（无机化学专业论文）磁性纳米颗粒固定化纤维素酶的研究.pdf

摘要 摘要 本论文利用改进后的还原沉淀法制备了f e 3 0 4 纳米粒子 并对其粒径和磁学 性质进行了表征 用合成的分散性比较好的f e 3 0 4 磁性纳米溶液为载体 在碳化 二亚胺的活化作用下对纤维素酶的固定化进行探讨 透射电镜表明纤维素酶的固定对磁性微粒的结构和尺寸没有明显的影响 由 傅立叶红外谱图以及固定化酶的多次重复使用验证了纤维素酶在磁性微颗粒上 的固定 通过改变碳化二亚胺的用量 温度 p h 值 固定时间等条件确定了最佳的 固定化工艺条件 在一定条件下催化水解羧甲基纤维素钠得到葡萄糖 用d n s 分光光度法测定游离纤维素酶和固定化纤维素酶的活性 结果表明固定条件对固 定化纤维素酶的活性有影响 固定化的最佳条件是在超声波作用下 温度在0 4 范围内 p h 值在4 5 5 2 的范围内 碳化二亚胺浓度为3 7 5 4 o m g m 1 的条 件反应3 0 m i n 研究了磁性纳米固定化纤维素酶的催化作用的最适温度及p h 值 并与游离 酶催化作用的最适温度和p h 值进行比较 结果表明 磁性纳米固定化纤维素酶 的催化作用的最适温度与自由酶相同 都是6 0 c 其催化作用的最适p h 值4 5 也与自由酶相同 但在p h 值3 9 4 5 5 的范围内都有很高的活性 使其适用p h 值 范围有所扩大 从而拓宽了纤维素酶的使用范围 本文还研究了超声波对磁性纳米固定化纤维素酶催化活性的影响 结果表明 在一定功率范围内超声波对该固定酶的催化有促进作用 并且这种作用的大小与 超声波功率的大小有关 本实验所取的功率中 功率为6 0 w 时的促进作用最大 功率为9 0 w 时的作用最小 另外 磁性纳米固定化纤维素酶还有良好的热稳定性 贮存稳定性 利用磁 场作用可以方便地回收固定化纤维素酶 其重复使用性也较好 在重复了利用十 次后 固定化纤维素酶仍能保留初始固定化活性的8 6 但是相对于等量的游 离纤维素酶 固定化酶的活性有所下降 关键词 磁性纳米颗粒 固定化 纤维素酶 a b s t r a c t ab s t r a c t t h em e t h o do f p r e p a r i n g t h e m a g n e t i c p a r t i c l e s o f f e 3 0 4w i t h r e d u c i n g p r e c i p i t a t i o nw a sp a r t l ya m e l i o r a t e da n dn a n o p a r t i c l e so ff e 3 0 4h a db e e n s y n t h e s i z e d t h es i z ea n dt h em a g n e t i cp r o p e r t i e so fm a g n e t i t ep a r t i c l e sw e r e m e a s u r e d c e l l u l a s ew a si m m o b i l i z e do nm a g n e t i c p a r t i c l e s v i ac a r b o d i i m i d e a c t i v a t i o n t h ea n a l y s e so ft r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y t e m ls h o w e dt h a tt h e s i z ea n ds t r u c t u r eo fm a g n e t i cp a r t i c l e sh a dn os i g n i f i c a n tc h a n g e sa f t e rc e l l u l a s e b i n d i n g n l ea n a l y s i so ff o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d f t i r s p e c t r o s c o p ya n dt h e r e p e a t e du s eo ft h em i ec o n f i r m e dt h eb i n d i n go fc e l l u l a s eo n t om a g n e t i cp a r t i c l e s t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so ft h ei m m o b i l i z a t i o nw e r es t u d i e d t h er e a c t i o no ft h e s e s u b s t a n c e sw e r ec a r d e do u tu s i n gv a r i o u sc o n c e n t r a t i o no fc d i a n dd i f f e r e n tv a l u e s o fp ha n dt e m p e r a t u r et od e t e r m i n et h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fi