（发酵工程专业论文）粗糙脉孢菌漆酶基因的克隆、定点诱变及其在毕赤酵母中的表达.pdf

中文摘要 摘要 漆酶( 1 a c c a ) 是一类含铜的多酚氧化酶，它以氧作为终电子受体，能催化许多化合 物的氧化反应，其作用底物比较广泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧 酸及其衍生物等。漆酶在造纸工业、纺织工业、环境保护、生物资源利用、有毒环境污 染物转化和新能源开发等诸多领域具有潜在的应用价值。粗糙脉孢菌 k 脚d m 口础阳 产生的漆酶( n c l ) 是一种有代表性的子囊菌漆酶，具有较好的耐热性能，最适作用p h 为6 ( 以愈创木酚为底物测定酶活) ，其编码基因中只有一个内含子。本文主要研究n c l 的基因工程菌构建、n c l 的最适p h 值定点诱变改造、n c l 改造后的酶学性质以及n c l 基因突变体的发酵条件。 采用连续延伸p c r 技术从：c ，姗口染色体d n a 中扩增出不舍信号肽序列的n c l 结 构基因，将该结构基因插入巴斯德毕赤酵母p 耙 面p 船幻，妇分泌型表达载体p p i c 9 k 的 多克隆位点，构建成能够在只p 船幻r 妇胞外表达n c l 基因的重组质粒p p i c 9 刚肠，重 组质粒以s 缸i 线性化后电转化p 口鲫砌恤讧7 1 。重组毕赤酵母在甲醇诱导下表达出 n c l 活性，最高酶活为2 9 4 u m l 。s d s p a g e 结果显示重组毕赤酵母分泌表达的n c l 分子量约为6 4 8 k d 。 设计引物时将n c l 结构基因中的v 甜( 缬氨酸) 、s e r ( 丝氨酸) 、g l y ( 甘氨酸) 对应的碱 基替换为l e u ( 亮氨酸) 、硪s ( 组氨酸) 、m e t ( 蛋氨酸) 对应的碱基，同样采用连续延伸p c r 技术从重组质粒p p i c 9 i 中扩增出n c l 诱变基因。将n c l 诱变基因插入只p 船幻r 括分 泌型表达载体p p i c 9 k 的多克隆位点，构建成能够在pp 船f d 廊胞外表达n c l 诱变基因的 重组质粒p p i c 9 科雠，重组质粒以跏i 线性化后电转化zp 傩幻r 括l ：m 7 l 。重组毕赤酵 母在甲醇诱导下表达出n c l 活性，酶活与定点诱变前相比没有提高。 粗糙脉孢菌漆酶基因突变体和重组野生菌的发酵液8 0 0 0r i 血冷冻离心1 0m i n ，取 上清，冷冻干燥，加入l om l 双蒸水溶解。再经过三次s e p h a d e xg 1 5 凝胶柱和一次 d & 垣s e p h a r o c l - 6 b 凝胶柱层析分离处理，分别得到了重组突变酶和重组野生酶的 纯酶溶液。s d s p a g e 结果显示纯化后的重组突变酶、重组野生酶均达到电泳均一，分 子量约为6 4 8 k d 。酶学性质研究表明，重组突变酶的最适作用p h 值由偏酸变为偏碱， p h 稳定范围向碱性扩大，而重组突变酶的其他酶学性质( 最适作用温度、热稳定性、金 属离子的影响、潜在酶抑制剂的影响等) 与重组野生酶相比没有改变。 系统研究了粗糙脉孢菌漆酶基因突变体在菌体生长和诱导表达两个阶段的摇瓶发 酵条件。采用优化的碳源( 2 0 9 l 的葡萄糖) 、氦源( 2 0 班的玉米浆) ，以培养基初始p h 5 5 ，接种量2 5 ，于2 2 0 咖n i n 、3 0 下摇瓶培养漆酶基因突变体，至第4 天时，生物量达到最高值，o d 。为5 ，3 6 2 ，比初始发酵条件下提高约2 0 ：采用优化的 碳源( 0 5 甲醇) 、氮源( 2 0 9 几玉米浆) ，以培养基初始p h5 5 ，于2 2 0 r m i i l 、3 0 下摇 瓶培养 7 ：c ，n 船口漆酶基因突变体，至第5 天时，漆酶酶活达到最高值，为3 8 8 i ，m l ( 以 愈创木酚为底物测定酶活) ，比优化前提高约3 1 。扩大到5l 发酵罐后删漆酶 坚堕奎兰堡圭兰垡堡苎 基因突变体的漆酶酶活最高可达3 9 6i 如i ，。 关键词：粗糙脉孢菌，漆酶，连续延伸p c r ，基因克隆，定点诱变，异源表达，巴斯德 毕赤酵母，酶学性质，最适作用p h 值，摇瓶培养 犍一；鬈l；。， 英文摘要 a b s t i 翟c t l a c c a s e sa r em u l t i c o p p e rp h e n o l o x i d a s e st l l a tc 删y z et h e 戚d a t i o no fa 嘣e t yo f p h e n o l i cc o m p o 吼d s ，、i mc c o m i 锄t d u c t i o no f0 2t oh 2 0 i n t e r e s ti nl a c c 船e sh 嬲b e e n 矗l e l e db yt l l e i rp o t e n t i a 王u si nd e t o x i f i 训o no f e n v i r o 咖a i t a lp o l l u t a n t s ，p v e n t i o no f w i n e d 。