（发酵工程专业论文）重组ecoli产胆固醇氧化酶的提取、酶学性质及应用研究.pdf

摘要 摘要 胆固醇氧化酶 e c l 1 3 6 c o d 是胆固醇代谢过程中的关键酶 依赖辅酶f a d 能 专一性地催化胆固醇转化为胆甾 4 一烯 3 酮 4 一c h o l e s t e r 0 1 3 o n e 在食品开发 医疗保健 临床检测 生物农药等方面具有广泛应用价值 本文以重组e c o l i 产c o d 为研究对象 以c o d 的开发和应用为目标 在c o d 的分离提取 酶学性质 以及酶的应用等方面进 行了研究 采用超声处理重组e c o l i 7 0 n h 4 2 s 0 4 盐析 c ms e p h a r o s ef f 离子交换层析 s e p h a d e xg 7 5f i n e 凝胶过滤的提纯步骤 分离得到c o d 提取纯化的c o d 比酶活达 4 7 3u r a g 纯化倍数达到4 5 倍 酶活力回收率为2 1 s d s p a g e 凝胶电泳显示 主 条带明显 杂酶去除率较高 分子量为5 0k d 以提取的酶为研究对象 对c o d 的酶学性质和酶的稳定性进行了研究 利用 s d s p a g e 测得该酶的分子量为5 0k d 酶的最适反应温度和p h 分别为3 7 和7 5 酶 在4 0 以下具有良好的稳定性 酶的p h 稳定范围为6 9 金属阳离子对该酶都有不同 的影响 其中h 9 2 和a 离子具有显著抑制c o d 活性的作用 而f e c u 2 和c a 2 也 有微弱的抑制作用 酶动力学参数k m 值和v m a x 分别为8 2 1 0 5m o l l 和0 2 1 m m o l l r a i n 将提取的c o d 应用于蛋黄胆固醇的去除 确定h p l c 测定蛋黄胆固醇含量的最佳 流动相条件为乙睛 甲醇 异丙醇 5 0 8 0 1 0 并制定了胆固醇的标准曲线 比较了 超声处理蛋黄与对照的效果 超声处理的蛋黄胆固醇与卵磷脂的分离率是对照的1 6 倍 最适的超声处理体积 时间分别为3 0 m l 1 5 m i n c o d 处理蛋黄胆固醇的工艺条件 1 0 7 u g 酶量 蛋黄 处理时间为9 h 酶处理前后主要营养物质未曾变化 氧化产物为 胆甾 4 烯 3 酮 胆固醇的转化率达8 0 以上 关键词 重组e c o l i 胆固醇氧化酶 分离纯化 酶学性质 蛋黄胆固醇 a b s t r a c t a b s t r a c t c h o l e s t e r o lo x i d a s e e c1 1 3 6 c o d i st h ek e ye n z y m eo fd e g r a d a t i o nc h o l e s t e r o l w h i c hr e l yo nt h ec o e n z y m ef a d t oc a t a l y z ec h o l e s t e r 0 1i n t o4 c h o l e s t e r o l 3 o n e t h e s i g n i f i c a n tf u n c t i o n so fc h o l e s t e r o lo x i d a s e e c1 1 3 6 c o d i nf o o dp r o c e s s i n g m e d i c a l a s s a ya n db i o l o g i c a lp e s t r e s i s t a n c ew e r er e c o g n i z e dg r a d u a l l ya n ds h o w e dp o t e n t i a l l yu s e t m sr e s e a r c hi sm a i n l yf o c u s e do nc o d p u r i f i c a t i o nf r o mr e c o m b i n a n tec o l i e n z y m a t i c p r o p e r t i e s a n da p p l i c a t i o no fc o d t h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fi n t r a c e l l u l a rc o df r o mr e c o m b i n a n te c o l iw e r e p e r f o m e d c o dw a se x t r a c t e db yu l t r a s o n i ct r e a t m e n t 7 0 a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n a n dp u r i f i e dt h r o u g hd e a es e p h a r o s ef f s e p h a d e xg 7 5 t h ef i n a ls p e c i f i ca c t i v i t yo f c o dw a s4 7 3u m g a n d4 5 f o l dc o n c e n t r