探究人唾液淀粉酶的最适PH（碘-淀粉比色法）

探究人唾液淀粉酶的最适PH（碘-淀粉比色法）欧奇灿 学号：201680075 临床医学“5+3”2班3组摘要：唾液淀粉酶是由唾液腺分泌的一种水解酶，可作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等-1,4-葡聚糖等，属于-淀粉酶的一种。酶学与医学联系紧密，测定酶的最适pH，有利于我们把酶学知识运用于临床诊断与应用治疗。本实验尝试用碘-淀粉比色法测定唾液淀粉酶最适pH，加深对酶学知识的理解。关键词：缓冲液；唾液淀粉酶；分光光度计 前言：人体内各种代谢反应，都离不开酶的催化作用，酶量的改变以及酶活性的改变都会引起人体化学反应的异常或紊乱，因此酶在人体内是否能发挥正常活性关系着人体内环境的稳定。而pH是影响酶活性的一个重要因素，因此，通过探究实验探究人唾液淀粉酶的最适pH，不仅可以检测我们的生物化学实验操作能力和探究能力，也可以加深我们对酶学知识的理解。正文:【实验原理】酶是具有高效催化能力的生物大分子物质，其化学结构上具有许多极性基团，在不同酸碱环境中，这些基团的解离状态不同，所带电荷也不同。只有当酶处于一定的解离状态，才能和作用物结合。因此，溶液的pH对酶活性影响很大。若其他条件不变，酶只有在一定的pH范围内才能表现出催化活性。在某pH时，酶催化活性最大，此pH称为酶作用的最适pH。当溶液的pH偏离最适pH时，酶活性降低，甚至失活。淀粉经唾液中淀粉酶的水解，生成糊精和麦芽糖。在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其颜色深浅与空白管颜色的差值和唾液淀粉酶的活力成正比。在底物过量的条件下，相同时间内，在温度、酶浓度相同、pH不同的条件下，越接近最适 pH的反应体系中酶活性越高，消耗淀粉的量越大，剩余淀粉与过量碘液生成的颜色越浅，吸光度越小。本实验利用分光光度计测出各管的吸光度后，取处于降低与升高趋势之间的较小吸光度范围对应的 pH 值即为唾液淀粉酶的最适pH。【仪器与试剂】仪器材料 ：试管架 ，试管，烧杯，一次性纸杯，移液枪，刻度吸管，洗耳球，胶头滴管，pH试纸，恒温水浴箱，分光光度计试剂药品：2.5g/L淀粉溶液，碘液，0.2mol/L NaH2PO4、0.2mol/LNa2HPO4，唾液，纯净水【实验步骤】1、唾液的获取纯净水先漱口12次，然后含一大口水约2分钟，其间做咀嚼运动，然后将水和唾液一同收集至烧杯中。【1】2、不同pH缓冲液的配制【2】取8支试管，编号 ，按表1-1操作，再加蒸馏水至10mL。用pH试纸检测各缓冲液pH。（pH7.0的缓冲液配制2次） 表1-1 不同pH缓冲液配制 （用量：ml）试管12345678 9pH5.86.06.26.4 6.66.87.07.27.40.2mol/LNa2HPO40.4000.6150.9251.3251.8752.4503.0503.6004.0500.2mol/LNaH2PO44.6004.3854.0753.6753.1252.5501.9501.4000.950H2O 5.03、淀粉用量的确定 取5支试管，按表1-2淀粉用量进行配制，之后比较选出适当颜色深浅的那支试管。【3】 表1-2 淀粉用量的确定 (用量：ml)试管1 2 345pH 7.0缓冲液0.90.90.90.90.92.5g/L淀粉液0.050.10.2 0.3-稀释10倍唾液0.10.10.10.10.1 混匀，37水浴5min后每管加2滴碘液H2O 2.95 2.9 2.8 2.7 3.0混匀，观察现象，选颜色适中一支，并记录淀粉用量实验结果：加碘液后加水，1号试管（-）颜色淡紫近无色，2号试管（+）颜色淡蓝色适中，3、4试管（+）蓝色较2号深，5号淡黄近无色（-）。即确定2.5g/L淀粉用量0.1g。4、酶液稀释倍数确定【4】 取4支试管，按表1-3进行配制。 表1-3 酶液稀释用量 （用量：ml）试管1234稀释倍数酶液H2O51.04.0100.54.5150.44.6200.254.75 再取5支试管，按表1-4进行配制。 表1-4 酶液稀释倍数确定 （用量：ml）试管12345稀释倍数5101520空白酶液0.10.10.10.10.1pH 7.0缓冲液0.90.90.90.90.92.5g/L淀粉 0.1 （由步骤3确定） 混匀，37水浴5min后每管加2滴碘液H2O 3 3 3 3 3混匀，观察现象，选适中一支，并记录稀释倍数【5】实验结果：1（近）、2（+）、3（+）、4（+）、5（+）号试管蓝色颜色依次逐渐加深，2号淡蓝色适中，即确定酶液稀释倍数为稀释10倍。5. 最适pH的确定取9支试管，取步骤2的1-9管的缓冲液，根据表1-5进行配制。 