c o l o f a 五o n ， p a p e rp r o c e s s i i l g ，e m 可m a t i c n v e r s i o no fc 蝴c a li l i t c m 埘i a t c s ，a n d p r o d u c t i o fu s e 砌c h e m i c a t sf t o ml i g 面n l a c c a s ef 岫m 施加印口，口a n s 阳( n c l ) i sa r c p m s a n a t i v e 砌m y c e t el a c c a s e t h i sp a p e ri sm a i n l yf & u do nc o n s 缸u c t i o n s i t c - d i r e c t c d m u t a g c n e s i s ，e n z y m i cp r o p e n i e s 锄dc 叫t l l r cc o n d i t i o i l so fal a i 。c a s 争s e 咖i n ge n g i n e e r c d s 乜a m t mn e u m s p o r dc r a s s n t h es t n l c t i l g e n eo fn c lw i t t l o u ts i 鲫_ a is c q u e n c ew a s 锄p l i f i e df 如mg e n 砌cd n a o f c ，删b yu s i i l gs u c c e s s i v ep c rm e t h o d 1 1 1 eg ew 勰m 埔e di r i ：t ot 1 1 cm i l l t i p l e c l o 玎l i i l gs bo “c s ) o fp p i c 9 kas c c r e 血ge x p r e 嚣i o nv e 咖r “p 砌缸胛f d ，括，s o 比 r e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c 9 列k c cc o u l db eu s c d 证e x 虹a c e l l i l l a re x p r e s s b no f t h en c l1 h c p l a 如：l i dp p i c 9 k 肠c cw 船i i n e a r i z e d 、i t l l 配ia n du s e dt 0 由s f o 珊pp 船衙妇k m 7 1 a f k ri n d u c t i o nw i t l lm e t h 髓o l ，m er e c o m b i n 觚t 只p n ，幻一，e x p r e s 粥da c t i 、，cn c la 1 2 ：y m e t h em a x i m u ma c t i v i t yo fl a c c a r c a c h e d2 9 4 u n 1 l t 1 l em o l c c u l 孤w e i 出o ft l i e r e c o m b i n a i l tl a c c a s ew 硒a b o m6 4 8 l d ) b vs d s p a g e 1 1 l en l u t 强tg e 鹏o fn c lw 勰a m p l 砺e d 硒mr e c 锄b i 曲mp i a s m i dp p i c 9 壬fb y l l s i i l gs u c c e s s i v ep c rm e 山o d 1 kg e n cw 硒i i i s e n c di n t ot h cm i l l t i p l ec l o n m g 妣似c s ) o f p p i c 9 k m ed e c o m b i 船mp l a s m i dp p i c 9 到缸卵c o i l l db eu s e d mc x 廿a c e l l u l 缸e x p r e s s i o n o fm en c l t h ep l a s i r i i dp p i c 9 k ，肠c c w 部1 m 翩r i z e d 、】i ，i m & 彤ia n du s e dt o 缸a n s f o 蚰p m ，幻，括k m 7 1 a f t e f m d u c t i o n 谢t t lm e t h 锄o l ，地r e c o m b i n a n tzp 口f 幻r j se x p r c s s e da c t i v e n c le l l z ”m t h em a ) 【i i i l u ma c t i v 时o f l a c c a s cr e a c i i c dt t l es a m el e v e l 嬲i 招丽l d t y p cs 臼a i l l b o t hm em u t a n tl a c c a s e 绷dt h e 、v