Shimadzu Co., Japan）分别测量其在663 nm，645 nm的吸光度值D645，D663，按照Arnon法的修正公式计算。叶绿素a（mg g-1）=CaV/W-式 1-6叶绿素b（mg g-1）=CbV/W -式 1-7叶绿素总量（mg g-1）=CTV/W-式 1-8其中V表示提取液的体积（L），W表示溶解的叶片的重量。图 2-1 叶绿素含量的测量Fig. 2-1 The measurement status of chlorophyll content. 3）光合速率的测定光合作用是绿色植物利用光能将其所吸收的CO2和水同化为有机物，并释放出氧气的过程。本试验通过测定CO2的吸收率来计算光合作用，即测定植物在生长过程中，CO2浓度随时间下降量，这个下降量即为某段时间内植物光合作用所吸收的CO2量，因为由于铁皮石斛的叶片较小，用便携式光合仪（LI-6400R, LI-COR Inc., USA）（图 2-3）的荧光叶室进行测量。在不同光照环境实验区，随机选取8片功能叶，每片待测叶片均取自不同营养盆,测量其净光合速率、蒸腾速率、气孔导度如下：CPhoto光合作用速率 (mol CO2 m-2 s-1)Cond气孔导度 (mol H2O m-2 s-1)Ci胞间CO2浓度 (mol CO2 mol-1)Trmmol蒸腾速率 (mmol H2O m-2 s-1)测量步骤：1. 按照测量计划，选择样本叶片。2. 检查化学药品，硬件连接，安装荧光叶室和CO2注入系统。3. 开机，选择荧光叶室 ( 代号:6400-40 fluorometer) 。连接状态按“ Y ”，进入主菜单。4. 进行CO2和 IRGAs 调零，约需 20-30分钟。将两个化学管都旋至完全吸收位置 (Scrub) ，完全闭合叶室；等待约 20 分钟，参比室和样品室CO2和H2O 会降到零附近，然后进行自动调零。5. 将 Dessicant 化学管拧到完全 Bypass ，将CO2化学管拧到完全 Scrub，将CO2浓度设置为 500 mmol mol，叶室内光强设置为 120 mmol m-2 s-1。6. 建立一个记录文件，等待CO2稳定到设定值，进行空叶室匹配。7. 待空室的photo值变化在0.5 mmol m-2 s-1之内开始正式测量：a) 夹上待测叶片，按第1行，按 F4(Add REMARK) ，输入待测叶片的标记号，回车。b) 等待 a 行参数稳定，b行CO2值波动 0.2 mol mol，Photo 参数稳定在小数点之后一位时读数，按 F1(log)，记录数据。c) 更换另一叶片，按F4，添加remark, 重复ac步骤，进行测量。至少半小时进行一次空叶室匹配。d) 测量结束后关机，并把化学管旋钮旋至中间松弛状态；旋转叶室固定螺丝，保持叶室处于打开状态。图 2-2 铁皮石斛光合作用和荧光特性的测量装置Fig. 2-2 The measurement instrument for photosynthesis and chlorophyll fluorescence of D. officinale.2.2.4 统计处理测量后先对数据进行分析剔除错误数据，再对测量得到的数据求均值、标准偏差，利用Excel进行单因素方差分析（ANOVA）。2.3 结果与讨论2.2.1 光照强度和光照时间对铁皮石斛生长发育的影响各试验区铁皮石斛栽培苗在外部形态上表现出明显的差异，光照时间对铁皮石斛栽培苗的植株形态、分蘖能力和干物质积累有较大的影响(图2-3)。在人工光试验区PPF60栽培苗的叶色浅绿，叶片细长而薄弱、茎杆纤弱、节间距长，同自然光下栽培苗的表现相似；试验区PPF90栽培苗的叶色、茎粗随光强增强而增加；试验区PPF120苗的叶色深绿，叶片肥厚、茎杆粗壮、叶片有呈现轻微的紫色；试验区PPF150栽培苗叶片较小,节间较短，茎粗、株高等各个指标比PPF120都有下降趋势，茎杆和叶边缘呈紫红色，某种生长抑制表现明显（表2-3）。而试验区PPF90和PPF120栽培苗的节间长度、株高和茎粗等综合指标表现较好，表明在这两个光照强度下培养的铁皮石斛栽培苗健壮。