（生物化学与分子生物学专业论文）磁性微粒分离纯化糖蛋白方法的建立及应用.pdf

西北大学硕士论文 磁性微粒分离纯化糖蛋白方法的 建立及应用 中文摘要 目的 建立环氧基修饰的磁性微粒 简称 环氧磁粒 为载体固定凝聚素的方法 利用该方法对多种生物学样品进行糖蛋白的分离纯化 并进行蛋白质组学的初步 研究 方法 以环氧磁粒为载体固定小扁豆凝集素l c a 及麦胚凝集素w g a 对二者 固定化及分离提取糖蛋白的条件进行优化 研究a 甲基甘露糖苷及二价金属离子 对于偶联反应的影响 对以健康人肝脏细胞c h a n gl i v e r 总蛋白 肝癌细胞 s m m c 一7 7 2 1 总蛋白及健康人血清为样品 分离提取三种生物学样品中的糖蛋白 并对c h a n gl i v e r 细胞糖蛋白及s m m c 7 7 2 1 细胞糖蛋白进行双向电泳 通过2 d i m a g e m a s t e r 分析软件对双向电泳凝胶进行背景消减 蛋白点识别及匹配 比较 二者之间l c a 结合糖蛋白表达的差异 结果 通过对l c a 与环氧磁粒最适偶联p h 最适偶联时间 偶联温度及封闭等 条件的优化 使凝集素与环氧磁粒的偶联效率达到9 0 研究a 甲基甘露糖及 二价金属离子对其分离纯化糖蛋白的影响 二者对于凝集素与环氧磁粒的偶联并 无显著影响 确定o 1 s d s 作为糖蛋白洗提缓冲液 利用该方法对健康人肝脏 细胞c h a n gl i v e r 总蛋白 肝癌细胞s m m c 7 7 2 1 总蛋白及健康人血清进行了糖 蛋白的分离纯化 结合2 d 电泳技术及其图像分析 建立了健康人肝脏细胞c h a n g l i v e r 和肝癌细胞s m m s 7 7 2 1l c a 结合糖蛋白的差异表达谱 分别得到蛋白质 点1 4 8 5 和2 0 9 a 7 个 匹配点数为1 2 7 匹配率为8 5 3 6 与健康人肝细胞糖 蛋白相比 匹配的蛋白点中肝癌细胞s m m c 7 7 2 1 糖蛋白有6 个蛋白点表达明显 上调 3 个蛋白点表达发生明显下调 3 个蛋白点没有表达 新出现了3 5 个蛋白 点 两块胶的蛋白点在位置上有较好的重复性 两块胶问蛋白质点在i e f 方向上 的偏差为 0 8 7 3 0 2 1 5 m m 在s d s p a g e 方向上的偏差为 1 0 2 5 0 1 2 5 本课题受国家重点基础研究发展计划 9 7 3 计划 课题编号n o 2 0 0 4 c b 5 2 0 8 0 2 及国家高技术研究发展计 划 8 6 3 计划 课题编号n o 2 0 0 7 j u 旧2 2 4 1 3 资助 西北大学硕士论文 m m 摸索w g a 与环氧磁粒偶联条件 确定其在p h 4 条件下偶联效率可达8 5 0 初步研究得到偶联时间以1h 为最佳 利用固定化的w g a 分离纯化健康人血清 中唾液酸化糖蛋白 s d s p a g e 电泳显示w g a 磁粒可在高丰度蛋白质干扰的情 况下实现对低丰度蛋白质较好的分离效果 结论 以环氧基修饰的磁性微粒为固定化载体可实现多种凝集素的固定化修饰 在不同的条件下可实现不同凝集素的高效偶联 利用环氧磁粒固定化凝集素分离 纯化复杂样品中的糖蛋白 可应用于蛋白质组学研究 结合双向电泳技术首次建 立了健康人肝脏细胞c h a n gl i v e r 和肝癌细胞s m m s 7 7 2 1l c a 结合糖蛋白的差 异表达谱 关键字磁性微粒小扁豆凝集素麦胚凝集素糖蛋白质组学双向电泳肝癌 荧光染色差异表达谱 西北大学硕士论文 g l y c o p r o t e i np u r i f i c a t i o nu s i n gm a g n e t i c p a r t i c l e l e c t i nc o n j u g a t e s a bs t r a c t p u r p o s e t oe s t a b l i s h an e wl e c t i ni m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s u p p o r t e db y e p o x y c o a t e dm a g n e t i cp a r t i c l e s l c ab o n d i n gg l y c o s y l a t e dp r o t e i n sa n ds i a l i ca c i d p r o t e i nw e r ef r a c t i o n e da n dp u r i f i e db yt h i sm e t h o df r o mv a r i o u sb i o l o g i c a ls a m p l e s a n dw e r ea n a l y z e db y2 dt e c h n o l o g yp r e l i m i n a r i l y m e