a t i o nw a so b t a i n e dw i t he n z y m a t i ca c t i v i t y r e c o v e r yo f21 as i n g l em d hp r o t e i nb a n dw a ss h o w no ns d s p a g eg e lf i n a l l y t h e m o l e c u l a rw e i g h to ft h ee n z y m ew a s5 0k dm e a s u r e db vs d s p a g e e n z y m a t i cp r o p e r t i e sa n ds t a b i l i t i e so fe x t r a c t e di n t r a c e l l u l a rc o df r o mr e c o m b i n a n t ec o l iw a r es t u d i e d t h ee n z y m eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dp hw e r e3 7 a n d7 5 t h ee n z y m eh a sg o o ds t a b i l i t yw h e nt h et e m p e r a t u r eu n d e r4 0 m e a n w h i l e t h ee n z y m e a c t i v i t yi sr e l a t i v e l ys t a b l ei nt h ep hr a n g ef r o m6 9 t h em e t a lc a t i o nh a sad i f f e r e n ti m p a c t o nt h ee n z y m ea c t i v i t y c o dw a ss t r o n gi n h i b i t e db ym e t a li o n ss u c ha sa g a n dh 旷 w h i l e c 一 f e c u h a dl i t t l ee f f e c to nc o d 硼1 ee n z y m ek i n e t i cp a r a m e t e r sk ma n dv m a x v a l u e sw e r e8 2 1 0 5m o l la n d0 2 1m m o l 化 r n i n t h ec o dw a sa p p l i e dt or e m o v a lt h ec h o l e s t e r o lo fe g gy o l k 1 1 1 eb e s tm o b i l ep h a s e c o n d i t o n so fi s a c e t o n i t r i l e m e t h a n o l i s o p r o p y l a l c o h o l5 0 8 0 1 0 w h i c hi su s e df o r d e t e r m i n a t i o nt h ec h o l e s t e r o lc o n t e n to fe g gy o l kb yh p l c a n de s t a b l i s h e dt h es t a n d a r d c u r v eo fc h o l e s t e r 0 1 a tt h es a m et i m e t h ee f f e c t sw a sc o m p a r e db e t w e e nu l t r a s o n i c t r e a t m e n ta n dc o m p a r i s o n r e s u l t ss h o w e dt h es e p a r a t i o nr a t eo fc h o l e s t e r o lb yu l t r a s o n i c t r e a t m e n ti s1 6t i m e st h a nt h ec o m p a r i s o n 1 1 1 eu l t r a s o n i ct r e a t m e n tc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h eo p t i m a lv o l u m ea n dt i m eo fu l t r a s o n i ct r e a t m e n ta r e3 0 m l 15 m i n u n d e rt h eo p t i m u m o p e r a t i o n a lc o n d i t i o n s 缸e a t m e n tt i m eo f9 h c o dc o n c e n t r a t i o no f 0 7 u g c o dc o n t e n t e g gy o l k t h ec o n v e r s i o nr a t eo fc h o l e s t e r o lw a sm o r et