m m o b i l i z a t i o n t h e a c t i v i t i e so f 行e ec e l l u l a s ea n di m m o b i l i z e dc e l l u l a s ew e r ed e t e r m i n e db ym e a s u r i n g t h ea m o u n to fg l u c o s em a d ef r o mc a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s ei nt h eg i v e nc o n d i t i o n s r e s u l t ss h o wt h a ti m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n sh a ds o m ee f f e c t so nt h ea c t i v i t yo f i m m o b i l i z e dc e l l u l a s e t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fi m m o b i l i z a t i o nw a s t e m p er a t i o n 0 40 c p h4 5 5 2 c o n c e n t r a t i o no fc d i3 7 5 4 0 m g m l a n dt h er e a c t i o nw a si nt h e a c t i o no fu l t r a s o n i c t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e o p t i m u mp hv a l u e s s t a b i l i t i e st oh e a ta n d o p e r a t i o n a ls t a b i l i t yo ft h em i ew e r ea l s os t u d i e da n dc o m p a r e d 析t 1 1t h ef r e e c e l l u l a s e t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fm i ew a s6 0 2 w h i c h w a st h es a m ea st h a to ft h ef r e ec e l l u l a s e n eo p t i m u mp hv a l u e so ft h em i ew a s 4 5 5 a l s ot h es a m ea st h a to ft h ef r e ec e l l u l a s e b u tt h em i eh a dh i g ha c t i v i t yb e t w e e n p h 3 9 4t o5 5 0 w h i c hb r o a d e n e dt h eu s er a n g eo f c e l l u l a s e t h ee f f e c to ft h ei n f l u e n c eo fu l t r a s o n i co nt h ec a t a l y s i so ft h em i ew a sa l s o s t u d i e d t 1 1 ec o n c l u s i o nw a st h a td u r i n gac e r t a i nr a n g eo fp o w e r u l t r a s o n i cc o u l d p r o m o t et h ec a t a l y s i sa c t i o no ft h em e a nt h ee x t e n to ft h i si n f l u e n c ew a sr e l a t e dt ot h e i n t e n s i t yo ft h ep o w e r i nt h i se x p e r i m e n t w h e nt h ep o w e rw a s6 0 w t h eu l t r a s o n i ch a d t h em o s te f f e c t w h i l et h ee f f e c tw a st h el e a s tw h e nt h e p o w e rw a s9 0 w t h em i eh a db e a e rt h e r m a la n ds t o r a g es t a b i l i 移t h a nt h a to ft h ef r e ec e l l u l a s e a n dc o u l db er e c y c l e dt h r o u g hm a g n e t i cf i e l d a f t e rr e p e a t e du s ef o rt e nt i m e s t h e a c t i v i t yr e c o v e r yw a s8 6 c o