DNA评估检测卵巢癌和子宫内膜癌的巴氏实验.docx

DNA评估检测卵巢癌和子宫内膜癌的巴氏实验补充实验材料和试验方法病人样本：人口统计、临床和病理学数据收集，所有关于组织病理学的说法均经过病理学家的鉴定。外科手术冻存的组织样品为卵巢肿瘤组织和子宫内膜组织，均由病理学家鉴定为具有肿瘤组织结构的细胞。梯度冻存为了使切割的组织碎片化 以便DNA的提取。FFPE（福尔马林固定并由石蜡包埋）组织样品由病理学专家鉴定肿瘤细胞结构并与高度的肿瘤细胞结构相区分。10微米刀距切割肿瘤组织，以便更好地片段化，利于DNA的提取。正常组织DNA来自全血或者无肿瘤的临近组织Pap液体基质样品收集自宫颈刷和HC2 DNA收集装置或者ThinPrep2000系统并按照说明书储存病人相关数据均由标准偏差分析得出。DNA提取：Pap样本DNA纯化自肿瘤或者正常组织，使用QIAGEN纯化试剂盒。3ml RLTM缓冲液纯化后的DNA样品连接到QIAGEN的DNA柱上。加入5体积的纯化缓冲液使Pap样本DNA得到纯化，当柱子中液体小于3毫升后，收集离心1000g 5min，离掉细胞碎片。定量PCR检验DNA质量，使用文章中提到的条件和引物序列。微卫星稳定性测试微卫星稳定性由MSI分析系统给出，包括5个单核苷酸的重复和两个核糖核苷酸，参照操作指南。扩增后，荧光定量PCR产物由ABI3130毛细管电泳仪确定大小。肿瘤样本命名如下：MSI-高 ，与种族DNA相比两个以上单核苷酸长度的变化；MSI-低，单核苷酸发生变异；MSS，与种系DNA相比无变化。对所有样本进行核糖核苷酸的鉴定。ILLUMINA DNA文库预处理和序列捕获DNA文库的准备严格按照操作说明。1-3微克基因组DNA用于文库的构建（illumina TruseqDNA preparation kit），超声波破碎到目的大小200bp。这些片段的粘性末端被末端修复为平末端，随后在片段的3端加入一个单一的A碱基，相对的在接头的3端加入一个T碱基，与接头捆绑后，文库用8-14个循环的PCR扩增保证0.5-4微克的产物以便序列捕获。序列捕获采用安捷伦的人外显子捕获试剂盒，严格按照使用说明操作，在混合杂交时使用Truseq index特异的阻断。AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-XXXXXX-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGT，其中六个XXXXXX为index的区域标签，为12个样本特异的。目标基因的富集：简单地讲：致癌基因、肿瘤抑制基因的目标区域由单核苷酸的探针合成（安捷伦）。36个碱基的探针，由3个碱基围住，将捕获片段性的或者长度较大的目标DNA连。单核苷酸探针由3ml 35%的氢氧化铵在室温下孵育5小时来从芯片上降解掉。溶液转移到2ml管中，真空干燥，用400微升含有RNA酶的超纯水重新溶解，5微升用于PCR扩增，引物为与12个碱基序列互补的普通探针：5-TGATCCCGCGACGA*C-3 and 5-GACCGCGACTCCAG*C-3，和一个磷酸键。PCR产物由QIAGEN公司的纯化试剂纯化，Epicentre公司的末端修复试剂盒修复纯化后的PCR产物，然后再纯化。PCR产物按文献方法捆绑串联起来。之前提到的两种方法的不同之处在于现在用的这种方法包括对链接PCR产物后的 扩增和固相捕获方法如下：生物素捕获探针准备为扩增50ng的链接PCR产物用QIAGEN公司产的连接试剂盒，补上2.5nmol的Dutp(Roche)总体系27.5微升，30孵育16小时。65 3min灭火聚合酶后，生物素捕获探针由QIAGEN公司纯化试剂盒纯化。4-5微克文库DNA与1微克探针共孵育杂交混合。生物素捕获探针和文库序列捕获后由Invitrogen公司的DynabeadsMyOneC1纯化，按照使用说明洗脱后，捕获的序列用0.1M的氢氧化钠溶解并用1M的 Tris盐酸(pH7.5)中和，中和后的DNA脱盐并纯化后收集20微升纯化柱，所得溶液扩增条件如下：总体积100微升，Thermo公司生产的扩增试剂盒，其中包括HF缓冲液、0.25摩尔的dNTPs，0.5umol的前后引物TruSeq，还有2U的聚合酶。反应条件如下：98 30s；98 10s 14个循环，60 30s，72 30s；跟一个72 5min的延伸。扩增层包括浓缩的靶序列由Beckman纯化并由安捷伦的微液滴光谱分析仪定量。高通量平行测序和体细胞突变鉴定通过目标序列的捕获，双末端测序提供一个2*75碱基的各个片段的读数。这些序列标签经过过滤与人类基因组排成一线，然后对变体的分析由ELANDv2给出。SNP多态性在分析中被去除，高可信突变的鉴定如前文所述。低频突变的评价我们试图设计引物用于探测46中癌症的突变。60%的引物扩增了目的片段；另外40%，两个或者三个引物对可能形成二聚体或者非特异性扩增。测序文库准备：模板制备如上文。每个模板的每条连编码了14个特异碱基的标签（UID）包含一个退化的N碱基（与ATCG相同的概率）-加上两到四个循环的扩增子特异的PCR（UID指定的PCR）基因特异性的前后引物均包括5端广义的标签序列，为第二轮循环的引物提供连接位点，但是只有前引物带有UID，这个UID就是5端带有广义的标签；3端带有基因特异序列。四个N碱基在后引物上，帮助双末端测序分析。UID特异性的PCR循环：50微升的反应体系，66ng的DNA，1*HF缓冲液，0.25mM dNTPs，0.5uM 前后引物，2U 聚合酶。去除多余的带UID的引物，防止后续第二步PCR反应中使模板定量复杂化，可以用核酸外切酶37消化15min来降解没有结合的引物。根据文献，核酸外切酶1适用于消化没有结合上的引物，但是本文中应用的方法为外切酶消化后用AMPure纯化，TE溶解至10微升，能够最大限度的去除带UID的引物并且能够得到更好的PCR产物。溶解的模板由二步法PCR扩增，引物为带有适用于illumina5端序列捕获杂交的插入序列。后引物扩增加入一个插入序列在5插入序列和3广义标签序列，使多重独立的PCR产物在测序仪的同一孔板同时分析时能够区分开。二步法扩增反应包括HF缓冲液、0.25mM dNTPs、0.5uM 引物，2U 聚合酶，总体系50uL。预热98 2min，65 15s， 72 15s。各个阵列用相同的模板进行六个互相独立的扩增，每个包括66ng的DNA（400ng封顶）。PCR产物用AMPure纯化后直接用于测序。数据分析：高质量的测序数据由文献所述分析得出。我们选择那些带有较高信号的UID（14个循环的时候）进行分析，如果只有一个单独的信号那么可能是错误信号。14个碱基包括UID的读数至少大于15个信号，并且每个UID必须读数在两次以上才保留，作为深入分析的数据使用。数据中模板特异性的部分包括被预期引物扩增的序列与参考序列对照。认为造成的突变在样品处理过程中或者测序步骤中出现的假阳性突变大部分被修复去除掉了，因为有大于50%的读