表1-5 最适pH的确定 （用量：ml）试管123456789pH5.86.06.26.46.66.87.07.27.4pH缓冲液0.90.90.90.90.90.90.90.90.92.5g/L淀粉0.1（由步骤3确定）某稀释倍数酶液（步骤4确定）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1 混匀，37水浴5min后每管加2滴碘液 H2O 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，用蒸馏水调零测定A660吸光度A660 0.183 0.212 0.359 0.323 0.238 0.206 0.192 0.262 0.263 用肉眼观察时，也能观察出1、2、5、6这几支试管颜色明显比其他的浅，而且接近浅紫色而非浅蓝色，可能是淀粉已经被水解较多引起淀粉不足而显示浅紫色。6、 数据记录和整理 以A660为纵坐标，pH为横坐标作图，找出唾液淀粉酶的最适pH值【6】。【实验注意事项】【1】唾液的获取在适宜时间后将纯净水和唾液一同放置于事先准备好的烧杯中即可，在实验过程中应注意酶的失活，为了防止此现象发生，如有条件可将此液体置于冰水中冷却。【2】本实验中准确配制相关溶液非常重要，溶液配制出错会极大的影响实验结果，为了避免这种情况，可采取小组明确分工，采用精细仪器，提高实验操作能力等手段。【3】如果底物太少，与碘液几乎无现象，不能判断实验结果；如果底物过多，碘的颜色太深，又会掩盖实验反映出来的现象，所以要取浓度适中的底物浓度。【4】本实验中测定酶的稀释倍数，是为了找出酶的最适稀释倍数，在该状态下，酶催化的作用最好，实验现象相对明显，有利于实验结果的测定。【5】在确定最适稀释倍数时，若所有试管颜色都是蓝色或黄色或颜色梯度不明显，可以适当扩大或减少稀释倍数重新选取。【6】若绘图时出现了数据偏差较大的点，要综合分析原因，并予以取舍，原则上绘图应不少于5个点。【实验结果与结论】以A660为纵坐标，pH为横坐标作图，如下：制作人：王茜、韦季伶、唐司婷、 曹桂青、欧奇灿仪器：V-1100D型可分光光度计日期：2017年5月8日 实验结论：根据实验图像，处于大多数实验数据降低与升高趋势之间的较小吸光度对应的pH为7.0。因此本实验人唾液淀粉酶的最适pH为7.0，在正常的唾液淀粉酶活性范围。值得说明的是，第1组pH为5.8缓冲液相对应的吸光度值0.183在整个实验中已经严重偏离正常值，实验误差可能较大，比如pH为5.8的缓冲液配制出错或者pH不准(用pH试纸粗测缓冲液pH时pH为6.47.2的缓冲液的pH比较准确，其他试管的pH偏差较大可以支持这个分析），也有可能是加碘液的时候该试管加的碘液相对少了如粘在试管壁没和溶液混合或者加碘液的时候每一滴的量不一致。因此，第1组数据作为逸出值处理，不在绘图中出现。至于结果所得的图不是预料的标准形图，在保证pH为7.0是最适pH这个前提下，误差数据就出现1、2两组，结合上述分析，极有可能是出现了操作误差甚至错误，但是当时回忆相关操作时并没有想到哪里出了问题，所以无法定论。【实验误差分析】1、 不同pH缓冲液的配制时每种缓冲液的pH可能不严格对应，给最终结果带来较大的误差。在我们实验过程中，因移液枪不够，所以配制缓冲液要多次移液，用pH试纸粗测缓冲液pH时pH为6.47.2这几支两种母液配比合适的缓冲液的pH比较准确，其他试管的pH都有一定偏差。2、 进行淀粉用量和酶稀释倍数确定实验时，水浴加热后再加碘液后，有些试管颜色肉眼难以分辨，加水稀释后如果加水过多又会稀释过度，因此带来了颜色判断上的困难，从而带来实验误差。在本实验中，发现原来设定加水稀释时的水的量就过多，从而导致了稀释过度，后来临时改了水的用量，颜色对比才比较明显。3、 本实验没有进行最适反应时间的探索，也可能给实验带来一定的系统误差。同时，由于滴加试剂的先后顺序不同，导致各个试管的加热时间和酶促反应时间可能存在些许差别。4、 本实验是小组合作实验，多人共同操作，由于不同同学的操作习惯、实验素养不一，加上关键仪器移液枪数量有限，可能存在一定的“混乱”，如漏加、多加、少加某些试剂，或者在滴加溶液时不慎把溶液滴在试管壁上，在配置不同pH缓冲液和测定唾液淀粉酶最适pH中加入试剂时未混匀，都会造成一定影响。5、不同人群的唾液淀粉酶存在个人差异，最适pH也相应地存在一定差异。而且本实验时间较长，酶活性可能会有变化，因此每一步的酶活性可能会有所区别，影响结果。结语：正如实验指导老师所言，探究实验重在实验过程中的发现问题和解决问题，能出结果最好，不能也不是非常要紧。我们小组本次探究实验中勉强可以得出结果，但是更重要的是从这次实验中对“实验”有了更多理解。实践是检验真理的唯一标准，实验则是验证理论的重要途径，近现代很多重要理论都是通过实验去推翻或者证明