h a n8 0 t h em a j o rn u t r i e n t sd i dn o t c h a n g ea f t e re n z y m et r e a t m e n t t h eo x i d a t i o np r o d u c t si s4 c h o l e s t e r 0 1 3 o n e k e y w o r d s r e c o m b i n a n te c o l i c h o l e s t e r o lo x i d a s e p u r i f i c a t i o n e n z y m a t i cp r o p e r t i e s t r e a t m e n to fy o l kc h o l e s t e r o l i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名 鞋茁堕 日 期 幽至 趣f 塑 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留 使用学位论文的规定 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允 许论文被查阅和借阅 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名 鞋逊 导师签名 日期 引言 第一章引言 胆固醇是一种动物性甾醇 是构成动物细胞膜的必需组分 在人体中胆固醇主要存 在于血浆 肝 肾上腺以及细胞合成的脂质混合物中 它对人体有一系列生理生化功能 可调节消化道对脂肪的吸收 并且是胆汁酸 类固醇激素和维生素d 生物合成的前提物 质 就食品而言 胆固醇普遍存在于动物性食品中 但近年来医学研究表明 食品中高 含量的胆固醇对人体健康有不良影响 研究表明人体血液中的胆固醇含量过高会引起 心 脑 血等疾病如动脉粥样硬化 冠心病 胆结石等 而胆固醇的氧化产物之一胆甾 4 烯 3 酮能作为治疗心血管疾病和抗肥胖等的药剂1 2 因此开发一种专一性氧化胆固醇 为胆甾 4 烯一3 一酮的胆固醇氧化酶 c o d 具有重要的意义 c h o l e s t e r o l c h o l e s t 5 a 3 o 豫 c h o l e s t 4 m 3 o l 硷 i 1 2 0 2 伤 图1 1c o d 的作用机理 f i g 1 1e n z y m a t i cr e a c t i o nc a t a l y z e db yc h o l e s t e r o lo x i d a s e w i t hc h o l e s t e r o la st h es t e r o i ds u b s t r a t e 胆固醇氧化酶 c o d e c l 1 3 6 是胆固醇代谢过程中的关键酶 依赖辅酶f a d 能 专一性地催化胆固醇转化为胆甾 4 烯 3 酮 4 c h o l e s t e r 0 1 3 o n e 图1 1 在食品开发 医 疗保健 临床检测 生物农药等方面具有广泛应用价值1 3 不同来源的c o d 的性质不 同 因此分离纯化的方法也不同 目前 日本已经实现c o d 的工业化 而国内c o d 尚 处于研究阶段 随着c o d 的应用日益广泛和人们对酶纯度的需求日益增长 分离纯化 的成本已成为c o d 的生产总成本的决定性因素 因此 如何更好的分离纯化c o d 已是 工业化生产c o d 的关键技术 本章主要介绍不同微生物来源的c o d 的分离纯化现状及 c o d 当今的应用现状 1 1 胆固醇氧化酶的来源与分类 胆固醇氧化酶来源于动物和微生物 其中动物来源的研究较少 胆固醇氧化酶的微 生物来源较多 主要包括诺卡氏菌属 n o c a r d i a 链霉菌属 s t r e p t o m y c e s 短杆菌属 b r e v i b a c t e r i u m 假单胞菌属 p s e u d o m o n a s 裂殖菌属 s c h i z o p h y l l u m 链霉菌 s t r e p t o v e r t i c i l l i u m 红球菌属 r h o d o c o c c u s 芽胞杆菌属 b a c i l l u s 棒状杆菌属 c o r y n e b a c t e r i u m 等 其中链霉菌属中产生胆固醇氧化酶的菌种最多 近年来国内外 江南大学硕士学位论文 研究较多的是来源于短杆菌属和链霉菌属的胆固醇氧化酶 它们已被日本的t o y o b o 公 司和k y o w a h a k k o 公司用于工业化生产 大部分胆固醇氧化酶能以f a d 作为辅基 接受电子进行氧化磷酸化 提供微生物 细胞所需的能量 根据酶与f a d 的结合方式 可将胆固醇氧化酶分为非共价结合 i 型 和共价结合 i i 型 两种形式 链球菌s t r e p t o m y c e ss p s a c o o 产生的胆固醇氧化 酶 s c o 和来源于短杆菌b r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u m 的胆固醇氧化酶 