i l d t y p cl a c c 硒ew e r ep u r i f i e dt oa p p a 湖t e l c c 仃o p h o r e t i ch o r n o 寥n e 姆哪i n gs e p h a d e xg 1 5 觚dd e a es 印l 脚1 kf n o l e c u i a r w e i 曲t so f 也et 、 ，op i l r i f i e dl a c c a s w e a b o u t “8 k db ys d s p a g e w 伍g u a i a c o lt t l ep h o p t i l i l ao ft l l em u t a n tc i l 巧m e 觚dt l l ew i l d - t y p el a c c a s ew e r e8 o 趾d6 o ，r e 印l e c t i v e l y t h e m u t a ml 越c a s ew 鹬s t a b l ea tp h3 5t o9 o ，w h e r e 部t h ew i l d t n l a c c a s cw 雒s t a 曲l ea tp h3 5 t o7 5 c o m p a r e dw i mm e 、i l d 臼p el a c c a ，t l l ep u r i f i e da 1 2 = y m eh a dn oc h a n g e si no m e f a 1 2 y m i cp 】举r t i e s f e 锄衄t a t i o nc o n d i t i o 璐o f n 坞m u t 缸l ts n a i 芏li ns h a ：k e - n a s kc l l l t i v a 矗o nw e i n v e s t i g a t e d 1 1 圮m a ) 【i m u mb i 伽嬲“o d 6 曲r e a c h e d5 3 6 2w 1 1 c nt h es 妇i 1 1w 鹊c u t t u r 。da t3 0 柚d p h 5 5 、v i t l l2 0 9 ，lg l u c 0 勰c 缸b o n u r c ca n d2 0 9 lc o ms 蛔印l i q l r 嬲l l i 仃o g 吼u r c c n 砖m a x i m 咖a c t i v i t vo fl a c c a s er e a c h e d3 8 8 ii m i ，w h e nt l l es t 阻i nw 鹊c i l l t u r e da t3 0 缸dp h 5 5 、i mo 5 m e m 锄o la sc 副怕ns o u r c ea n d2 0 9 儿c o ms t c 虻pl i q u o ra sl l i o 盛e n s o u r c e t h em a x i i n 砌a c t i 啊t vo fl a c c a s ed e a c h e d3 9 6 u m lw h e n l es 喇nw a sc i l l t i l l 日i na5 lf 毫r i i l e n t c l k 巧w o r d 肫埘n 驴n 阳臼删，l 孤撇，as u c c e s s l v ep c rm e m o d ，g e n ec l o n i l l g ， s “e - d i l 优t c dm u t a g e n e s i s ，h e t e r o i o g o u se x p r c s s i o n p 缸厅蛔p f o 廊，o p t 删r c t i o np h ， 伽哪n i cp r o p 哟，s h a k e n a s kc u l t i i r e m k-， 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：二逮啦日期：汐易年芗月日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：掉导师签名狲 日期：6 辟 月日 锄 第一章绪论 第一章绪论 1 1 漆酶的概念 漆酶( 1 a c c a ) 又称苯二醇：氧氧化还原酶( p d i p h e n o l ：o x y g o x i d o 硎u c t a s e ； e c l 1 0 3 2 ) ，是一类含铜的多酚氧化酶。漆酶是最简单的多铜氧化酶，一般含有 4 个铜原子，这4 个铜离子处于漆酶的活性部位，在催化氧化反应中起决定作用。 漆酶能催化氧分子通过4 个电子还原成水，并且伴随着一些酚类和芳香类底物的 氧化，这些酚类和芳香类化合物脱去羟基上的电子或质子，形成自由基，导致酚 类及木素类化合物裂解。 1 2 漆酶的来源和分布 漆酶因1 8 8 3 年日本学者y o s h i d a 首次在日本紫胶漆树( 胄矗埘v 硎f c 琚m ) 的渗 出液中发现而得名，以后的研究进一步发现漆酶广泛存在于昆虫、植物和真菌中， 尤其在一些能够降解天然木素的白腐菌中大量存在。