t h o d w eu s e dan e wl e c t i n a f f i n i t ym e t h o ds u p p o r t e db yf u n c t i o n a l i z e d m a g n e t i cp a r t i c l e st of r a c t i o n a t ea n de n r i c ht h eg l y c o s y l a t e dp r o t e i n s t h i sm e t h o do f u s i n ge p o x y c o a t e dm a g n e t i cp a r t i c l e sc o u p l e d w i t hl c a l e n sc u l i n a r i sa g g l u t i n i n o rw g a w h e a tg e r ma g g l u t i n i n t os e p a r a t et h eg i y c o s y l a t i o np r o t e i nf r o mt o t a l p r o t e i n w a se s t a b l i s h e d a n d 叩t i m i z e d w e a l s o s t u d y t h ee f f e c to f c t m e t h y l d m a n n o s i d ea n db i v a l e n c em e t a li o no nl c ac o u p l i n gt oe p o x y c o a t e d m a g n e t i cp a r t i c l e s t h e e l u t i o nb u f f e rw a ss e l e c t e da n di t sc o n c e n t r a t i o nw a s d e t e r m i n e d t h ea n o s i ah u m a nl i v e re e l le x t r a c t i o na n dl i v e rc a n c e l e e l le x t r a c t i o n w a sf r a c t i o n e db yt h i sm e t h o dr e s p e c t i v e l y t w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s 2 d e w a su s e df o rt h es e p a r a t i o no ff r a c t i o n a t e dg l y c o s y l a t e dp r o t e i n s a n dt h e2 dg e l s b e t w e e na n o s i ah u m a nl i v e rc e l l c h a n gl i v e r a n dl i v e rc a n c e l c e l l s m m c 一7 7 2 1 w a sc o m p a r e dw i t h2 dg e la n a l y s i ss y s t e m r e s u l t t h ec o u p l i n gr a t eb e t w e e nl c aa n de p o x y c o a t e dm a g n e t i cp a r t i c l e sc o u l d b eu pt o9 0 t h r o u g ho p t i m i z a t i o no fc o u p l i n gp h t e m p e r a t u r e t i m ea n dc o n f i n i n g c o n c e n t r a t e t h ee f f e c to fa m e t h y l d m a n n o s i d ea n db i v a l e n c em e t a li o n0 1 1l c a c o u p l i n gt oe p o x y c o a t e dm a g n e t i cp a r t i c l e si sn o ts i g n i f i c a n t t h eo 1 s d sc o u l d p r o v i d eas u i t a b l e e f f e c ti nt h e e l u t i o np r o c e s s w ei s o l a t et h el c ab i n d i n g g l y c o s y l a t e dp r o t e i n sf r o ma n o s i ah u m a nl i v e rc e l le x t r a c