m p a r e dt ot h ee q u a lf r e ec e l l u l a s e t h ea c t i v i t yo f i m m o b i l i z e dc e l l u l a s ew a sr e d u c e d k e y w o r d s m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s i m m o b i l i z a t i o n c e l l u l a s e 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集 保存 使用学位论文的规定 同意如下各项内容 按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版 并采用影印 缩印 扫描 数字化或其它手段保存论文 学校有权提供目录检索以及提供本 学位论文全文或者部分的阅览服务 学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文 的复印件和电子版 在不以赢利为目的的前提下 学校可以适当复制论文的部分或全部内容 用于学术活动 学位论文作者签名 多堤 2 w o l 年 月2 日 经指导教师同意 本学位论文属于保密 在年解密后适用 本授权书 指导教师签每毒矢舰 学位论文作者签名 雯旋 刺7 j 7 日 妒占年 月矽日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师指导下 进行 研究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的 己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体 均已在文中以明确方式标明 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担 签名 丑孜 6 年 月z 日 第l 章引苦 1 1 课题背景 第1 章引言 纤维素是地球上最丰富的可再生有机物n3 是植物的主要成分 约占其干重 的3 5 5 0 心1 是目前分布最广的天然碳水化合物 每年全球年产量高达4 1 0 6 万吨 我国植物纤维资源也很丰富 仅农业秸杆 皮壳每年就可达4 亿多吨 林 业生产所提供的采伐和加工剩余物也有1 0 0 0 万吨之多口1 纤维素的利用与转化对解决目前世界能源危机 粮食短缺等问题具有十分重 要的意义 但这些资源目前绝大部分没有得到很好的利用 对纤维素资源的利用 不到地球上总贮量的0 5 h 1 研究更为有效地转化和利用这一丰富的资源已成为 世界上许多国家十分关注的重要领域之一璐1 纤维素酶是能降解纤维素生成葡萄糖的一种多酶体系 对纤维素酶的研究近 十多年来有很大发展阳 纤维素酶在环境保护方面也有着非常重要的意义n 刮 工业 农业与生活废 料中 纤维素的含量占相当大的比重 在制浆造纸 食品发酵等轻工业部门 会 产生大量的纤维性废渣 这些废渣若直接排入河流 会对水质造成重大污染 而 这些废料一般都经过了一些理化处理 易于酶解 利用纤维素酶处理这些废料 既可防治污染 又能获得有用的工业品 农业上每年所生产的秸秆等废料基本与 粮食本身的重量相当 它们的主要成分也是纤维素 由于淀粉对人体的最终供能 形式也是葡萄糖 因此 如利用纤维素酶充分水解秸秆等农业废料 生产葡萄糖 则相当于在不增加耕地面积的前提下 提高了一倍粮食产量 所以 纤维素酶的 研究将为纤维素的利用开辟一条广阔的途径 酶作用的单一性 无毒性 水溶性 良好的生物降解能力 温和的反应条件 如p h 值 温度 压力 都是酶优于无机催化剂的表现 纤维素酶是自然界用于 降解纤维素生成葡萄糖的一类酶系的总称 它是一种高活性生物催化剂 具有广 泛的应用价值 近几年来主要用于纺织 饲料 酿酒 食品 生物工程和地质钻 井 0 川等领域 我国从6 0 年代起 开始对饲料及制糖用纤维素酶进行研究和利用 近年来又对纺织等行业用纤维素酶进行了研究 取得了一定的进展n 5 目前国内外对纤维素酶的需求量很大 美困 月 麦 r 本等少数国家有纤维 素酶的商品生产 而国内纤维素酶的研究丌发现状还不能满足经济发展的需求 第l 章引高 特别是据资料表明n 副 我国食品级纤维素酶的商品生产尚属空白 食品所用的纤 维素酶均为进口产品 我国只有几十家厂家生产用于纺织业和饲料业的纤维素 酶 年总产量不到4 0 0 吨 我国年需求量大于2 0 0 0 吨 可见该产品供求矛盾较大 对纤维素酶的大量需求也促使人们对纤维素酶进行研究和生产 但是酶的工业化受到很多因素的制约 1 大多数酶都不稳定 2 酶的分离和提纯费用还很高 3 将反应后仍有活性的酶回收技术还不成熟 纤维素酶的酶解效率低是目前有效利用纤维素的主要障碍 与淀粉酶比较相 差2 个数量级以上 进而导致纤维素酶解过程中纤维素酶的用量大 成本过高 约占纤维素糖化工艺的4 0 以上n 制 从而严重阻碍了纤维素酶在纤维素糖化中的 广泛应用 改善来自于所谓的固定化 1 9 7 1 年第一届酶工程会议上固定化酶 i m m o b i l i z e de n z y m e 这个名词被提议确定n7 酶固定化后 既能保持酶的 催化活性又能克服游离酶的一些不足 从而提高酶分子结构的稳定性 