超过7 0 种不同来源的白腐真 菌菌株已经被鉴定能产生漆酶，其中绝大部分为担子菌( 约占8 0 ) ，其次为子囊 菌( 约占1 5 ) ，极少数为半知菌和其他低等真菌( 约占4 ) ，尚未在酵母菌中发现 有内源性漆酶。到目前为止，仅有5 株细菌被鉴定能合成漆酶样活性蛋白质，且 细菌漆酶在理化性质上与真菌漆酶有较明显差异“捌，而最近的研究表明，漆酶 可能也广泛存在于细菌中嘲。 漆酶是个古老的氧化还原酶，与植物中的抗坏血酸氧化酶( 雒c o f b i ca c i d o x i d a ) 、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白( n l l o p l a s m 曲同属蓝色多铜氧化酶( b l l l c m u m c o p p e ro x i d a ) 家族中的同一亚族，在结构和功能上三者存在许多相似之 处，其中漆酶的结构最简单，三者的催化机理也相同。 1 3 真菌漆酶的诱导与合成 根据真菌漆酶的生成方式的不同，可将其分为组成型漆酶( c o n s t i t i l t i v e l a c c a s e ) 和诱导型漆酶( i n d u c i b l el a c c a ) 两种。组成型漆酶的合成贯穿于菌体生 长各个阶段，在菌体初级生长阶段即已合成，不因菌龄改变而停滞，其合成量一 般较少受诱导物影响。诱导型漆酶的合成一般发生于菌体生长代谢次级阶段，菌 体生长条件复杂，产酶量和活力不稳定，酶活水平易受营养条件和多种外界因素 影响，目前发现的大多数真菌漆酶均为诱导型产酶。 漆酶的诱导剂多为酚类底物类似物，如香草酸，香豆酸、单宁酸、黎芦酸、 阿魏酸、咖啡酸、地衣酸、苄醇、焦儿茶酚、愈创木酚( g u a i a c 0 1 ) 、紫丁香醛、 吐温、甲苯胺、二甲苯胺等这些物质结构上的共同特征是芳环上连有一0 h 或 卟m 2 基团。 通过对漆酶基因上游序列的分析发现，一些特殊序列的存在与否决定了该酶 堂堂塑l 一l 的表达形式诱导型或组成型，诱导型菌株的调控序列中含有一段受酚类化合 物作用的序列，而不含有这样序列的漆酶基因则都是组成型表达的1 几乎每个菌株均能合成多种漆酶同工酶，并以同工酶形式分泌到细胞外，如 灰葡萄孢菌佃d f ，如c 妇旭d ) 能合成3 种漆酶同工酶，风尾菇c p f e z 肋s 咖嵋巧“) 有5 种漆酶同工酶，其中1 种为组成型，其它4 种为诱导型嘲另外，同一菌株产 生的漆酶同工酶在理化性质上彼此之间存在的差异不一，有的高度相似，有的具 有较低的序列相似性，在作用底物专一性、碳水化合物含量及其组成、最适反应 温度和p h 值等性质上有明显不同 影响真菌漆酶合成的生理条件包括碳、氮营养源，溶解氧，重金属和芳香族 化合物等。通常情况下，使用营养丰富的碳、氮源培养有利于获得较高的漆酶酶 活哪，但诱导型漆酶合成的启动往往开始于发酵培养基中碳源营养物质( 如葡萄 糖) 的浓度趋近于零。氧是真菌生长的限制因素之一，液体发酵培养过程中适量 供氧有利于漆酶合成，但溶氧过多有时会使漆酶产率降低m 。铜是漆酶蛋白的结 构组分，也是漆酶合成的诱导剂，它能有效提高多种真菌漆酶同工酶产量嘲。一 些与木素结构单元类似的小分子芳香化合物，作为漆酶合成诱导剂也被广泛用于 提高酶产量嘲，如苯胺化合物和木素制备物是较早使用的漆酶合成诱导剂，2 ，5 一 二甲苯胺( 2 ，5 - x y n d i i l e ) 对于多数真菌是最有效的。f a h r a e 璐和r e i n l 】a l n 蝴f n 0 1 报道 使用该化合物能使云芝漆酶的酶活提高1 6 0 倍以上。 一些环境条件如培养温度、光照时间等，也能对菌株生长及其漆酶合成产生 影响。如风烛n a 1 报道蜜环菌臼r m f 踟妞埘旧f 艮) 漆酶和p a i m 衙 ”报道侧耳菌 ( p 如舢f 淞疗铷f z 嚣) 漆酶的有效合成是在避光条件下进行的。 1 4 真菌漆酶的性质 1 4 1 理化性质 近些年来，已有多种不同来源的真菌漆酶得到分离纯化和性质研究( 表卜1 ) 。 这些真菌漆酶的分子量在5 0 8 0 l 【d a 之间，等电点p i 值为3 6 。皆为糖蛋白，含糖 约3 4 9 不等，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉 伯糖等。漆酶的来源不同，含糖量和种类也不同。由于分子中糖基的差异，漆酶 的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。另外， 含糖量的不同直接影响漆酶在s d s p a g e 中的迁移率“”。漆酶主要含有1 9 种氨基 、 。 酸；a s p ，t i l r ，g l u ，s e r ，p r o ，g i y ，a l a ，v a l ，c y s ，m e t ，i i e ，l e u ，1 p ，g i n ， p h c ，l y s ，h i s ，垭，脚。一一一 漆酶分子中一般都含有四个铜原子，但也有例外的情况，如双孢蘑菇 臼g 鲫记埘6 趣r 瓣) 产生的胞外漆酶只有2 个铜原子，纯化后的蛋白为淡黄色， 推测该酶中铜原子的存在方式与其他蓝色漆酶中的不同“”。