t i o na n dl i v e rc a n c e rc e l l e x t r a c t i o nb yl c a c o u p l e de p o x ym a g n e t i cp a r t i c l e s a n dt h eg l y c o s y l a t e df r a c t i o n s w e r es e p a r a t e db y2 dg e l sw h i c hw e r ea n a l y z e db y2 di m a g e m a s t e rt oe s t a b l i s h e d i v 西北大学硕士论文 d i s p a r i t ye x p r e s s i o ns p e c t r ab e t w e e nc h a n gl i v e ra n ds m m c 7 7 2 1f i r s t l y 14 8 4 5a n d 2 0 9 4 7s p o t sw e r ed e t e c t e db e t w e e n2 dg e l so fc h a n gl i v e ra n ds m m c 7 7 21 r e s p e c t i v e l ya n d12 7s p o t sw e r ep r e s e n ti nb o t hs a m p l e sb u tw i t hv a r i e de x p r e s s i o n l e v e l s t h em a t c hr a t ew a s8 5 3 6 6s p o t sw e t eu pr e g u l a t e da n d3w e r ed o w n r e g u l a t e di nt h es m m 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e di ns t u d yo fg l y e o p r o t e o m i c sr e s p o n s ei nl i v e rc a n c e r a n dad i s p a r i t y e x p r e s s i o ns p e c t r aw a ge s t a b l i s h e db yt h i sm e t h o d d i f f e r e n tl e c t i nc a nb ec o u p l e d w i t l le p o x y m a g n e t i cp a r t i c l e si nd i f f e r e n tc o n d i t i o n st of o r mv a r i o u sl e c t i na f f i n i t y m a g n e t i cp a r t i c l e su s e df o ri s o l a t i o no fv a r i f o r mg l y c o p r o t e i n k e yw o r d s m a g n e t i cp a r t i c l e s l c a w g a g l y e o p r o t e o m i c s 2 d e l i v e rc a n c e r f l u o r e s c e n c es t a i n d i s p a r i t ye x p r e s s i o ns p e c t r a v 西北大学硕士论文 西北大学硕士论文 2 西北大学硕士论文 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集 保存 使用学位论文的规定 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 本人允许论文被查阅和借阅 本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文 同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库 或其它 相关数据库 保密论文待解密后适用本声明 学位论文作者签名 毕指导教师 矿急年石月 l 日 签名 夸垮 口子年石月 芝日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意 学位论文作者签名 o 谆 口8 年莎月 z 日 西北大学硕士论文 1 本课题的研究目的和意义 土i j l 刖吾 蛋白质的糖基化修饰是最常见 最重要的蛋白质翻译后修饰之一 目前已知 哺乳动物蛋白质中至少有二分之一是糖蛋白 广泛分布于各种组织和细胞中 特 别是在细胞膜表面 体液中含量丰富 蛋白质的糖基化修饰具有重要的生物学功 能 如参与细胞黏附及信号传导 影响蛋白质的分泌和稳定性 参与血浆中衰老 