b c 0 1 属于i 型酶 来源于另一株短杆菌b r e v i b a c t e r i u m 的胆固醇氧化酶 b c 0 2 属于i i 型酶 4 j g a d d a 等人 5 j 对这两种酶的性质进行比较发现 i 型酶和l i 型酶都具备黄素蛋白氧化酶特性 即具有与亚硫酸盐形成黄素加合物的能力以及光还原形成热动力学稳定的红半醌阴离 子的能力 但i i 型酶产生黄素加合物的速度是i 型酶的5 0 倍 i i 型酶的氧化还原电势 中点比i 型酶的高 1 0 0 m v 另外 两类酶中f a d 的氧化型 半醌型以及全还原型的光 谱特性均有差异 1 2 不同微生物产胆固醇氧化酶的分离技术概况 多数微生物都需要胆固醇诱导才能产c o d 胆固醇是脂溶性物质 难溶于水 所 以 胆固醇在培养基中的分散效果成为影响产酶的重要因素 目前 大部分研究者利用 表面活性剂促进胆固醇的分散 但表面活性剂 胆固醇和c o d 会形成乳化体系 对分 离纯化带来很大的困难 如何破除乳化体系 是分离纯化需要解决的关键问题 表1 1 不同微生物来源的c o d 的部分酶学性质 t a b l e1 1p r o p e r t i e so fc h o l e s t e r o lo x i d a s ef r o md i f f e r e n tm i c r o o r g a n i s m 微生物酶分子量 k d 米氏常数 m o l l 存在位置 短杆菌属 b r e v i b a c t e r i u m 够 5 58 2 x1 0 胞外 红球菌属 r h o d o c o c c u ss p 5 59 0 x 1 0 1 胞外或胞内 诺卡氏菌属 n o c a r d i a s p 6 4 2 8 x 1 0 4 胞内 假单胞菌属 p s e u d o m o n a ss p 6 0 2 5 1 0 胞外或胞内 链霉菌属 s t r e p t o m y c e ss p 6 04 o x l 0 1 胞外 芽孢杆菌 b a c i l l u s l 3l 胞外 c o d 的分离方法很多 不同微生物来源的c o d 其分布及其酶学性质各有差异 有的吸附在细胞膜上 能够直接分泌到发酵液中 表1 1 而c o d 的提取技术的选择主 要取决于酶的分泌特性 因此 不同微生物产生的c o d 的分离方法也各有不同 下面 按微生物菌种分类 介绍不同菌种的分离纯化研究现状 1 2 1 短杆菌属 b r e v i b a c t e r i u m 册 短杆菌属野生菌产生的c o d 的k m 值低 胞外分泌 而且在氧化胆固醇的过程中 氧化产物单一 不产生其它胆甾类副产物 目前 短杆菌产生的c o d 已成为该领域的 研究热点 而且日本已将其成功应用到工业化中 为了有效地破除乳化体系 可以用表面活性剂萃取法破除乳化体系 本实验室做了 大量这方面的研究 季文明t 6 幂u 用t r i t o nx 1 1 4 作为表面活性剂 与无机盐形成双水相 2 引言 在一定温度以上 包含c o d 的表面活性剂就会从水相中分离出来 这样就可以将乳化 体系中的c o d 萃取出来 该技术操作简单且成本低廉 所以大规模应用很有前景 随着科学发展 三相分离技术逐渐被用来破除乳化体系 王龙刚 3 利用刚h 4 2 s 0 4 与叔丁醇混合后形成有机相 中间沉淀相和水相的三相 分离乳化体系中的c o d 效 果显著 比酶活提高了3 4 9 倍 收率9 3 该法简单有效 易于放大 因此 可以用 其对粗酶液进行预处理 破除乳化体系 另外 亲和层析 离子交换与凝胶层析在该酶的分离中有一定应用 季文明等 7 利 用c o d 和底物胆固醇之间的亲和力 以胆固醇为吸附剂构成底物亲和层析柱 从短杆 菌的发酵液中分离得到c o d 收率为6 4 纯度提高3 4 倍 该法专一性强 但不适合 大规模处理 日本u w a j i m a 8 瓤j n h 4 2 8 0 4 盐析 d e a e c e l l u l o s e s e p h a d e xg 7 5 层 析方法 在 h 4 2 s 0 4 溶液中制得c o d 结晶 双水相萃取 三相分离技术以及层析手段都能分离得到c o d 这几种方法各有特 色 双水相萃取简单有效 三相分离收率高 两者都能破除乳化体系 但只能针对粗酶 液的处理 要获得纯度高的c o d 还需进一步纯化 层析方法能分离得到纯度高的c o d 但不能破除乳化体系 为此 应结合有机溶剂萃取法和层析法的优势 用前者处理粗酶 液 用后者进一步提纯 这样就能获得纯度 收率均较高的c o d 1 2 2 链霉菌属 s t r e p t o m y c e s 够 目前 日本对s t r e p t o m y c e s s p 产生的c o d 的研究已经很成熟 成功将c o d 基因克 隆到基因工程菌 并且实现规模生产 现在市场上应用到的c o d 大部分为这种酶 多数链霉菌属产生的c o d 为胞外酶 此类酶一般都用浓缩方法处理粗酶液 酶的 浓缩方法常用的有沉淀法 超滤等 而沉淀法又有机溶剂沉淀法和无机盐沉淀法 由于 有机溶剂易使酶失活 常用无机盐来处理粗酶液 无机盐中最常见的是用州4 2 s 0 4 使 c o d 沉淀 叫i 