射脉侧菌( p 矗跆6 抽 m 觑抛) 产生的漆酶只含有2 个铜原子，另外还有一分子的有机小分子吡咯喹啉醌 2 第一章绪论 ( p y r o 奴社n o l 嘛挪血埘垃，p p q ) 作为酶的辅基1 。从侧耳菌纯化的漆酶只含有一 个铜原子，却含有两个锌原子和一个铁原子，在6 0 0 咖处没有吸收，为白色漆酶 “”，而最普遍的含4 个铜原子的漆酶为蓝色蛋白。 表1 - 1 部分真菌漆酶的性质 t a b l e 卜1p r o p e r t i e oo fs o _ 峙f u n g a ii a a s e s 真菌漆酶大多为单体酶，但来自a 6 卸d m 和构巢曲霉。胖r 鲥妇n 纨缸瑚) 的漆酶则是由2 个相同亚基构成的二聚体，其全酶分子量分别为1 0 0 和 l l o k d a n 3 侧：而禾顶囊壳菌( g 缸p 堋彻加” 弦甜朋册加括) 和柄孢壳( 凡曲埘 a 邶e r i 舶) 漆酶各由3 个和4 个亚基构成，其分子量分别为1 9 0 和3 9 0 k d a 乜6 删 3 江南大学博士论文 漆酶的最适反应温度和最适作用p h 值随所使用底物和缓冲液不同而变化。报 道的大多数真菌漆酶在5 0 - 6 0 时能保持稳定，最适反应温度通常在4 0 - 5 5 之 间，有较好的耐热性能未最后鉴定的木素降解真菌p m l ( b a s i m o m y c e t ep 加 c e c 他9 7 1 ) 漆酶i 是目前热稳定性最好的真菌漆酶，当以愈创木酚为底物时，该 酶的最适反应温度是8 0 在6 0 条件下保温1 h ，酶活性未见明显减少，并随着 反应温度升高，酶活随之增加嗍而来自p 蛔肥r o c 他f c 肋v 面，a f 的和p l r e d f 埘 菌株漆酶的最适温度在3 0 左右，具有相对较差的热稳定性嘶“。 多数真菌漆酶的最适反应p h 值偏酸性，在4 0 6 0 之间，且在此p h 值范围内 稳定性较好，催化效率较高。来自担子菌的木硬孔菌( 足趔如印r 螂，f g 加s “幻漆酶 是少数最适反应p h 值接近中性的漆酶之一，而来自紧缩斑褶菇菌铆邪砒心 p q p f f f o m c e 螂) 的漆酶使用 2 ，2 一联氮基一甲叉( 3 一乙基一苯并噻唑啉一6 一磺 酸) ( a b t s ) 作底物时，测得的最适p h 值是3 o 嗍 漆酶催化氧化底物是靠电子转移实现的，叠氮钠被认为是漆酶真正的抑制 剂，较低浓度的叠氮钠能使酶发生不可逆性失活。其它的一些被认为是漆酶抑制 剂的巯基有机化合物如二硫苏糖醇( d ，r r ) 、疏基乙酸、半胱氨酸等对漆酶活性的 抑制现象是由于底物氧化过程中反应产物如a b t s 自由基正离子和二醌发生的还 原及后续的非酶相互作用引起的1 。铜螯合剂一般对漆酶的活性都有抑制作用， 但多数漆酶对低浓度的乙二胺四乙酸( e d t a ) 试剂不敏感，e d t a 能增加紫革耳 ( 尸臼硎s 邶砌f 琊) 漆酶的反应活性，a m 捌硎如册咖蝴印 豇啦脚漆酶对e d t a 的敏 感性要比粗毛云芝( 撕玩，肋呵l 盯珊) ，朱红密孔菌妒问即r 淞c 加砌甜伽琊) 的 小嘲。漆酶对一定浓度的氟化物或氯化物( 卤族元素) 较为敏感。氟化钠的浓度为 0 0 0 1 岬o n ，时，污叉丝孔菌( d 记l l l 0 肌f r 煅踯蚴跆厕漆酶活性为1 0 0 9 6 ；浓度为 o 0 1 凹1 0 虮肘，酶活降至3 8 9 6 ；当浓度为o 1 岫1 0 l l 时，漆酶完全失活。 1 4 2 漆酶的底物和漆酶活性的测定 漆酶以氧作为终电子受体，能催化许多化合物的氧化反应，其作用底物的专 一性不强，底物比较广泛，不同漆酶问作用底物也不相同，氧化的底物范围从一 种漆酶到另一种漆酶变化相当大。涉及的底物有单酚，邻、对苯二酚、甲氧基酚、 抗坏血酸和二胺化合物( 如苯二胺、多巴胺等) 。在一定条件下，少数真菌漆酶还 能以单酚( 甲酚) 和抗坏血酸为底物，使其发生氧化反应。另外一些真菌漆酶还能 催化木质素和甲氧基酚酸的脱甲基反应。但漆酶不能氧化转化酪氨酸。初步统计 漆酶催化氧化不同类型的底物己达2 5 0 个 按化学结构不同可将漆酶的底物分成7 类，包括( 1 ) 酚类及其衍生物：它们约 占漆酶底物总数的一半，主要是邻、对苯二酚等多元酚及其衍生物。漆酶不能催 化苯酚氧化，却能催化q 一萘酚和某些一元酚衍生物，后者取代基多在酚羟基的 邻、对位，随着取代基的种类、数目和在芳环位置上的不同，反应活力也有差异。 4 薹 i l ! f 释 第一章绪论 ( 2 ) 芳香胺及其衍生物：结构类似于酚类底物，主要为多氨基苯及其衍生物，如 邻、对苯二胺、l ，5 一萘二胺、联苯胺、n _ 苯基对苯二胺及一些取代的一元芳胺。 ( 3 ) 多环芳烃和杂环类化合物：如蒽( 觚t h l a c c ) 、苊( a c e i l a p h t h e ) 、芴( n l l o r e n e ) 及咔唑、n 一乙基咔唑等。