能与反应 物分开 有效地控制生产过程 能与产物分开 可省去热处理使酶失活的步骤 简化生产工艺 使食品等产品更好地保持营养成分 固定化酶可在生产中反复连 续使用 提高了酶的利用率n 8 1 9 1 酶的固定化技术为提高纤维素酶的使用效率 减少停工时间 降低酶成本和 投资金额提供了可能性 近十几年来 固定化酶技术取得了很大的发展 固定化 酶不但被广泛应用于食品 医药 精细化工等部门 在临床医学 化学分析 污 水处理以及有机合成等领域 固定化酶的应用也越来越普遍 虽然固定化酶的优点很多 但是固定化酶的大规模应用还很少 其主要原因 是酶固定化的载体材料不是太贵 就是很难用于工业规模 酶固定化对载体材料有很高的要求 如要有良好的机械强度 良好的热稳定 性和化学稳定性 良好的抗微生物特性及与酶的结合能力等 载体材料的价格还 直接影响固定化酶能否真正用到实际生产中 由于难以找到理想的载体材料 再加上酶在固定化过程中会损失部分活力 甚至当固定方法不得当时会损失绝大部分活力等原因 到目前为止也只有十几种 固定化酶应用 因此丌发能用于工业化的同定酶载体有很大的经济意义 第1 章引占 1 2 纤维素酶的组成及降解机制 1 2 1 纤维素酶的组成 纤维素酶是多酶组分的一个复杂酶系 主要来自于真菌和细菌 目前根据纤 维素各酶功能的不同 可认为它由三大类组成渺 2 3 1 葡聚糖内切酶 e n d o 一1 4 一b d g l u c a n a s e e c3 2 1 4 来自真菌简称 e g 来自细菌简称c e n 作用于纤维素内部的非结晶区 水解纤维素分子内的 b 一1 4 一糖苷键 将长链纤维素分子截短 产生大量带非还原性末端的小分子纤 维素 2 葡聚糖外切酶 e x o 一1 4 一b d g l u c a n a s ee c3 2 1 9 1 来自真菌简称 c b h 来自细菌简称c e x 作用于纤维素线状分子末端 水解1 4 一b d 糖苷键 每次切下1 个纤维素二糖分子 故又称为纤维二糖水解酶 3 b 一葡聚糖苷酶 d 1 4 g l u c o s i d a s e e c3 2 1 2 1 简称b g 这类 酶一般将纤维素二糖或纤维寡糖水解成葡萄糖分子 也称为纤维二糖酶 后来也有人对以上的划分作了修正 原先的c e x 酶不只是从非还原性末端对 纤维分子进行切割 也从还原性末端以纤维二糖为单位进行分解哺3 还有人又在 纤维素酶内部将三种酶进一步细分 尽管不同来源纤维素酶分子量差别很大 但其催化区的大小却基本一致 纤 维素酶分子的一级结构都具有类似的结构 即由球状的催化结构域 c d 连接桥 l i n k e r 和纤维素结合结构域 c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n s c b d 三部分组成 纤维素酶的连接部位是一段相当长 高度糖基化的连接肽 此区大多富含脯 氨酸和羟脯氨酸 l i n k e r 的作用可能是保持c d 和c b d 之间的距离 有助于不同 酶分子间形成较为聚集体 不同纤维素酶1 i n k e r 的糖基化程度和糖链也不同 糖基化不是纤维素酶所必须的 人们通过核磁共振技术研究表明大多数纤维素酶 的c d 结构都是三维的 纤维素酶属于糖苷酶 通过化学修饰和动力学等研究证 明了许多糖苷酶中t r p 位于底物结合部位 羧基氨基酸位于催化位点心圳 1 2 2 纤维素酶的降解机制 天然纤维素是吡喃葡萄糖基由b 1 4 一糖苷键结合形成的线性大分子多聚 物 纤维二糖是其基本单元 纤维素分子表面平整 易于长向伸展 加上吡喃葡 萄糖环上的侧基 十分利于氢键的形成 使这种带状 刚性的分子链聚集在一起 成为结晶性的原纤维结构 纤维素原纤维结构为植物细胞壁基本骨架 纤维素分 第l 章 j i 苦 子的大小一般是由聚合度来定义 即一个分子所含的葡萄糖残基数 植物纤维素 聚合度约为1 4 0 0 0 以上 微生物纤维素聚合度约为3 5 0 0 商品纤维素为5 0 5 0 0 0 纤维素主要有结晶区和非结晶区 又称无定型区 两部分 前者结构稳定 微生 物降解十分困难 后者纤维素结构比较疏松很易被微生物降解 纤维素分子链结 晶区有氢键 包括分子链内 链间及分子链与表面分子之间形成的氢键 是造成 纤维素难以被利用的根本原因心4 l 由于纤维素降解是非均相反应 纤维素的三类 酶只有协同作用 才能完成天然纤维素的降心氟 6 1 目前对纤维素酶的作用机制总 体并未弄清乜7 1 尚需进一步研究 但一般降解过程可认为是心4 1 首先外切纤维素 酶的c b d 吸附到不溶性纤维素表面 使结晶结构的纤维素长分子链开裂 聚集结 构解聚 长链分子末端部分发生游离 为纤维素水解酶类的作用提高了可及性和 反应性 从而使纤维素易于水化 之后内切酶作用于经外切酶活化的纤维素 分 解其b 1 4 键 产生纤维二糖 三糖等短链低聚糖 在内切葡聚糖酶 外切葡聚 糖酶和b 一葡萄糖苷酶的协同作用下 纤维素的b 一1 4 糖苷键逐步水解 形成纤 维寡糖和葡萄糖 协同作用的作用顺序不是绝对按各酶的功能也不是简单固定 的 c b h 和e g 都能引起纤维素的分散和脱纤化 因此纤维素的结晶结构被打乱导 致变形 使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间 从而使纤维素孔壁 腔壁和微 裂隙壁的压力增大 