4 2 s 0 4 盐析设备要求简单 成本低 便于小批量生产 但 n h 4 2 s 0 4 盐 析中对盐浓度和酶浓度都有限制 n h 4 2 s 0 4 浓度达到一定范围 会使部分c o d 活力降 低 甚至失活 c o d 的浓度太低不易于分离 超滤收率虽高 且不易引入其他杂质 但设备要求高 因此 在应用中研究者应根据实际情况来选用 r i mv a r m a 等1 9 j 将 s t r e p t o m y c e sl a v e n d u l a en c i m2 4 2 1 的c o d 分别用三醋酸纤维素膜超滤浓缩和8 0 的 n h 4 2 s 0 4 盐析 收率分别为9 0 和8 3 此两种方法收率虽然都很高 但是它们都无 法破除乳化体系 酶纯度很低 因而在酶的浓缩时也应该考虑到破除乳化体系的问题 以便于后期的纯化 浓缩用于处理粗酶 为了获得更高的纯度 还要可用离子交换层析等方法进行进一 步提纯 d e a e s e p h a r o s e 同样也被应用来进一步分离c o d m t a b a t a b a e iy a z d i 等 l 叫 仅用一步d e a e s e p h a r o s e 离子交换层析分离来自s t r e p t o m y c e sf r a d i a e p t c c1 1 2 1 的胞 外c o d 用磷酸缓冲液 1 0m m p h8 5 平衡 0 0 5 mn a c l 与醋酸缓冲液 1 0 r a m p h4 5 阶段洗脱 纯化得到的c o d 经s d s p a g e 得到单一条带 当单一的层析方法难以达到 理想的分离效果时 常采用几种层析联合的方法分离纯化c o d l a r t i l l o t 等 l l 报道用超 滤 离子交换层析和凝胶层析纯化s t r e p t o m y c e ss p 产生的c o d 收率达到4 2 江南大学硕士学位论文 链霉菌安全性能高 已经广泛被应用到工业生产 所产的c o d 分离操作相对简单 而且热稳定性强 工业应用前景广阔 1 2 3 诺卡氏茵属 n o c a r d i a 跟 诺卡氏菌属是由t u r f i t tg e 首次发现能产c o d 的菌株 国内对n o c a r d i as p 所产的 c o d 研究较少 目前仅见国外报道 常用非离子表面活性剂 去诟剂等萃取c o d 和破 除乳化体系 如果纯度还没达到要求 还可将沉淀过后的c o d 通过各种层析方法分离 砌c h m o n d 1 2 用1 的t r t o nx 1 0 0 萃取c o d 收率7 0 粗提后再把萃取得到的c o d 经过d e a e s e p h a r o s e 离子交换层析 得到比活提高4 倍的c o d k u l a t l 3 1 用双水相非 离子聚乙烯去垢剂直接从n o c a r d i as p 中萃取后用离子交换层析得到纯化倍数为1 6 0 总 收率7 5 8 0 纯化后的酶可作为诊断用酶和食品用酶 迄今为止 诺卡氏菌属的c o d 还未曾实现工业化 可能是由于c o d 存在于细胞膜 上 与其它蛋白 脂类物质结合在一起形成混合胶束集团 这种胶束集团无法分离 限 制了它的应用 1 2 4 红球菌属 r h o d o c o c c u ss p 红球菌属是目前所知道的产c o d 活性比较高的菌株 有胞外酶和胞内酶两种类型 胞外酶与胞内酶性质不同 胞内酶存在于细胞膜 分离难度大 因此 有时为了降低分 离难度 只分离胞外酶 不考虑胞内酶 m a c h a n g u 等 1 4 j i 过 n h 4 2 s 0 4 盐析 离子交换 层析 凝胶层析将r h o d o c o c c u se q u i 的c o d 纯化了3 2 8 倍 收率0 3 纯度很高 但 收率低 可能乳化体系造成酶的大量损失 为了提高收率 许多研究者也常借鉴诺卡氏属的分离方法 采用t r i t o nx 1 0 0 萃取 膜上的c o d t r i t o nx 1 0 0 是一种表面活性剂 不仅能够萃取胞内酶 而且破除乳化体 系的效果显著 李清1 1 5 分别比较了t r i t o nx 1 0 0 与t w e e n8 0 提取r h o d o c o c c u se q u i 4 2 中的胞内酶 发现0 5 的t r i t o nx 1 0 0 提取效果更好 提取时间为1 0r a i n k r e i t 等 l 卅 利用t r i t o nx 1 0 0 处理r h o d o c o c c u ss p g k 1 的细胞 使c o d 释放出来 收率超过9 0 近几年 由于发现该种属具有高度的病原性 所以人们对其商业化应用的研究较少 1 2 5 假单胞菌属 p s e u d o m o n a ss p 假单胞菌的c o d 的研究起步较晚 为了破除乳化体系 借鉴了前人的分离方法 不同之处在于提取胞外酶时利用t r i t o n x 1 0 0 与层析法结合破除乳化体系 即在层析时 破除乳化体系 r h e e 等 1 7 曾用一步层析法纯化了p s e u d o m o n a ss p 的c o d 提取流程如 下 将p s e u d