( 4 ) 羧酸及其衍生物：一般指在芳环羧酸基的邻位或对 位连有羟基、氨基或烷氧基的芳香酸，碳链上连接有酚或非芳胺基团的非芳香酸， 如对氨基水杨酸、原儿茶酸、咖啡酸和对香豆酸等。( 5 ) 甾体激素和生物色素， 如a 一卵胞激素和雌甾二醇、己烯雌酚、胆红素、苏木色精等。( 6 ) 偶氮类人工合 成色素，如活性橙9 6 ( 蛾州v eo m n g e9 6 ) 、活性黑5 ( 心枷v eb l a c k5 ) 和活性紫5 ( r e t i v ev i o l e t5 ) 等。( 7 ) 金属有机复合物及其他非酚型底物，如二茂铁及其衍 生物等。后来有报道云芝( n d m e 协w 糟i c o j d ，) 漆酶在焦磷酸钠存在下，可将m n 2 + 氧化成m n ”，第一次证明漆酶可直接把m n 2 + 作为底物。 漆酶的氧化还原电势比较低，为3 0 0 - 8 0 0 m v ( 对标准氢电极) ，只能氧化降解 木素中的酚型结构单元，而不能氧化占木素9 0 的非酚型结构。1 9 9 0 年发现如果 有低分子质量的化合物作为氧化还原介体，漆酶能氧化非酚型木素结构，最适合 的介体是一些酚型化合物和杂环如卟啉类化合物，这些介体物质有的来自真菌次 羞 生代谢产物或木素降解产物，如紫丁香醛和来自只曲l 堋6 甜加珊的3 一羟基邻氨基 苯甲酸( 3 _ h y d 岫x y 锄t h r 锄i l i c a c i d ，3 - h a a ) ：有的来自人工合成化合物，如a b t s 、 卜羟基苯并三唑( j t ) 等。 漆酶氧化速率的大小不仅与漆酶本身的稳定性有关，而且也与漆酶与底物作 用的一些动力学参数如k c a t ( 表观速率常数) 有关，而k c a t 的大小又取决于电子 从底物传递到i 型铜原子上的难易程度，因此底物与漆酶之间的还原电势差势必 影响k c a t ，但这并不是决定因素。k c a t 的大小还受漆酶其它参数如漆酶与底物的 亲和力的影响。另外，底物酚氧环上取代基性质也是影响漆酶氧化率的一个重要 因素，对c 棚啦豇缸册唧来说，单羟基取代酚比甲氧基取代酚有一个更低的氧 化率，羧基取代则能增加其氧化率。底物酚氧环上不同位置的取代也同样影响漆 酶的氧化率，如青芝( c b r 如如西伽泐? d r ) 漆酶氧化2 ，4 一二氯取代酚的氧化率要 高于3 ，5 一二氯取代酚。如果底物一定，对漆酶的结构进行修饰也可使其氧化 率提高。 人工合成化合物a b t s 和丁香醛连氮( s y r i i l 鲥d a z i n e ) 是大多数真菌漆酶的最 适作用底物，其催化这两个底物反应的k 。值在微摩尔级。现在国际上常用的漆 酶活性测定方法是以丁香醛连氮、a b t s 、d m p 作为标准底物，丁香酸和愈创木 酚也常被用于漆酶的活性测定和性质研究，是某些真菌漆酶的较适宜作用底物， 酶催化愈创木酚氧化的k 。值则在毫摩尔级。 1 4 3 漆酶的光谱学性质 漆酶和抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白都属蓝色多铜氧化酶家 5 江南大学博士论文 族，这些蛋白中不同的铜中心可用光谱学技术来鉴定铜是真菌漆酶发挥催化作 用不可缺少的辅基，漆酶的四个铜原子分别位于三种不同的位点，由此决定了漆 酶分子的特征光谱性质。所有铜原子都参与了漆酶将底物氧化并同时伴随着分子 氧还原为水的催化过程。根据磁学和光谱学性质。可将漆酶分子中的4 个铜原子 分为三类：i 型c u 2 + ( t 1 c u ) 和i i 型c u 2 + ( 1 2 c u ) 各一个，是单电子受体，呈顺磁性； i i i 型c u ，+ c r 3 c u ) 两个，是双电子受体，反磁性。以灰盖鬼伞( c b 伊r 切淞c 加e m “0 漆酶为例，t 1 c u 形成单核中心，由于s c u 2 + 的电荷转移，使t l c u 在6 0 0 n m 有强 烈光吸收，使漆酶呈现。蓝色”，其电子顺磁共振( e l e c 咖p a 黜鲥i c 黜s o n a n c e ，e p 财光谱：a 1 8 7 l o - 3 c m - 1 ，g _ 2 2 0 和9 1 2 0 4 。1 1 2 c u 没有可以检测 的光吸收，其e p r 光谱：a i l 3 8 1 0 _ 3 c m ，9 1 2 2 8 和g 2 0 3 侧们c u 在3 3 0 咖 左右有一宽的吸收肩峰，能被光谱检测，可形成双核位点，由于两个铜原子之间 偶联，具有强反磁性，导致t 3 c u 原子对e p r 效应的消失。砣c u 和t 3 c u 位点一起 形成三核中心，是双氧还原的位点。 也有一些真菌漆酶分子中仅检测到2 个铜原子，如来自射脉菌( 鼢跆6 衍 加如妇) 的漆酶，拥有i 、i i 型铜，但缺乏i i i 型铜的信号，被木素衍生物“修 饰”后成为“黄漆酶川“。木层孔菌( 耽砌船m 妇) 漆酶拥有1 个铜原子，1 个锰 原子和2 个锌原子，缺少i 型铜汹1 ；只l r 鲫觚漆酶p o x a l 拥有1 个铜原子，1 个 铁原子和2 个锌原子，在4 0 0 n m 有明显吸收峰。由于缺少i 型铜，这2 个酶均不能 显示漆酶特征的蓝色，而是“白漆酶”m ，。 