蛋白的清除 免疫及炎症反应和精卵识别等 糖基化修饰在疾病中 特别是肿瘤 的发生 发展和转移过程中均有重要意义 在特定的状态下 糖蛋白量和 或其 糖链结构的改变能够体现特定的生理或病理状态改变 因此对于糖蛋白的研究具 有十分重要的生物学意义和应用前景 蛋白组学研究通常是先利用双向电泳对生物学样品进行分离 再通过质谱技 术对分离得到的蛋白质进行质谱分析 由于来源广泛的生物学样品 如血清 尿 液 脊髓液 多成分复杂 如果直接进行双向电泳分离容易造成蛋白点粘连 拖 尾等不佳的分离效果 并且分离得到的蛋白点数目巨大也不利于下游分析 另外 高丰度蛋白质的存在也会影响蛋白质的分离及质谱分析 因此在进行双向电泳分 离及质谱分析之前预先将生物学样品进行分离纯化处理是非常重要的 对于糖蛋 白的研究也是如此 从数目众多的蛋白质中寻找出感兴趣的有意义的糖基化蛋白 质点并非易事 必须预先对总蛋白样品进行糖蛋白的分离纯化才更有利于糖蛋白 组学的研究 许多研究都报道了不同的糖蛋白分离纯化的方法 如凝集素亲和层析法和硼 酸层析法 凝集素是一类非免疫来源的对于糖类物质有特异识别和结合作用的蛋 白质 大多数凝集素特异性识别一定的糖单位 如 n 乙酰神经酰胺 n 乙酰葡 糖胺 n 乙酰半乳糖胺 半乳糖 甘露糖及岩藻糖 凝集素亲和层析法通常是通 过各种化学反应 包括可逆反应 非共价反应及共价反应 将凝集素固定于一定 的载体 如琼脂 硅及高分子材料等 上然后装柱形成亲和层析柱 待分离的总 蛋白样品通过过柱实现与凝集素的特异性识别和结合 在经与凝集素特异性识别 的单糖的竞争抑制作用将糖蛋白洗脱 硼酸亲和层析也被称作拟凝集素亲和层 3 西北大学硕士论文 析 能偶识别和结合顺式邻位含o h 的结构 众多研究表明凝集素亲和层析的方 法对于糖蛋白的分离纯化是十分有效的 但是固定化载体的性能却大大制约了凝 集素亲和层析的分离效率 许多研究报道了不同的材料作为凝集素固定化载体的 性能性质 但是仍然不能满足蛋白质组学研究快速 省时和高效的要求 糖蛋白 质组学的研究迫切需要一个新的载体介质出现 以此为背景 我们以本实验室自主创新研究开发的磁性微粒材料为载体 设 计了一个基于环氧基表面修饰磁性微粒的凝集素 糖蛋白结合反应体系 对在这 一体系中凝集素的固定方法 凝集素 糖蛋白特异性结合反应及样品分析等问题 进行研究 并初步将这一体系应用于肝癌糖蛋白质组学的研究 2 本课题的主要研究内容 利用环氧基团修饰的磁性微粒及凝集素对糖蛋白的特异性亲和作用 从复 杂蛋白质样品中分离纯化出特异性的糖蛋白 探索凝集素固定化条件及分离提取 糖蛋白的条件 对健康人肝脏细胞c h a n gl i v e r 总蛋白及肝癌细胞s m m c 7 7 2 1 总蛋白分别进行糖蛋白的分离提取 并对获得的糖蛋白进行双向电泳 经图像分 析软件进行糖蛋白表达差异分析 2 1磁性微粒分离纯化l c a 结合糖蛋白方法的建立 将小扁豆凝集素 l e n sc u l i n a r i sa g g l u t i n i n l c a m w 4 9k d a 在碱性条 件下固定于环氧基团修饰的磁性微粒表面 制备出具有磁响应性和糖蛋白亲和性 的凝集素磁粒 对该方法的固定化条件 包括最适偶联p n 最适偶联温度 最 适偶联时间 凝集素活性保护剂 凝集素活性位点保护剂 及封闭剂的选择均进 行了条件优化 以健康人血清为样品进行糖蛋白分离提取条件的优化 选择了洗 脱缓冲液 确定了洗脱缓冲液最适浓度 2 2肝脏疾病相关蛋白的研究分析 从健康人肝脏细胞系和肝癌细胞系中提取总蛋白 并用建立的l c a 结合糖 蛋白磁性微粒分离纯化方法分别对两种样品进行l c a 结合糖蛋白的分离提取 对从两种总蛋白样品中分离得到的糖蛋白进行2 d 电泳并银染使其显色 使用 i m a g e m a s t e r 对凝胶进行蛋白的配对分析 比较两种细胞系糖蛋白表达差异 2 3磁性微粒分离纯化唾液酸化糖蛋白方法的建立 4 西北人学硕士论文 将麦胚凝集素 w h e a tg e r ma g g l u t i n i n w g a m w 3 5k d a 在酸性条件 下固定于环氧基团修饰的磁性微粒表面 制备出具有磁响应性和糖蛋白亲和性的 凝集素磁粒 对该方法的固定化条件进行优化 建立一种唾液酸化糖蛋白分离纯 化的方法 并应用于健康人血清唾液酸化糖蛋白的分离纯化 3 本课题的主要技术路线 s d s p a g e 2 d e f i u o r e s c e n c es t a i ns i l v e rs t a i n oo 图l 凝集素磁粒分罱纯化糖蜇臼及堑臼质组学研冗流程 环氧磁粒与凝集素l c a 共价结合形成l c a 磁粒 l c a 磁粒与总蛋白样品 混合 并经清洗除去非特异结合蛋白质 用洗脱缓冲液洗脱得到l c a 特异性结 合的糖蛋白 糖蛋白经s d s p a g e 电泳及荧光染色 验证该方法的可行性 经 2 d 电泳及银染 经分析软件分析建立健康人肝脏细胞c h a