H9试验区中栽培苗叶色浓绿、叶片厚实肥大，但分蘖少，植株生长量小，叶片数少；试验区H12中栽培苗的叶片深绿，栽培苗的干物率和茎节数增加较显著，且栽培苗的株高、株数、叶片数、茎粗增长值都相比H9较大，表现出较好的品质，所以，在人工控制条件下，光照时间12 h d-1比9 h d-1更适宜铁皮石斛的人工栽培。在人工控制环境下光照强度从60 mol m-2s-1升到120 mol m-2s-1时，栽培苗的干物率显著增加; 当光照强度为60 mol m-2s-1时，该光照强度无法为栽培苗的光合作用提供足够的能量使得干物质积累受到一定的限制，当光照强度超过120 mol m-2s-1时，光照强度增强对干物质的增加作用不大, 在光照强度为150 mol m-2s-1时，栽培苗的干物质积累速度减慢表明栽培苗的生长已经开始受到光抑制。图 2-3 光照强度与光照时间对铁皮石斛的植株形态影响Fig. 2-3 Effects of photosynthetic photon flux and photoperiod on shapes of D. officinale.表2-3 光照强度与光照时间对铁皮石斛生长发育的影响Table 2-3 Effects of photosynthetic photon flux and photoperiod on growth and development of D. officinale试验区茎节数（个）株高（cm）茎粗（mm）叶片数(个)株数（个）干物率（%）H9 H12H9H12H9H12H9H12H9H12H9H12人工光PPF605.31.31）a2）a3）5.30.6c a6.11.3b b7.01.0a a4.42.5b b5.00.4b a2.51.0c b5.32.1b a3.30.5b b5.70.6a a10.70.5a a11.00.8b aPPF905.80.5a a6.01.6b a6.51.3b b7.31.5a a5.50.8a a5.31.4c b4.01.3b b6.00.8a a3.32.1b b5.82.5a a11.20.5b b12.40.9a aPPF1205.81.6a a6.50.6a a8.22.2a a7.30.9a a6.11.4a a5.71.2a a5.82.4a b6.31.3a a6.02.0a a6.02.8a a14.11.7a a14.60.6a aPPF1505.50.6a a6.30.7a a5.80.8c b6.72.2b a4.90.6b a5.00.7b a5.01.2a b5.03.6b a5.83.5a b501.0b a12.30.4b a12.20.6b aCK(自然光)5.30.6b a7.20.3a a6.10.72a a3.70.2b a720.6a c8.50.72c cANOVA4):PPFNS*H*NS*NSPPFHNS*NS注:1）表示均值标准偏差；2) 字母表示同列不同试验区之间的单因素显著性差异分析结果；不同字母代表有显著性差异(P=0.05)，相同字母表示无显著性差异；3)字母表示同行不同试验区之间的单因素显著性差异分析结果；不同字母代表有显著性差异(P=0.05)，相同字母表示无显著性差异4) ANOVA(Analysis of variance)表示单因素显著性差异分析，*表示差异显著（P=0.05），*表示差异极显著（P=0.01），NS表示没有显著差异。2.2.2 铁皮石斛的光合特性铁皮石斛生长于森林中的散射光较多的弱光环境中，为阴生植物，自然环境下的光饱和点与光补偿点都较低，其组培苗的光饱和点与光补偿点也低于一般植物。从图表可知人工控制环境条件的参观间植物的净光合速率比自然光下栽培的植物的净光合速率高，而在人工控制光照时间为12 h d-1比9 h d-1净光合速率增大，所以人工光栽培优于自然光，而对在环境可控条件下光照时间12 h d-1更适宜铁皮石斛的培养。从试验可以看出，铁皮石斛栽培苗的净光合速率随着光照强度的增加均呈持续增加趋势。当光照强度从60增加到150 mol m-2s-1时，铁皮石斛的光合活性逐渐增强，净光合速率逐渐增加。铁皮数石斛栽培苗的净光合速率在60-90 mol m-2s-1时没有变化，且与自然光对照区持平，当光照强度从120 mol m-2s-1提高到150 mol m-2s-1时，其净光合速率没有变化。无论那种光照强度