1 5 真菌漆酶的结构和活性中心 虽然对真菌漆酶的研究已经进行了许多年，但过去对该酶结构信息的了解一 直比较有限，这主要因为漆酶是一种高度糖基化的蛋白质，能满足x - 衍射分析 的漆酶单晶体难以获得。近年来，对真菌漆酶结构信息的研究取得了很大进步， 5 个具有完全漆酶活性的蛋白质被结晶，其中两个2 4 a 分辨率的漆酶蛋白晶体和 一个1 9 8 a 分辨率的漆酶蛋白晶体分别被解析“1 。 1 9 9 8 年，d u c s 和b r z 0 2 0 w s k i 等人从灰色鬼伞菌中得到漆酶的结晶，最好的 晶体是用内切耱苷酶f 进行去n 糖基化处理后获得的。该晶体分辨率2 2 4 a ，晶体 生长条件为p e g 8 0 0 0 沉淀剂，p h 5 5 的乙酸钠缓冲液。所得单晶在2 2 4 a 分辨率的 数据以抗坏血酸氧化酶为研究模型，以分子置换法解其结构，但这个结构缺失了 不稳定的t 2 c u 。酶的单体分子由三个杯状结构域组成，形成球状结构( 7 0 5 0 4 5 a ) 。单核的t l c u 位于结构域3 ，与两个 珏s 和一个c y s 结合，t 2 c u 与t 3 c u 形成 的三核中心位于结构域1 和3 的界面上。p 桶的构造类似子抗坏血酸氧化酶单体。 第三个结构域中除了有肛s a n d 、v i c h ，还有四个短的螺旋区，最后一个螺旋位于c 一 末端，由结构域1 的c y s 8 5 和结构域2 的c y s 4 8 7 形成的二硫键来稳定。漆酶的第二 对二硫键存在于结构域l 和结构域2 ( c y s l l 7 一c y s 2 0 4 ) 之间。一个伸展的环 6 第一章绪论 ( 1 0 0 p ) ( 氨基酸2 8 4 3 2 7 ) 连接结构域2 和3 。a s n 3 4 3 上有n 一连接的n - 乙酰葡糖胺。 但由于脱糖过程使分子中i i 型铜原子缺失，得到的结构是非活性状态的叫。 t l c u 以c u 2 + 形式存在，在所有的多铜氧化酶和已知三维结构的铜氧还蛋白 中，t l c u 都与两个 王i s 的n 和一个c y s 的s 配位结合，其中共价键c u s 。使酶呈现 蓝色。在多铜氧化酶中由于主链的重排，这个轴性位置是空的，从而形成与还原 性底物结合的“口袋”。最近的1 6 8 a 的cc 船陀淞漆酶结构表明，t 1 c u 和c y s 4 5 2 的硫，h i s 3 9 6 、h i s 4 5 7 的n d l 氮配位结合，键长分别为2 1 9 、2 0 7 、2 0 3 a 。与 抗坏血酸氧化酶不同，在抗坏血酸氧化酶中轴向m e t 配基的位置，cc 船陀埘漆 酶中为l c u 4 6 2 ，大多数其它真菌漆酶中通常为p h c ，距离t 1 c u3 5 1 a ，因此不能 成为t l c u 的配基。这种配位的不同可能引起真菌漆酶氧化还原电位的升高。t 1 c u 一侧被疏水性口袋日绕，l e u 4 6 2 两边为p h e 3 4 0 和p h e 3 9 8 ，t l c u 位于n e 4 5 4 的一侧， t l c u 距离分子表面6 a ，位于一个约6 a 深、1 2 a 宽的凹陷中，凹陷的表面由结构 域l 和结构域3 的三个环( 1 0 0 p ) ( a a l 5 2 1 6 5 ，3 3 6 3 4 0 ，3 8 7 - 3 9 5 ) 构成。这个区域 与还原底物的结合有关。在cc 加p 比淞漆酶中与底物结合的为a 1 a 1 6 2 和p h e 3 4 0 。 漆酶中缺少许多伸展的1 0 0 p 区域，且结合位点相对较大，序列变异性也较大，加 雾 上可能存在的l o o p 构象上的变化( 表现在室温和1 0 0 k 结构之间的不同) ，这些因 素都导致了真菌漆酶极度广泛的底物专一性。 cc 概即螂漆酶结构中，他，1 1 3 三核中心被8 个h i s 包围，但由于1 2 c u 缺失 + ( b 畔2d c p l e t c d ，砭d ) ，使构象发生变化，”两个c u 原子问相距5 3 a ，含氧( 可能 为水) 的配基只结合t 3 c u 原子对中的一个，而且它在两个c u 原子问的排列是不对 称的，距离c i l 3 ( a ) 和c l l 3 ( b ) 分别为2 1 7 a 和3 2 6 a ，所以不再是“蜥d g e s ”。概括 起来说，t 3 c u 原子对中的c l l 3 ( b ) 与h i s 6 6 ，h i s l 0 9 ，h i s 4 5 3 配位，形成一个轻微扭 曲的三角平面，距离氧桥3 2 6 a ，距离c u 3 ( a ) 5 1 a 。c u 3 ( a ) 有两种配位状态，一 种有4 个配基，h i s l l l ，h i s 4 0 1 ，h i s 4 5 l 的n 和氧桥，距离分别为2 0 l ，2 0 4 ，1 9 8 ， 2 1 7 a ，如一个扭曲的四面体。第二种h i s 3 9 9 旋转进入配位区，c l l 3 ( a ) 与之形成第 五个配位，距离2 5 a 所以，t 2 d 漆酶有两种构象，其平衡受温度变化和结晶条 件的影响。