n gl i v e r 及肝癌细胞 s m m c 一7 7 2 1l c a 结合糖蛋白差异表达谱 心 固 嘶 夕 洲 西北大学硕士论文 第一部分文献回顾 1 磁性微粒研究现状 1 1磁性复合微粒的概念及组成 磁性复合微粒是2 0 世纪7 0 年代末发展起来并被广泛用于生物医学领域的 纳微米复合粒子 是由高分子或无机材料与磁性超细粉末构成的胶态材料 其中 磁性物质包括铁 铁氧化物 钻 镍 正铁酸盐等 当其粒径达到一个临介尺度 1 5 n m 以下 时会表现出超顺磁性 s u p e r p a r a m a g n e t i c 的特性 作为基体的高分子 材料包括合成高分子 如苯乙烯共聚物 聚酷类 聚酞胺类 和天然高分子 如明胶 纤维素 蛋白和各种聚糖等 无机材料主要包括二氧化硅 s i 0 2 金属等 纳微米级的磁性复合微粒具有较高的比表面积表现出较强的吸附能力 磁 性复合微粒表面也可通过共聚 表面修饰等赋予不同的活性基团 如一c o o h n h 2 一o h c o h 等 由此可通过物理吸附 共价作用等将抗体 酶 核酸及 寡核普酸等生物活性物质偶联在其表面 表面固定有链亲和素的磁性复合微粒还 可与生物素标记的生物分子特异结合而将其固定在磁性微粒表面 通常情况下 磁性复合微粒通过热运动保持胶体的稳定性 在外加磁场作用下 磁性粒子的超 顺磁性可保证其既可被快速分离 本身又不会被永久磁化 因此 偶联有生物分 子的磁性复合微粒在环境监测 酶的固定化 靶向给药 免疫分析 细胞分离 核酸分离纯化等方面已经得到广泛的应用 根据磁性复合微粒的组成可将其分为有机 无机磁性复合微粒 无机 无机磁 性复合微粒两大类 1 有机 无机磁性复合微粒 以磁性材料和天然高分子 有机合成高分子等 组成的磁性复合材料 应用较多的高分子物质包括葡聚糖 聚苯乙烯 壳聚糖 聚乙二醇 环糊精 多肤 聚乙烯醇 聚甲基丙烯酸甲酷等 核壳结构的有栅 无机磁性复合微粒常将高分子包覆在磁性粒子表面 具有光滑 可修饰表面 方 便生物分子偶联 可降低表面非特异性吸附 而葡聚糖 壳聚糖 丌 淀粉等天然 高分子组成的磁性复合微粒则具有生物相容性和可降解性 更适合体内药物输送 等应用 6 西北大学硕士论文 2 无机 无机磁性复合微粒 无机 无机磁性复合微粒是铁 铁氧化物 钻 镍等与其它金属或无机物组成的微粒 核壳结构的无机 无机磁性复合微粒表面 可为金 引 二氧化硅 9 1 量子点等 近年来 新型无机 无机磁性复合微粒的合成 研究受到了越来越多科学家的关注 如e l k i n s 等 1 0 c h e r t 1 1 1 等用还原的方法合 成粒径大小可调的f e p t 纳米微粒 t e n g 掣1 2 合成了p t y f e 2 0 3 纳米微粒 由于 p t n i 等材料的复合 材料的磁学性质得到了改善 但这类材料在生物医学应用 研究中的报道尚少 c u i 等 合成了核壳结构和组装结构的f e 3 0 4 a u 磁性复合 微粒 其内层f e 3 0 4 具有超顺磁性 外层a u 及胶体金粒子具有良好的抗体固定 化能力 己在磁酶免疫检测中得到应用 14 1 1 2磁性复合微粒的应用 1 2 1 生物分子检测 磁性复合微粒可通过表面包被的特异性抗体或核酸探针 与含有相应抗原 或靶片断的物质特异性结合形成复合物 l 扪 在磁场作用下 这种复合物可与其它 组分分离 在进一步引入报告信号基团 如显色 荧光 化学发光等 后 可用 于生物分子的检测 磁性复合微粒与抗体或核酸探针可通过吸附与共价结合两种 形式 吸附结合依靠微粒表面对抗体或核酸探针的非特异吸附力 而共价结合依 靠微粒表面的活性基团与抗体或核酸探针分子中功能基团的共价反应 由于磁性 复合微粒超强富集和快速分离能力 较高的比表面积以及表面结合生物分子对相 应靶物质的识别作用 已在分析检测中得到广泛的应用 如基于抗体 抗原的 e l i s a 检测 与传统的以酶标板为载体的e l i s a 相比具有更高的检测灵敏度 操作更为简单 对蛋白质和小分子药物的检测还可结合荧光免疫 光纤传感 磁 分离及流动注射等技术实施进行 n a m 等人 1 7 利用磁性复合微粒和胶体金对 d n a 的放大作用建立了蛋白质的超灵敏检测方法 腺特异性抗原时固定有针对 p s a 靶物的特异性抗体 该法在磁性复合微粒上固定针对前列在标记有寡核普 酸探针的胶体金上同p s a 抗体的二抗 标记探针的胶体金 p s a 靶物与磁性复 合微粒反应结合后从溶液中分离出来后 与p s a 结合的胶体金表面带有的大量 寡核普酸探针使整个检测体系的灵敏度得到了放大 f a n 等人 1 8 建立了磁性微粒 介导的化学发光免疫检测 在磁性微粒上固定抗体 与待测物中的抗原结合 加 入胶体金标记的二抗 形成抗体一抗原一抗体的夹心复合物后 将标记在磁性微 7 西北大学硕士论文 粒上的金在酸性条件下氧化形成a u 3 利用a u 3 催化的鲁米诺发光系统检测人 i g g 其灵敏度可达1 0 m m o l