水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏 产生部分 可溶性的纤维的微结晶 利于进一步降解 主要作用 次要作用 图1 1 纤维素酶协同水解模型 纤维素酶水解的过程相当复杂 通常将其简化为两个步骤 纤维素s 堕塑丛墅与纤维二糖g 鸟葡萄糖g 一般假设酶和底物先形成中问复合物 中间复合物再分解为产物 是整个水 解过程的控制步骤 4 第1 章引高 1 3 纤维素酶固定化的研究现状 1 3 1 酶固定方法 酶的固定化可以分为物理法和化学法 1 物理法 吸附法固定是物理法中最常用的方法 具有固定化条件温和 易操作 固定 化过程中酶活力损失小等优点 固定化酶载体的微观结构和表面性质对吸附法固 定酶的结果具有关键作用 此外还可以将酶包埋在凝胶 纤维或微胶囊内 使用超滤膜或中空纤维装置 将酶限制在反应溶液内 当酶反应完成后小分子的底物与产物可以通过超滤膜或 中空纤维而离开反应系统汹3 2 化学法 载体表面适当孔径的孔穴分布以及亲 疏水性基团和官能团的有序分布 可 以使酶或其他的生物分子通过氢键 疏水键和盐键等作用力与载体结合 达到固 定化效果 或采用合适的耦合剂将酶固定在某些高分子聚合母体上 用吸附法和离子交换法固定化酶时 酶与载体之间作用力是氢键 范德华力 及离子间的静电引力 当外界条件改变时 酶易从载体上解吸下来 导致酶的泄 漏流失 若选择合适的载体和化学试剂使酶通过化学反应而共价地结合到载体上 由 于共价键能大 用这种方法固定化酶一般不会渗漏 1 3 2 纤维素酶固定化的概况 目前 已经有许多不溶性或可溶性载体被广泛用于纤维素酶的固定化 1 3 2 1 不溶性载体 由于纤维素酶的底物纤维素是不溶性的 长期以来许多人认为要设计一种对 它具有活性的固定化酶是非常困难的 但是近年来一些研究将纤维素酶成功地固 定在各种不溶性载体上 一些纤维性物质具有多孔性 较高的机械强度 对颗粒物质有较大的比表面 积 较低压降 较小的传质阻力 如棉花 尼龙 丝等纤维性物质都曾被成功地 用于酶固定化瞳铲3 妇 但用纤维性物质作载体存在的一个最大问题是聚合体上活性 第l 章引言 位较少 b u s t om i 2 3 等将纤维素酶 e c3 2 1 4 固定在藻酸钙上 固定酶与游离酶相 比催化速率和最大表观速率都偏低 但是半衰期可从1 2 h 延长到5 4 h 固定化 酶活性可保留7 5 若与游离酶混合使用 活性可保留8 0 还有人通过物理吸附 共价键结合或耦合等方法将纤维素酶固定在二氧化硅 颗粒 离子交换树脂上 用溶胶一凝胶法或硅烷耦合剂将酶包封成玻璃态物质 得到的固定化酶都在不同程度上保留了酶的活性 此外 为了增加不溶性载体的吸附性能 提高纤维素酶的固化率 可对载体 进行处理 然后再来固定酶分子 u e m a k i 在将酶固定化之前 先用溴化氰对载 体a 1 0 进行活化 然后再将酶吸附上去 与酶经活化处理相比 酶活性比直接 固定的提高了1 0 倍 仍比游离酶低 但稳定性提高了 引 n u r d a nk a s i k a r ap a z a r l i o g l u 在用固定化纤维素酶清洗粗织物时 是先将 浮石颗粒用酸清洗 于室温晾干 在1i o c 的烘箱中放1 小时 然后用0 6 5 m 的 z r o c l 在1 o m 的h c l 中将浮石颗粒活化 将酶和活化的浮石颗粒放入烧瓶中 在6 0 r p m 的转速下使其混合 得到固定化酶 在1 2 0 的稀溶液中 酶可以完全 与载体结合 在工业过程中酶的包覆率约为1 5 对酶的解吸作用进行测定 3 0 m i n 过后 解吸达到平衡 固定化酶的活性比初始时低 与游离酶的进行对比 实验 固定化酶比游离酶效果好 同样 增加酶浓度可以提高酶活性 1 有人尝试将纤维素酶固定在薄膜上口别 先制得丙烯酰胺与丙烯腈接枝共聚物 p a n 用氢氧化钠 硫酸亚铁铵和过氧化氢修饰共聚膜 再用戊二醛作耦合剂 使纤维素酶在膜上固定 然后在醋酸缓冲溶液中加入羧甲基纤维素 固定化纤维 素酶 过一定时间后 用x 射线电子分光光度计测定水解的葡萄糖的含量 加入 3 5 一二硝基水杨酸来显示颜色变化 测定纤维素酶的活性 在一定范围内随着 接枝在丙烯腈共聚膜的丙烯酰胺量的增多 酶固定时间的增加 酶浓度的上升 酶的活性都会有所提高 在与游离酶的对比实验中发现要使水解反应的起始速率 相同 固定化酶的浓度必须高于游离酶 但是固定化酶反应总的速率常数较大 且热稳定性和p h 值稳定性也较好 1 3 2 2 可溶性载体 把纤维素酶固定在不溶性载体上 固然有利于酶的回收 但对酶分子接近不 溶性纤维素底物来说毕竟不很方便 且不溶性载体表面的疏水性还会影响酶的活 性 还易与未反应的固体底物混在一起 因此 当用于大分子或不溶性底物水解 6 第1 章0 i 育 时 用可溶性载体固定的纤维素酶作用效果更好 k u m a k u r a m l 在低温下 用各种亲水性单体 甲基丙烯酸羟乙酯 h e m a 丙烯 酸羟乙酯 h e a 甲基丙烯酸一4 一乙烯乙二酯 4 g 二甲基丙烯酸 9 乙烯乙二酯 9 g 作聚合母体 用辐射引发聚合法制得固定化酶 先将纤维素酶 e c3 2 1 4 溶液与2 5 0 c m 3 氧化铝颗粒混合 使酶溶液吸附到颗粒上 l o m i n 过后 将颗粒和 单体溶于o 1 m 的醋酸并冷却至 7 8 保持温度不变 用1 o m