o m o n a s 的发酵液经离心后 上清液用亲和柱分离 经磷酸钾缓冲液 1 0m m p h7 5 平衡 用t r i t o nx 1 0 0 0 0 1 线性洗脱 洗脱时能够破除乳化体系 收率超过 7 0 假单胞菌也能产胞内酶 不过未见其提取方面的详细报道 多数研究在于粗酶液 的制备 赵芳 ls 分别比较了冻融 非离子表面活性剂 研磨 超声波 超声波结合溶菌 酶5 种破壁方法 确定超声波为该菌的最佳破壁方法 不过 考虑到后期的提纯与收率 的提高 还是应该选择能够破除乳化体系的非离子表面活性剂方法比较合适 4 引言 假单胞菌产生的酶主要存在于胞内 破壁困难 且底物专一性不强 除能氧化胆固 醇外 还能以其他固醇类物质为底物 因此 实现工业化还存在很大困难 1 2 6 基因工程茵 大部分产生c o d 的野生菌均为诱导型菌株 即在表达c o d 时需要胆固醇的诱导 使胆固醇与c o d 形成乳化体系 对提取带来很大困难 前人通过诱变等手段希望能选 育得到非诱导型菌株 但没有成功 基因工程菌不需胆固醇的诱导 避免了乳化体系的 形成 简化c o d 提取流程 因此 许多研究者通过构建基因工程菌来解决胆固醇的诱 导问题 国内外研究较多的c o d 基因是来源于链霉菌的c o d 基因 c h o a 和短杆菌的c o d 基因 c h ob m o l m i ri 1 9 等将含有链霉菌s a c o o 的c h o a 基因克隆到穿梭载体上 转 化变铅青链霉菌1 3 2 6 后发现 转化子的酶产量比野生菌株提高了7 0 倍 但酶活性只有 野生菌株的3 0 张玲 2 0 将短杆菌b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c 8 2 c o d 基因c h ob 克隆 到大肠杆菌中 表达量高 酶活力有待于进一步提高 基因工程菌大多产胞外的c o d 细胞分泌的杂质少 并且不用破除乳化体系 使 基因工程菌所产的c o d 分离较为简便 y o s h i a k in i s h i y a 等1 2 l 用d e a e s e p h a r o s e 凝 胶层析后的c o d 经s d s p a g e 得到单一条带 用基因工程菌能够提高产量 增强热稳定性 通过分子生物学手段 给目的产物加 上标签 利用亲和层析 简化分离步骤将是c o d 分离纯化的发展方向 目前 尽管基 因工程菌存在酶活力低等问题 毫无疑问 基因工程菌将是未来生产c o d 的最主要菌 株 表1 2 各种微生物产生的c o d 分离方法 t a b l e1 2p u r i f i c a t i o no fc h o l e s t e r o lo x i d a s ef r o md i f f e r e n tm i c r o o r g a n i s m 综上所述 c o d 的提取方法灵活多样 可根据具体的菌属来选择方法 表1 2 不过破除乳化体系 表面活性剂是非常有效的 野生茵所产的c o d 的分离纯化比较烦 琐 基因工程菌在这方面很有优势 随着科学的发展 基因工程菌将代替野生菌成为最 主要的生产菌株 亲和层析也将大量地应用在分离带标签的c o d 上 江南大学硕士学位论文 1 3c o d 的应用研究现状 1 3 1 检测胆固醇含量 c o d 能够将胆固醇氧化为胆甾 4 烯 3 酮 并产生过氧化氢 过氧化氢在过氧化氢 酶的作用下能将4 氨基安替比林 苯酚转化为醌亚胺 红色物质 在5 0 0i n n 处有最大吸 收峰 醌亚胺 图1 2 利用过氧化氢酶的偶联反应检测胆固醇 f i g 1 2d e t e c tc h o l e s t e r o lb yu s i n gc a t a l a s ec o u p l i n gr e a c t i o n 如图1 2 通过检测紫外吸收强度或通过比色法就可以测定胆固醇的含量 因此 c o d 可以用于胆固醇含量的检测 1 3 1 1 检测血清中的胆固醇含量 正常人血清中胆固醇含量较为稳定 一般维持在1 4 0m g a 1 1 9 0m g d l 血清中胆固 醇含量常做为衡量健康的指标 所以c o d 应用检测血清中的胆固醇含量引起许多研究 者的兴趣 s r i s a w a s d i 等 2 2 j 利用来源于链霉菌和短杆菌的c o d 测定血清中的胆固醇 比较发现 链霉菌所产的c o d 在灵敏度等参数上更有优势 p o m t i ph l o l e k h 等1 2 3 j 将链 霉菌 假单胞菌 纤维单胞茵 短杆菌所产的c o d 检测血清中的胆固醇含量 发现后 三者的效果接近 当血红蛋白的浓度为1 9g l 假单胞菌的c o d 检测血清中的胆固醇 会受到干扰 准确率大为降低 为了使c o d 能重复利用 稳定性增强 常将c o d 固定 制成传感器形式 如s e a n b r a h i m 等 2 4 将c o d 固定在2 羟基甲基丙烯酸乙酯 多吡咯双分子膜上 用来检测血清 中的胆固醇 1 2 个月后 仍保持8 0 的活性 检测结果良好 为检测血清中其他甾醇 类物质 c o d 常与其它酶结合在一起 例如将c o d 与胆固醇酯酶固定在聚苯胺薄膜上 热稳定性好 检测血清中的胆固醇含量 