l f u e n t e s 等人 1 9 1 建立了以磁性复合微粒为载体的 d n a 检测方法 该方法首先在磁性复合微粒表面固定特异的d n a 探针 再将磁性微粒加入 待检测样品混合物中进行杂交反应 通过磁性分离筛选出目的d n a 最后利用 磁性微粒表面的d n a 为模板进行p c r 扩增 分析产物 应用该方法最低可检测 到1 0 1 8 9 m l 即每毫升含2 分子c d n a h c v 的d n a 具有极高的灵敏度 1 2 2 靶向给药治疗 口服或静脉注射的药物通过全身血液循环使正常组织和器官受到一定的毒 副作用 同时 药物在病患部位的有效浓度有时也不能得到保证 靶向给药 尤 其是恶性肿瘤靶向药物治疗已成为科学家研究热点 磁靶向给药的特点是在磁场 作用下 药物能够克服在体内运输过程中遇到的各种生理屏障 到达靶向位点 良好的药物靶向治疗有助于增加病灶部位药物浓度 减少药物用量 降低不良反 应 具有良好的应用前景 h a f e l i 等人 2 0 在由金属铁和活性炭组成的磁性复合微粒 m a g n e t i ct a r g e t e d c a r r i e r m t c 上标定p 放射徕限e 1 8 8 并将其有效递送肿瘤靶向部位 这样 r e m t c 能集中对肿瘤部位辐射治疗 减小了对周围组织和器官的辐射 二氯苯 二磺酞钠是一种抗炎和止痛药 能用来治疗关节炎 由于生理半衰期短 需要持 续频繁的注射以维持其治疗效果 同时这种药物具有很强的副作用 如胃溃疡 肠胃出血 过敏性反应等 s a r a v a n a n 等人 2 1 1 制备了用于治疗关节炎的二氯苯二 磺酞钠凝胶磁性微粒 可达到靶向和缓释的效果 实验表明其药物释放时间超过 1 8 天 采用超声波能加快药物的释放 l u b b e 等人 研究了大鼠和裸小鼠对空白和载药磁性纳米粒子的耐受性以 及载药磁性纳米粒子的药效 结果显示 实验条件下 动物对不同浓度的空及载 药磁性纳米粒子均未表现出任何毒副作用 只是在非常高的剂量下 动物1 2 天内表现出嗜睡 将其用于抑制的肾癌和结肠癌模型 载药纳米粒子能使肿瘤得 到较为完全的缓解 f e r x 公司将磁性定位载体 m t c 与抗肿瘤药物阿霉 d o x 复合得到1 2 u m 药物载体 利用外加磁场 通过介入方法将其固定到瘤上游动脉 分支中 在外加磁场的作用下 m t c d o x 可从毛细血管渗透到目组织中达到肿 8 西北大学硕士论文 瘤治疗的目的 临床i i i 期试验表明 在m t c d o x 介入进入血后 可撤掉外部 磁场将其固定在病变部位 m t c 的渗透过程不会损害正常组织磁性复合微粒具 有很好的生物相容性和有效性 2 3 利用磁性定位载体载阿霉素 m t c d o x 进行 肿瘤治疗 州 1 2 3 细胞的分离 细胞分离与纯化对细胞形态研究 细胞组成与功能分析等领域具有重要意 义 传统细胞分离方法主要有等密度沉降 动力梯度沉降 差式沉降 离心洗提 双水相分离和流式细胞仪分选 p a c s 等方法 这些方法多基于细胞大小 密度 表面电荷等物理特征分离 基于磁性复合微粒对细胞分选 主要是将针对细胞表 面特定抗原的单克隆抗体或其他亲和配基通过直接或间接的方法固定在磁性微 粒表面 利用亲和作用将细胞固定在磁性微粒表面 在外磁场作用下 固定在磁 性微粒表面的细胞发生定向移动 从而实现特定细胞的分离 2 5 1 与流式细胞仪 分选细胞相比 磁性复合微粒分离细胞简单 快速 得率和纯度较高 成本较低 磁性复合微粒分选细胞常用策略有阴性分选和阳性分选两种 阳性分选是 通过磁性分离直接获得 其特点是操作简便 所得目的细胞纯度高 缺点是磁珠 与细胞直接结合 会影响细胞某些特性 另外 还需对细胞进行解离 以便进行 分析和后续培养 阴性分选是指将非目的细胞磁性标记后 通过磁性标记后将其 除去而得到目的细胞 其特点是磁性微粒不直接与目的细胞接触 细胞所受损害 程度低 可分离缺乏针对目的细胞的特异性抗体的样品 分选后不需解离步骤而 直接获得游离的目的细胞 但方法要求对样品中所分离细胞种类明确 需要有针 对所有非目的细胞的单克隆抗体 将针对细胞表面抗原的单克隆抗体包被在磁性 微粒表面 与细胞孵育后直接将其分离的方法称为直接分选 当没有直接标记的 磁性微粒时 可将固定有链亲和素 抗生物素抗体 抗荧光素抗体 二抗等抗体 的磁性微粒与针对细胞表面抗原的一抗结合 再与细胞孵育 或将细胞与其单抗 孵育后再与磁珠结合 从而分离目的细胞和非目的细胞的方法称为间接分选 s o n t i 等人 2 6 建立了利用蛋白a 包被的磁性复合微粒进行细胞分选的方法 该方法通过铁磁流体表面包被蛋黄卵磷脂和蛋白a 制备出功能化的磁性复合微 粒 将此磁性微粒加入鸡红细胞和抗体标记的羊红细胞的混合物 利用磁性微粒 表面7 的蛋白a 与抗体的共价结合来分离羊红细胞 实验结果表明 抗体标记 9 西北大学硕士论文 的羊红细胞可被高效的分离出来 c h a t t e r j e