缺失的亿c u 也不能简单地用溶剂分子替代，被认为与1 2 c u 结合的h i s 6 4 和h i s 3 9 9 之间相距3 3 a ，在范德华力作用范围内，这样就没有了1 r 2 c u 结合的空间， 再形成t 2 结合位点需要主链和侧链结构的重排，这也许是1 2 d 难以再形成有活性 酶的原因。 1 6 真菌漆酶的功能 漆酶对真菌生长发育的影响见诸多项研究。不同种属的真菌所产生的漆酶 出现在其生长发育的不同阶段，因而具有不同的生理功能，真菌漆酶涉及色素合 成、木素降解，酚类有毒化合物脱除、子实体发育、菌索形成以及真菌致病性 等汹删。 7 江南大学博士论文 4 厅砌l 觚的两种不同功能的漆酶均被证明与色素合成有关，其中一种是以 基因的产物，独一无二地参与了分生孢子绿色色素的形成吼1 ；另一种定位在壳细 胞的原始闭囊壳中的漆酶也参与了色素合成嘲 蜜环菌漆酶的合成与菌索( 许多紧密连接的菌丝形成的菌丝束) 的发育呈对应 关系，当漆酶高效合成时，菌索也发育较好啊 在裂褶菌( & 腻矽p 细妇m m m 棚e ) 中，能产生子实体的双核菌株可分泌高水 平的漆酶，而同类系的单核菌株却不能，这说明该漆酶与子实体发育有关嘲。在 互6 f s p o r 淞的营养生长期，漆酶活性积累与菌丝体的量精确平行，但当子实体形成 开始之后漆酶即迅速失活“3 “1 。 漆酶在白腐菌中广泛存在，白腐菌中漆酶的一个普遍功能就是参与木质素的 降解和木质素降解产物的解毒，f k 和f a n _ c l 嘲发现褐腐菌不能降解木质素，同时 也不能产生漆酶。漆酶作为降解木质素的酶系统的一部分，在自腐菌对木质素的 降解过程中发挥着重要作用。真菌漆酶的木素降解功能是在研究了多种真菌木素 分解酶系统后发现的。黄孢原毛平革菌( i p 矗口船阳如卯据c h ，) 彻垆d r f 姗1 ) 是被深入研 究的木素分解真菌之一，在黄孢原毛平革菌分解木素过程中，明显伴随有木素过 氧化物酶( 1 i 鄹_ i np 哪嘶d a 卵，l i p ) 和锰过氧化物酶( 删m g 锄e p e r o x i d a ，m 印) 活性 存在。由于在其它木素分解真菌中发现有类似情况，并且分别在体外实验中也得 到证实，i 却和m 叩是真菌降解木素的关键酶。但是，也有许多能分解木素的真菌 并不合成l i p ，却能检测到p 和漆酶活性，特别是在q 慨，如邵妇蚴和 脚印n 巧打坩船分解木素过程中，未检测到l i p 和m n p ，而有较高的漆酶活性， 暗示漆酶不仅能与m n p 协同作用，而且还能单独降解木素。 1 7 真菌漆酶催化反应机理 漆酶是单电子氧化还原酶，它催化不同类型底物氧化反应的机理主要表现在 两方面。一方面是底物自由基中间体的生成。漆酶可催化氧化酚类和芳香胺类化 合物，同时分子氧被还原为水。在这一过程中，漆酶从氧化的底物分子中提取一 个电子，使之形成自由基，该自由基不稳定，可进一步发生聚合或解聚反应，导 致木素相关结构的降解。如当漆酶催化酚类如氢醌氧化时，首先是底物氢醌向漆 酶转移一个电子，生成半醌一氧自由基中间体，用电子自旋共振( e s r ) 可观察到明 显的氧自由基信号。其次是不均等非酶反应，2 分子半醌生成1 分子对苯醌和1 分子 氢醌氧自由基中间体还能转变成碳自由基中间体，它们可以自身结合或相互偶 联，产物中除醌外还有聚合物和c o c c 偶联产物。在0 2 存在下，还原态漆酶被 氧化，0 2 被还原为水。 另一方面，漆酶催化底物氧化和对0 2 的还原是通过4 个铜离子协同传递电子和 价态变化来实现的。漆酶催化4 个连续的单电子转移氧化还原性底物，将分子氧还 原为水。还原性底物结合于t l c u 位点，t l c u 从中提取1 个电子，电子通过c y s - h i s 第一章绪论 途径传递到砭，r 3 c u 三核中心位点，该位点结合第二底物分子氧，接受t l c u 的电 子，并传递给氧，使之还原为水完成反应的漆酶中的四个c u 都氧化成c r + ，整 个反应过程需要4 个连续的单电子氧化作用来使漆酶充分还原，所以漆酶被称为 “分子电池”，通过单个的氧化反应来积累电子，还原分子氧。氧的还原可能分 两步进行，两个电子转移产生过氧化氢中间体，该中间体再被另两个电子转移作 用还原成水。 许多学者通过对漆酶催化反应的模式进行较深入的研究后认为，漆酶催化底 物氧化的初始步骤是单电子从底物转移到一个特定的铜位点上。质谱实验数据表 明，在氧化还原反应中形成的两个水分子一个很快进入溶液，另一个相当紧密地 结合在t 2 c u 离子上。氧化还原生成水的第一步由两个电子从被还原的两个”c u 离 子上转移实现，并在该过程中形成。产。随后，一个电子从t l c u 转移到氧中间体上， 形成水分子和o 自由基。第四个电子j y m c u 离子传递到o 自由基，形成第二个水 分子。 总之，底物在单核铜位点( i 型铜原子) 失去电子，氧分子在三核铜位点得到电 子，并被还原成水。 1 8 漆酶基因的克隆与表达 粗糙脉孢菌( 珊m 饥脚漆酶基因是第一个被扩增的真菌漆酶基因 嘲，为了更好了解漆酶的作用，尤其是漆酶有广泛的潜在应用，这些用途引起人 们