r a d 的y 一射线辐射 l h r 将温度升至室温得到固定化的酶颗粒 用此来水解经预处理的谷壳粉末 反应后的酶颗粒用缓冲液洗一次 然后重复利用 制得由单体包覆的酶颗粒 然 后将复合颗粒放入一个玻璃容器 在氮气氛中保存 酶解后 用g l 一1 0 1 葡萄糖 分析仪测定酶解后葡萄糖的收率 实验表明用没有单体包覆的固定化酶催化 随 着酶间歇反应重复次数的增多 葡萄糖的收率减小 表明酶从颗粒脱离 部分损 失 而用经单体包覆的酶催化 开始时收率下降 然后变为二常数 这一结果表 明 开始时酶有损失 重复几次过后就稳定了 这也进一步证明了用吸附法固定 的酶 结合力不强 同时一系列对比分析还表明 这种方法固定的酶还受单体性 质 如亲水性 与固体颗粒吸附时间 吸附程度 单体浓度 酶浓度 酶反应 时间 水解底物性质及底物预处理时间的影响 但并不是越大越好 如增加单体 浓度 葡萄糖收率也增加 但单体浓度超过5 0 最佳浓度 后收率反而随着单 体增加而下降 用9 g 作聚合母体固定酶 重复利用 反应3 0 d 时可以使葡萄糖收 率达1 6 纤维素水解率达5 3 1 9 9 6 年陈盛与其合作者通过壳聚糖与戊二醛交联 再将纤维素酶固定化 发 现固定化酶的半衰期至少为8 5 天 酶活力回收率可达7 5 7 1 同年他还将纤维素 酶 e c3 2 1 4 固定在甲壳胺上 也取得了不错的效果m 1 2 0 0 1 年r o d o l f od a r i a s 等 1 将壳聚糖以共价键与经高碘酸盐活化的纤维素 酶 e c3 2 1 4 相连 所得固定化酶活性是自由酶的3 9 8 最适p h 值和最适温度 不变 热稳定性提高8 9 度 p h 值在1 0 3 2 范围内的稳定性也提高了 1 3 2 3 可溶性一不溶性载体 可溶性聚合物作为纤维素酶固定化载体 确实使酶促反应容易进行 但是反 应结束后 酶不易回收 失去了固定化酶反复作用的特点 为了克服这一问题 有人研制了一种s i s 互变载体系统 这种载体系统随溶液p h 范围的不同 可呈 现可溶或不可溶性 用其固定纤维素酶避免了单独使用不可溶性或可溶性载体带 来的缺点 第l 章引高 t a n i g u c h i m h 叫将纤维素酶 m e i c l a s e 通过共价结合固定在肠衣聚合 a s l h y d r o x y p r o p y lm e t h y l c e l l u l o s ea c e t a t es u l c i n a t e 膜上得到固定化酶m a s 用其降解微晶纤维素 活性比传统方法固定的酶高 对于处理定量的纤维素所需 时间也大大减少 通过改变p h 值 可使可溶性固定化酶发生白沉降 可分离回收 大部分酶 f d o u r a d o h 等将木霉纤维素酶固定在e u d r a g i tl i 0 0 甲基丙烯酸和异丁 烯酸甲酯的共聚物 上得到了s i s 型载体固定酶 实验结果表明 负载后的聚合 物亲水性与未负载的差别不大 在溶液中加入碳化二亚胺 使溶液碱性增大 聚 合物亲水性减弱 使载体从可溶性转变为不溶性 固定酶与载体的摩尔比在 0 2 1 1 与1 8 1 1 2 问 在l o o m g 酶 g e u d r a g i t 浓度下 固定酶的比活性可达自由 酶的9 7 但是随着固定酶量的增加 摩尔比超过1 固定酶分子形成聚集 可 能妨碍大分子的底物到达酶的活性部位 酶的比活性几乎成线性递减至最小值 6 3 酶大多数是通过吸附作用与载体结合的 所以在溶液中盐的含量会使酶发 生解吸 在盐浓度很低或很高时 酶都会失活 分别将固定化酶在4 和常温下 放置1 4 天 酶的活性不变 再放7 天4 下的酶活性减少1 2 常温下的减少3 6 而游离酶在4 c 放置2 1 天后6 3 的活性消失 在室温下8 1 的活性消失 但是在5 0 时两者差别不大 说明固定酶与游离酶的变性温度基本相同 1 3 2 4 固定化细胞 胡 固定化细胞是在固定化酶技术发展之后发展起来的潜力很大的技术 它是利 用酶或酶系的一条捷径 它所使用的固定化方法与固定化酶基本类似 由于固定化细胞可以省掉那些费时与复杂的酶制剂精制步骤 固定化细胞的 研究日益受到科学家们的重视 1 9 8 4 年 k u m a k u r a 报道了通过辐射聚合法制备t r e e s e i q m 9 4 1 4 固定化细 胞产生纤维素酶的情况 作者将q m 9 4 1 4 细胞悬浮在含有网状结构单体h e m a 或h e a 的培养基中 在 7 8 c 下 用c 0 6 0 y 射线辐射l 小时 即得到固定化了 的细胞混合物 q m 9 4 1 4 细胞在该载体表面很快就恢复生长 产生的纤维素酶不 但稳定性好 而且具有较高的内切或外切葡聚糖酶活性 且可以连续培养 并能 有效地转化经射线处理的纤维素物质 如新闻纸 稻草等 后来作者又将q m 9 4 1 4 细胞悬浮在含有h e m a 和多孔玻璃纤维的培养基中 通过辐射使其发生聚合形 成多孔纤维聚合物 再利用t r e e s e i 细胞的粘附力 使之固定在这种多孔聚合物 表面 如此制备的固定化细胞具有很好的重复使用性 对处理后稻草的转化率达 第l 章 j l 南 6 0 7 0 1 9 8 5 年 黎高翔将p f u n i c u l o s u m 细胞固定在氨基甲酸乙酸乙酯聚合物前 体 u r e t