e 等人 2 7 建立了用血凝素修饰的聚苯乙烯磁性微球和白蛋白磁性微 球分离红细胞的方法 修饰有血凝素的磁性微球具有良好的红细胞结合能力 白 蛋白磁性微球与合成的聚合物微球相比较更具优势 因为经白蛋白磁性微球分离 后的红细胞能重新注射进入病人的体内 1 2 4 生物医学诊断 磁性复合微粒具有生物相容性和可降解性 无毒副作用 加之在外加磁场 中具有响应性 因而可被用于生物医学诊断领域中 表面偶联有核酸探针的纳米级磁性复合微粒可进入机体细胞核并与核内染 色体组合 因而具有很高的反应特异性 2 引 a v i v i 等 2 9 1 采用高强度超声法合成磁 性蛋白质微球 这种磁性复合微球是由b s a 包覆氧化铁组成 用五拨基铁或醋 酸铁牛血清白蛋白 b s a 作反应物 在水或癸烷的溶液中进行高强度的超声振荡 进行合成 这种磁性复合微球可在超声检查中作为回波对照剂 目前肿瘤诊断方法主要是建立在组织细胞水平的病理学检测方法 但该方 法只能在肿瘤形成后进行切片分析 不能有效的对肿瘤进行早期诊断 目前 利 用磁性复合微粒进行肿瘤诊断得到了越来越广泛的应用 h a f e i l i 等人 3 0 用放射 性l l i 标定磁性靶向载体 采用 a b z 2 d o t a 作为鳌合剂时 接着鳌合剂与磁性微 粒键合 得到的放射磁性微球在血浆中具有较好的稳定性 表明h l 标定的磁微 球作为治疗前的诊断工具能保证长期的观察 t a k c s h i t a 等通过超顺磁性氧化铁纳 米粒与脂质体的结合对肝癌诊断进行研究 提高了直径3 m m 以下的肿瘤检出率 1 3 1 目前 磁性复合微粒作为磁学共振成像的对照试剂在肿瘤诊断中得到了越来 越广泛应用 3 2 1 s u z u k i 等人 3 3 通过向聚乙烯7 醇包被的磁性复合微粒偶联特 异性抗体 再通过静脉注射并靶向定位到裸鼠的肿瘤部位 2 4 小时后进行磁学 共振成像检测 百分之五十的肿瘤部位可以明显地观察到指示信号 目前美国 f d a 已经批准将葡聚糖磁性纳米粒子用于磁共振成像 m r 0 的新型造影剂 3 4 1 1 2 5 生物分子的分离纯化 核酸 蛋白质等生物分子物质的分离纯化是生物医学研究中的重要课题 将 抗体或核酸探针固定在磁性复合微粒上 将微粒与生物样品共同孵育后 可 在磁场作用下分离表面固定有生物分子复合物的磁性复合物 3 5 1 通过改变条件可 1 0 西北大学硕士论文 将目的生物分子从磁性复合微粒上洗脱下来 利用磁性复合微粒分离纯化生物分 子有以下的优点 较高的胶体稳定性使其更充分地与样品中反应 能较快地 达到对需分离物质的结合平衡 改变外界条件可方便 快速将生物分子从磁性微 粒上洗脱下来 磁性复合微粒已被用于蛋白质 d n a m r n a 以及其它生物分子的纯化 s m i t h 等人 3 6 用硅包被的磁性复合微粒成功分离了核酸 多肤等多种生物分子 z h a o 等人 3 7 建立了磁性复合捕获系统来筛选和分离 鉴别不同的 d n a m r n a 这种磁性复合捕获系统是以偶联有d n a 探针的硅复合磁性微球为 载体 在样品浓度极低 1 0 1 5 m o m 的条件下 仍可检测出只有一个碱基区别的 d n a m r n a c h i a n g 等人 3 8 建立了从细菌细胞中纯化转染质粒d n a 的磁性复 合微粒体系 该体系利用聚乙烯修饰f e 3 0 4 磁性复合微球 将其与细菌细胞反应 后提取质粒d n a 结果从l o o m l 的细菌培养液中最多提取出8 1 9 r a g 的质粒 d n a y a n g 等人1 3 9 利用磁性壳聚糖复合微球成功进行透明质酸的纯化分离 在 p h 为6 的条件下 1 9 磁性壳聚糖复合微球纯化出3 9 m g 的透明质酸 2 糖蛋白分离纯化技术 由于糖基化的类型和糖基化水平与细胞健康状态的关联 蛋白质的糖基化 及糖蛋白组学逐渐成为一个热门的研究领域 糖基化多肽和蛋白质的分离鉴定及 其糖链结构的分析在疾病诊断和蛋白质组学中也越来越重要 特别是与特定疾病 有关的糖基化蛋白质及可作为生物学诊断标志的蛋白质尤为重要m 但是由于盐 离子的污染 直接从复杂样品 如血清 尿液 脑脊液等 中检测这些生物学标 志物相当困难 另外 一些高丰度蛋白质 如人血清白蛋白 的存在也影响了目 的样品的分析 因此在进行糖蛋白分析之前预先进行糖蛋白的分离纯化是十分必 要的 众多文献中介绍了不同的糖基化蛋白质及多肽特异性分离纯化的方法 例 如 凝集素亲和层析及硼酸亲和层析 凝集素亲和层析是利用凝集素对于糖基化 蛋白质特定糖链的特异性识别及结合作用结合蛋白质固定化技术实现从复杂蛋 白质样品中分离纯化糖蛋白的方法 在本文另设专题详细介绍该方法 硼酸亲和 层析则是利用苯硼酸可与含有顺式二元醇基团的分子共价结合的特性实现糖蛋 白的分离纯化 4 糖蛋白和糖肽被糖 如甘露糖 半乳糖 葡萄糖 修饰形成在 西北大学硕士论文 碱性条件下稳定的杂环二元酸酯 图2 另外硼酸对于各类o 一寡聚糖的分离富 