最高可达5 0 0m g d l s u m a n 等 2 5 j 用烷基胺玻 璃珠将c o d 胆固醇酯酶 过氧化氢酶固定在一起 检测血清中的胆固醇含量 相关 性良好 目前 医院中采用的都是由c o d 制成的试剂盒来检测血清中的胆固醇含量 所用 的胆固醇纯度要求较高 一般需要进口 6 昌审 茂 铆6荆糯 9 玲m 一 9 跫一 赛扣 引言 1 3 1 2 检测食品中的胆固醇含量 目前 食品中胆固醇的定量分析方法主要有比色法 酶法 气相色谱法和高效液相 色谱法 传统的比色法由于操作手续繁杂 特别是样品的前处理和样品中脂肪的提取 持续时间长达7 2h 而且所需试剂多 造成了比色结果的偏差和计算结果的复杂化 且 成本高 从而限定了该方法的广泛使用 气相色谱法和高效液相色谱法测定结果准确 但需要特殊的设备 所以都难于推广使用 酶法技术含量较高 特异性强 避免用毒性 大而昂贵的试剂 安全可靠 可广泛应用于食品中胆固醇含量的检测 1 3 2 去除食品中的胆固醇 胆固醇是环戊烷并多氢菲的衍生物 亦 胆甾醇 是动物体内最重要的固醇 但 人体内过多的胆固醇将引起高血脂 并进而引发动脉粥样硬化 高血压 冠心病等一系 列心血管疾病 表1 3 各类食品中的胆固醇含量 t a b l e1 3i h ec h o l e s t e r o lc o n t e n tf r o mv a r i o u sf o o d 有许多食品 表1 3 中含有大量胆固醇 而人体中的绝大部分胆固醇就来源于这些食 品 因此 很有必要控制这些胆固醇的摄入 1 3 2 1 去除蛋黄中的胆固醇 蛋黄中胆固醇含量约占蛋黄重的1 2 约为2 0 0 2 5 0m g 枚 是食品中含量较 高的一种 蛋黄的去除方法主要是有机溶剂抽提法 超临界c 0 2 萃取法 1 3 环状糊精 包合法 酶法 有机溶剂抽提法不能选择性地去除胆固醇 严重影响蛋黄的功能特性 1 3 环状糊精包合法脱去胆固醇的同时 还有1 3 环状糊精残留 超临界c 0 2 萃取法能较 好地解决上述问题 但超临界c 0 2 萃取设备费用高 酶法专一性强 安全性高 近年来 研究较多 a i l h a r a 等 2 6 人将红球菌产生的c o d 用于氧化蛋黄中胆固醇的试验 发现利用酶液 转化蛋黄胆固醇的时候 c o d 和磷脂酶c 共存可以促进胆固醇的氧化 j o h n s o n l 2 7 1 研究 证明 采用红球菌的提取液处理氧化蛋黄中的胆固醇其转化率达到4 0 本实验室吕陈 峰等 2 8 j 用短杆菌的c o d 氧化蛋黄中的胆固醇 通过响应面分析法 优化酶法转化蛋黄 胆固醇的工艺 模拟优化的条件下 胆固醇转化达8 5 6 1 氧化产物单一 但不是所 7 江南大学硕士学位论文 有菌株 2 9 3 0 产生的c o d 的氧化产物都是单一的 如假单胞菌所产的c o d 能够以其他固 醇类物质为底物 产生一些杂质 出于安全考虑 应选择氧化产物单一的c o d 作为食 品用酶 1 3 2 2 去除油脂中的胆固醇 胆固醇广泛存在于油脂中 是血液中胆固醇含量过高的重要因素 但油脂也是重要 的营养源 不可限制或禁止食用油脂来降低血液中的胆固醇的含量 有效和实用的方法 是脱除油脂中的胆固醇 目前 利用c o d 去除油脂中的胆固醇处于起步阶段 江正强 3 1 为了脱除猪油中的胆固醇 且需保持猪油的原有风味 选择c o d 脱除胆固醇 取得 良好效果 通过正交实验确定最佳的工艺条件 酶用量0 0 1u g 工作时间4h 乳化剂 用量为2 去除胆固醇的猪油的各项理化指标也符合国家食用标准 因此 可以将此 法推广到其它油脂中胆固醇的去除 1 3 3 其他应用 c o d 是近年来才发现的一种抗虫蛋白质 它对敏感害虫 鞘翅目的棉铃象甲的毒性 与早期发现的b t 毒蛋白相当 而且可以破坏鳞翅目昆虫内消化道的上皮细胞 抑制昆 虫的生长发育 特别是对棉籽象鼻虫的幼虫 是一种有效的杀灭幼龄鳞翅目昆虫的杀虫 剂 基于上述机理 可以将c o d 基因克隆到植物中去防治害虫 如将c o d 基因克隆到 棉花中抑制棉铃象甲的幼虫的生长发育 或将c o d 基因到烟草中 3 引 以获得抗鳞翅昆 虫的转基因新植株 c o d 可以专一性地把胆固醇氧化为胆甾 4 烯 3 酮 胆甾 4 烯 3 酮是一系列固醇类 激素药物的前体 可以将其制成药物 如以胆甾 4 烯 3 酮为前体 用微生物酶法转化 为雄性激素 近年来 c o d 的新应用的研究主要是 m a r t av m e n d e s 等 3 3 将链霉菌的 c o d 经分离纯化后 加入发酵培养基中 发现能恢复匹马霉素的产生 同时其它菌属 的c o d 也可以刺激匹马霉素产生 也就意味着c o d 能作为标记蛋白来制备一种抗真菌 药 聚烯匹马霉素 1 4 立题背景及本文的主要研究内容 美国和日本对c o d 研究比较深入 尤其是日本 已经率先实现了基因工程c o d 的 商品化 我国对c o d 的研究起步比较晚 研究机构也比较少 本实验室9 5 年从土壤中 分离了一株产c o d 的短杆菌 从此便开展c o d 的相关研究 经过多次诱变育种 产酶 能力有较大的提高 并在分离纯化 应用等方面取得了一定的成果 但大部分产生c o d 的野生菌均为诱导型菌株 即在表达c o d 时需要胆固醇的诱导 