h a n ep r e p o l y m e r p u 一3 p u 6 上 产生的纤维素酶具有内切 外切葡聚 糖酶和b 葡萄糖苷酶三种活性 而且连续发酵3 9 天 产酶量才开始下降 1 3 2 5 磁性纳米颗粒为载体 随着纳米科学技术的新起 人们发现纳米材料具有量子尺寸效应 小尺寸效 应 表面效应和宏观量子隧道效应 因而拥有许多独特的性质 在催化 激光 光吸收 医药 磁介质及新材料方面有广阔的应用前景h 2 4 引 磁性纳米固定化酶就是其中一例 磁性纳米颗粒作为酶的载体具有下列优 点 一是纳米颗粒具有高比表面积 可结合大量酶 二是具有磁性 可借助外部 磁场方便简单地进行分离和导向 将酶回收 反复使用 大大提高酶的利用率 并可实现生产的连续化 自动化 为工业化提供了技术基础 三是分散性好 有 利于酶与底物的接触 磁性纳米颗粒在酶的固定化 靶向药物等领域有广泛的应 用前景 物理吸附法固定酶是常用的将生物分子固定在微颗粒上的方法 但蛋白质容 易从颗粒表面脱落并变性失活 若能利用共价键将蛋白质结合在微颗粒上 不稳 定性 可逆性或失活的问题就可以克服m 1 实验证明h 5 4 8 3 在碳化二亚胺的存在下 蛋白质可以通过共价键固定在磁性f e 0 纳米颗粒上 1 4 用于酶固载的超顺磁性纳米f e 0 简介 1 4 1 超顺磁性纳米f e 0 的特点 纳米磁流体 亦称纳米磁性液体 是铁磁性物质均匀稳定地分散在某种基液 中 形成的一种弥散溶液 即磁性微粒的胶体溶液h 蝴 磁性液体是一种液态的 强磁性材料 它是纳米技术 磁性材料和液体介质的有机结合 这使它具有其他 材料所不具备的一系列优异性能 磁性液体既有流动性 又有磁性 在外磁场下 可以定位 定向移动 具有磁粘滞性和磁各向异性附驯 磁性纳米载体系统既体现了纳米的特性又具有磁性控制分离的优点 纳米微 粒特殊的物理化学性质表现在 1 表面效应 纳米微粒尺寸小 表面能高 表 面原子数多 原子配位不足 使表面原子具有高活性 容易与其它原子结合 将 9 第1 章0 l 苦 有利于酶在其表面的固载 2 异常的分散性 使其固载的酶具有准均相催化反 应活性 1 4 2 超顺磁性纳米f e 0 的制备方法 f e 3 0 4 磁性纳米微粒的制备方法很多哺7 可分为物理方法和化学方法 其中 主要有下列五种方法 共沉淀法嘲 5 9 氧化沉淀法呦1 微乳液法 3 溶胶 凝胶法 嘀副 机械球磨法怕引 每种方法各有其优缺点 1 4 2 1 共沉淀法 沉淀法是目前制备纳米f e 0 的最广泛应用的方法 在含有多种阳离子的溶液 中加入沉淀剂 使金属离子完全沉淀的方法称为共沉淀法 通常是把f e 扑和f e 3 的硅酸盐或氯化物溶液以1 2 或是2 3 的比例混合后 用 过量的n h 0 h 或n a o h 在一定温度和p h 值下 高速搅拌进行沉淀反应 然后将沉淀 洗涤 过滤 干燥 烘干 制得大小尺寸为8 l o n m 的f e 0 4 纳米微粒 共沉淀法制备纳米微粒操作简单 成本低 生成的纳米微粒具有较高的化学 均匀性 粒度较细 且具有一定形貌 但在洗涤 过滤 干燥时易产生团聚现象 1 4 2 2 氧化沉淀法 氧化法是将m n 2 盐溶液和f e 2 盐溶液按化学计量比混合 再加入一定量的氢氧 化钠 然后通入空气使之起到搅拌和氧化双重作用 在一定温度下 反应若干时 间后即得到产物 该法中所加入碱量的多少对生成的铁氧体粒径大小 晶体形貌和产物的纯度 都有明显的影响 该法设备简单 操作方便 粒径可控且粒径变化范围也较大 可从2 7 n m 增至1 2 5 n m 相应的磁响应性变化范围也很大 但反应条件如物料配比 反应温度 氧化时间等对结果有很大的影响 所以需仔细选择反应条件 陈捷哺钔等人用氧化沉淀法 在f e c l 溶液中缓慢滴加h 2 0 和n a o h 溶液制备出强 磁响应性纳米级磁流体 并通过聚乙烯醇包埋 获得磁性高分子载体 1 4 2 3 微乳液法 微乳液通常是由表而活性剂 助表面活性剂 通常为醇类 油类 通常为 碳氢化合物 组成的透明的 各向i 司性的热力学稳定体系 微乳液中 微小的 水池 为表面活性剂和助表面活性剂所构成的单分子层 l o 第l 章f j l 击 包围成的微乳颗粒 其大小在几至几十个纳米之间 这些微小的 水池 彼此分 离 就是 微反应器 它拥有很大的界面 有利于化学反应哺5 川1 这显然是 制备纳米材料的又一有效技术 f e l t i n 等人 7 3 用微乳液法以f e c l 与表面活性剂 十二烷基硫酸钠 s d s 反应生成的f e d s 为反应物 通过控se j s d s 浓度及反应 温度制得了粒径大小为3 7 1 1 6 n m 的球形f e 0 纳米粒子 该方法中在反应物浓 度极低及室温时却可获得稳定的纳米粒子 反应温度的变化直接影响粒子的结晶 程度及磁性 与其他化学方法相比 微乳法制备的粒子不易聚结 大小可控 分散性好 同时可通过选择不同的表面活性剂分子对粒子表面进行修饰 1 4 2 4 溶胶一凝胶法 溶胶一凝胶法 s o l g e l 是近几年发展起来的 主要以醇盐为原料 在一定 的温度等条件下进行水解和缩聚反应 而随着缩聚反应的进行以及溶剂的蒸发 具有流动性的溶胶逐渐变为略显弹性的固体凝胶 然后再在比较低的温度下烧结 成为所要合成的材料 凝胶的结构和性质在很大程度上决定了其后的干燥 致密程度 并最终决定 材料的性能 