集有很好的效果 3 凝集素固定化技术及其分离纯化糖蛋白的研究现状 3 1凝集素概述 3 1 1 凝集素的概念 凝集素是一类具有糖专一性 可促使细胞凝集的糖蛋白 它能与糖专一性 非共价可逆结合 凝集素l e c 血一词 来源于拉丁文t ol e g e r e 本意为选择 a g g l u t i n i n 是它的同义词 凝集素是一种非免疫来源 对糖及其缀合物可逆专一 识别的蛋白质分子 广泛分布于自然界 最早是在蓖麻籽抽提液中发现的 因为 具有使红细胞凝集作用 因此开始被称为植物血凝集素 后来在动物中也发现了 具有同样作用的物质 故改称为血凝素 进一步的研究发现 这类糖蛋白不但可 以凝集红细胞 还可使其他细胞如精子 淋巴细胞等也发生凝集 所以干脆把这 类糖蛋白命名为凝集素 目前已发现有近千种植物中含有凝集素 这些植物的种 子 根 茎 叶 皮甚至果实汁中都可能含有凝集素 在各种真菌 无脊椎动物 脊椎动物以及人体的各种组织和器官中都存在凝集素 在某些病毒体内也含有凝 集素 凝集素可存在于细胞膜上 细胞质内和细胞外基质中 自1 8 8 8 年s t i l l m a r k 发现r i c i n 以来 已有数百种植物凝集素被分离纯化 几十 种植物凝集素的一级结构被测定 十几种凝集素自身的立体结构以及凝集素 糖 复合体的立体结构通过核磁共振n l v i r x r a y 单晶衍射和计算机模拟得以阐明 植物凝集素结构和糖专一性关系研究表明 1 绝大多数的凝集素呈现较高的保守 专一性 2 在长期的进化过程中 形成几种不同的结构模体 m o t i f s 来识别外源 多糖 迄今为止 至少发现识别甘露糖 几丁质的模体有三种 识 j t j t 2 抗原的模 体有四种 3 多数植物凝集素的特异性识别不是针对植物内源多糖 而是针对外 源多糖 例如 唾液酸专一的植物凝集素识别的一种糖 是动物 微生物或害虫 内外表面0 4n 连接的多聚糖的组成成分 几丁质结合凝集素识别大量出现在真 菌细胞壁和害虫的外骨骼中的糖 多数g a l g a l n a c 专一性的凝集素 对动物的 复合多糖具有高亲和力 而在植物中却未发现合适的内源多糖受体 这证据同时 表明 识别结合甘露糖 几丁质和t 抗原对植物具有重要的意义 凝集素和有关 1 2 西北大学硕士论文 糖类的专一性结合是细胞与细胞 细胞与分子 分子与分子相互作用的基础 近 年来在植物凝集素的生理功能方面有了很大的进展 3 1 2 凝集素的分类 按照所结合糖的类型 可把自然界中的凝集素分成若干类型 即能与某糖 分子特异性结合 就叫该糖凝集素 这样一般可把凝集素分为六大类 d 甘露糖 或d 葡萄糖凝集素 如伴刀豆素a n 乙酰氨基葡萄糖凝集素 如麦芽的凝集素 n 乙酰氨基半乳糖凝集素 如大豆的凝集素 d 半乳糖凝集素 如蓖麻的凝集素 l 一岩藻糖凝集素 如荆豆的凝集素 n 乙酰神经氨酸 唾液酸 凝集素 如麦胚凝集 素 3 1 3 凝集素的特性 凝集素是可与某一糖分子专一性结合的蛋白质 它具有下列一些共同的特 性 能特异性地与受体结合凝集素要发挥生物效应 一般要先与凝集素受体发 生特异性结合 凝集素受体一般位于细胞膜上 亲和组织化学的研究发现 一个 细胞上一般都有一种或多种凝集素受体 如红细胞 淋巴细胞 脂肪细胞 肿瘤 细胞及生殖细胞等都有 凝集素受体实际上就是一种含某种糖分子的化学物质 主要是糖蛋白 也有少数是糖脂或其他的糖化合物 受体中的糖分子主要由一些 单糖或寡糖构成 如半乳糖 甘露糖 岩藻糖 n 一乙酰氨基半乳糖 n 乙酰氨基 葡萄糖 n 乙酰氨基神经氨酸 这些糖分子以糖苷链同膜蛋白分子中丝氨酸 s e r 或苏氨酸 t l l r 残基相连 或同糖鞘脂相连接 正是这些受体中呈分支状的糖 分子与相应凝集素发生特异性结合 且这种结合具有高度的专一性 一种凝集素 只与含有一种糖分子的受体相结合 如伴刀豆素a 只与含甘露糖的凝集素受体 结合 大豆凝集素只与含n 乙酰氨基半乳糖的受体相结合 进一步的组织化学研 究还发现 各类凝集素对与其结合的受体糖分子中各个碳原子上的羟基 受体中 糖链上与凝集素结合的糖分子的位置以及糖苷链的类型都有专 性 亲和组织化 学研究还发现 凝集素的糖结合位点大小 形状 糖决定簇在糖链中的位置 配 体糖的构象等都影响着凝集素与糖分子的结合 一般凝集素都是与糖蛋白糖链的 非还原末端的糖基相连接 而且结合强度有大有小 大多数凝集素是与单个糖分 子结合 故结合强度较小 也有少数凝集素 如麦胚凝集素 可与二糖等以上寡 西北大学硕士论文 糖基特异性结合 其结合的强度就比较大 细胞化学的研究还发现 一个细胞膜 上的凝集素还会随着细胞发展阶段的不同而发生种类 数量和位置上的变化 如 精子在成熟过程中 会伴随着c o na 受体和w g a 受体量的增加 且凝集素受体主 要向精子头部顶体区集中 能改变受体物质的生物学特性 受体物质都是具有一定分子结构和空间构 型的糖蛋白等化合物 一旦与相应凝集素结合以后 会发生空间构型等方面的变 化 从而改变受体的