使胆固醇与c o d 形成 乳化体系 对提取带来很大困难 前人通过诱变等手段希望能选育得到非诱导型菌株 但没有成功 本实验室构建了一株重组e c o l i 的胞内c o d 工程菌 避免原始菌发酵液 中残留胆固醇的影响 本文研究内容是 1 重组e c o l i 产胞内c o d 提取 纯化工艺研究 8 引言 2 重组e c o l i 产胞内c o d 酶学性质研究 最适反应温度及热稳定性 最适反应p h 及酸碱稳定性 分子量的测定 动力学参数测定 3 探索分离所得的c o d 用于蛋黄中胆固醇的去除工艺 9 江南大学硕士学位论文 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌株 重组e c o l i p t r c 9 9 a 1 2 0 1 由本实验构建并保藏 2 1 2 主要仪器 c r 2 2 6 高速冷冻离心机 台式高速离心机 7 5 4 u v 紫外可见分光光度计 双垂直电泳槽 d y y 一6 b 型稳压稳流电泳仪 b s z 一1 0 0 自动部分收集器 b t 1 0 0 恒流泵 h d 一9 3 1 紫外检测仪 x w t s 小型台式记录仪 层析柱 a k t a 蛋白质纯化系统 h 6 6 m c 型超声仪 h p l c 凯氏定氮仪 索氏抽提装置 2 1 3 主要试荆 牛血清蛋白 d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w p h e n y ls e p h a r o s e6f a s tf l o w s e p h a d e xg 7 5f i n e c m s e p h a r o s ef a s tf l o w 蛋白质分子量标准 低 考马斯亮蓝g 一2 5 0 丙烯酰胺 标准蛋白 其他试剂为国产分析纯或色谱纯 日本日立公司 s i g m a 公司 上海分析仪器总厂 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 上海沪西分析仪器厂 上海沪西分析仪器厂 上海金达生化仪器有限公司 上海自动化仪表三厂 上海锦华 g eh e a l t h c a r e 无锡超声设备有限公司 惠普 杭州托普仪器有限公司 嘉盛科技有限公司 上海丽珠东风生物技术有限公司 购自s i g m a 公司 购自s i g m a 公司 购自s i g m a 公司 购自s i g m a 公司 t a k a r a 公司 大连 产品 f l u k a 进口分装 m e r k 公司 s i g m a 公司 1 0 第二章实验材料与方法 2 1 4 培养基 1 l b 培养基 l 蛋白胨1 0 酵母提取物5 氯化钠1 0 蒸馏水1l p h7 0 高 压灭菌 4 c 保存 加入2 琼脂为l b 固体培养基 2 2 y t 培养基 l 蛋白胨1 6 酵母粉1 0 n a c l5g 3 半合成发酵培养基 g l 胰蛋白胨1 6 酵母提取物1 0 甘油1 0 k h 2 p 0 42 k 2 h p 0 44 n a 2 h p 0 4 1 2 i q 2 07 n h 4 2 8 0 41 2 n i h c l0 2 m g s 0 4 7 h 2 01 和微量元素 溶液 2 2 方法 2 2 1 常用试剂的配制 4 0 1m o l l p h7 0 磷酸钾缓冲液 分别称取2 8 0 6 4gk 2 h p 0 4 和1 0 4 8gk h 2 p 0 4 再分别定容到1l 按 工业微生物实验技术手册 p 6 8 5 比例配制缓冲液 3 5 b r a d f o r d 配方 a b r a d f o r d 储存液 1 0 0m l9 5 乙醇 2 0 0m l8 8 磷酸 3 5 0m g s e r v ag 蓝 室温下长期保持稳定 b b r a d f o r d 工作液 4 2 5m l 双蒸水 1 5m l9 5 乙 醇 3 0m l8 8 磷酸 3 0m lb r a d f o r d 储存液 滤纸过滤 保存于室温棕色瓶中 使用 前需要在过滤 6 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂 3 0 丙烯酰胺混合液 a c r b i s 为2 9 1 称取丙烯酰胺 a c r 3 0g 及甲叉丙烯酰胺 b i s 0 8 2g 用去离子水1 0 2 7m l 溶解后滤纸过滤 棕色瓶中于4 c 密封保存 1 5 m o l l p h 8 8t r i s h c i 缓冲液 分离胶缓冲液 三羟甲基甲烷 t r i s 18 2g s d s 0 4g 加双蒸馏水至9 0m l 使其溶解 浓盐酸调p h 至8 8 然后用双蒸馏水稀释至1 0 0m l 置棕色瓶中 4 贮存 1 0m o l l p h 6 8t r i s h c i 缓冲液 浓缩胶 t f i s6g s d s0 4g 加双蒸馏水8 0m l 调p h 至6 8 用双蒸馏水稀释至1 0 0m l 置棕色瓶中 4 c 贮存 t r i s 甘氨酸电泳缓冲液 称取秭s6 9 甘氨酸2 8 8g s d s1g 加蒸馏水8 5 0m l 调p h 至8 3 加蒸馏水