除了通过对反应过程工艺的控制来对材料进行设计外 各种化学添 加剂如 s d s s d b s 往往被引入n s o l g e l 反应过程中 这些添加剂可以改变水 解 缩聚反应 改变凝胶结构均匀性 同时也能够控制其干燥行为 d o n g 等人呻1 用s o l g e l 法合成a f e 0 纳米粒子时 在反应物中加入环氧乙烷 e 0 取得了理 想效果 溶胶一凝胶法的优点是反应温度低 产物粒径小 可控制在几十纳米范围 同时其合成工艺的可操作性 也很适应于大规模工业生产发展的要求 但它有成 本高和干燥时丌裂的缺点 1 4 2 5 机械球磨法 该种方法是近年来发展起来的一种制备纳米材料的方法 主要适用于纯金属 单质纳米的制备 是一种物理粉碎过程 是一个由大晶粒变为小晶粒的过程 机械球磨法制备纳米材料重现性好 操作简单 制备效率高 成本低 但生 产周期长 粒径细化难以达到纳米级要求 且制备过程中易引入杂质 产品纯度 不高 颗粒分布也不均匀 只适用于对材料要求不高 需求量大的纳米材料的制 备 第l 章引言 1 4 3 超磁性纳米f e 0 的表面修饰 对磁性核心的修饰除了能固载酶或药物的功能外还具有稳定磁流体的功能 修饰用材料主要有两种 天然的高分子材料和可生物降解的合成高分子材料 天然高分子主要是 多糖 如 淀粉 葡聚糖 壳聚糖等 和蛋白质 如 白 蛋白 明胶 球蛋白 酶等 为了载药使用合成的可生物降解的高分子聚合物 材料主要有聚酯 聚乳酸 p o l y l a c t i ca c i d e p l a 聚羟基乙酸 p g a 聚乳 酸 羟基乙酸 p l g a 等 它们在体内通过聚酯水解 最终变为c o 和h 0 排出体 外 聚氰基丙烯酸烷基酯 p 0 1 y a l k y l c y a n o a c r y l a t e p a c a 其降解速度随烷 基链的延长而降低 细胞毒性随链的增长而减小 一般选择降解速度适中的聚氰 基丙烯酸烷基酯作为药物载体 如聚氰基丙烯酸正丁酯 另外还有聚酸酐 p o l y a n h y d r i d e 聚原酸酯 p 0 1 y o r t h o e s t e r s p o e 聚己内酯 p 0 1 y c a p r 0 1 a c t o n ep c l 聚已醇酸 p o l y g l y c o l i ca c i d p g a 及其共聚物 等 核一壳结构的纳米微粒同单一成分相比其物理和化学性质都有较大的改善 并且其用途也更广泛 长时期以来寻求能够精确控制形貌和壳层厚度的构造核一 壳结构的方法一直是研究的重点胁7 近年来 尽管有许多方法报道 但是传统化学方法包覆的壳不均匀 且由于 引发剂 乳化剂的加入致使壳层混有杂质 严重影响了磁性载药系统的生物应用 即制备以纯净 均匀有序 层次可控的包覆壳层仍是存在技术困难 中科院上海 应用物理研究所采用光化学辐照方法 以温敏的n 一异丙基丙烯酰胺 p n i p a m 和生物相容的聚氰基丙烯酸烷基酯 p a c a 为单体对f e 0 4 进行修饰获得兼有磁 导向和温敏智能的亲水 亲油的磁性纳米材料一引 1 5 课题的研究内容 本论文利用改进后的还原沉淀法制备f e 3 0 4 纳米粒子 并对其粒径和磁学性 质进行表征 然后以优化合成的分散性比较好的f e 3 0 4 磁性纳米溶液为载体 通 过碳化二亚胺的活化作用嘶 搏 7 引 将纤维素酶直接固定在磁性微颗粒上 通过纤 维素酶解为葡萄糖的效率测定 以期获得可以用外加磁场回收的具有能酶解纤维 素的同载酶 通过改变碳化二亚胺的用量 温度 p h 值等条件确定最佳固定化 工艺条件 1 2 第l 章引苦 磁性微颗粒作固定载体己被研究了很长时间 多为单一酶在磁性纳米颗粒上 的固定 有关纤维素酶在磁性纳米颗粒上的报道中 都需事先对磁性颗粒表面进 行修饰 不加任何处理直接在磁性颗粒表面进行纤维素酶的固定还未见报道 论 文同时对于用碳化二亚胺固定酶的机理进行探索 研究固定化纤维素酶的催化条 件 p h 值 温度 对催化效率的影响规律 以及固定化纤维素酶的热稳定性 并与游离酶的催化进行对比 此外 还研究固定化纤维素酶的重复使用性以及超 声波对其催化作用的影响 为固定化纤维素酶的应用提供理论基础和依据 第2 幸磁性纳米阴氧化二三铁的制务o j 件能 第2 章磁性纳米四氧化三铁的制备与性能 2 1 化学药品和仪器 2 1 1 主要化学药品 三氯化铁 f e c i 6 h 0 分析纯 亚硫酸钠 n a s 0 9 7 氨水 2 5 分析纯 盐酸 高纯氮 三次蒸馏水 2 1 1 主要仪器 国药集团化学试剂有限公司 上海振欣试剂厂 中国医药上海化学试剂有限公司 电子天平m e t t l e rt o l e d o 仪器有限公司 儿一1 2 0 型超声波清洗器上海杰理科技有限公司 r w 2 0 d z m n 型数显搅拌器广州仪科 i i z k 0 1 温度指示控制仪上海华辰医用仪表有限公司 m a l v e r n 一3 0 0 0 h s 光子相关光谱仪 p c s 英国马尔文公司 l e 0 1 5 3 0 v p 型场发射扫描电子显微镜 s e m 恒温水浴锅 玻璃干燥器 烧杯 移液管 三颈烧瓶 滴液漏斗 或滴管 磁铁 2 2 实验过程 1 配制1 mf e c l 溶液1 0 0 m l 称取f e c l 6 h 02 7 0 2 9 9 用容量瓶配成1 0