（应用化学专业论文）基于纳米粒子探针的光学成像新方法研究.pdf

l 海交通人学博f j 学位论文 上海交通大学博士学位论文 基于纳米粒子探针的光学成像新方法研究 摘要 生命科学的迅速发展要求人们从单细胞和单分子水平上原位 活体 实时地了解物质之间的相互作用以及生命的过程 近年来新兴的单分子 光学成像技术以其高的灵敏度和分辨率正好适应这一发展的要求 而且 它们自诞生以来就一直处于迅速的发展中 成为当今生命科学及相关学 科研究的前沿和热点 与此同时 这些基于光学手段的生物成像技术除 了光学构型的革新和改进之外在很大程度上还依赖于灵敏而稳定的光学 探针的使用 理想的光学探针应该具有以下特点 信号强 稳定 不易 发生光漂白 体积小 对标记的宿主分子影响小 能够与宿主分子可控 结合 化学惰性 遗憾的是 至今没有任何一种光学探针达到理想探针 的要求 本论文主要从光学探针和光学成像方法两方面入手 通过选择并优 化合适的纳米粒子以及改进现有的光学成像技术 发展基于纳米粒子探 针的光学成像新方法以实现高灵敏 稳定 快速的生物成像 主要研究 工作包括如下几个方面 1 利用全内反射荧光成像技术分别对水相合成的c d t e 量子点和有 f 海交通人学博i j 学化论丈 摘要 机相合成的c d s e z n s 量子点进行了荧光成像 并且通过对其荧光强度的 跟踪获得了量子点在单粒子尺度上的荧光发射轨迹 我们发现在巯基丙 酸 谷胱甘肽等含巯基配体的水溶液中合成的c d t e 量子点不存在有机相 合成量子点的荧光闪烁现象 进一步的实验证实巯基配体对量子点闪烁 的抑制起到了至关重要的作用 最后 我们使用水相合成的c d t e 量子点 作为荧光探针成功地用于癌细胞的靶向成像 这些研究结果表明水相合 成的c d t e 量子点由于具有良好的水溶性 高亮度及不闪烁的特征可作为 较好的荧光探针用于单分子检测及生物成像领域 2 分别使用系综荧光光谱 荧光相关光谱 荧光显微镜等不同的光 学技术研究了粒径范围在1 6 5 5n m 的金纳米粒子的光学性质 发现该 粒径范围的金纳米粒子具有一定的荧光 而且 随着粒径的增加 金纳 米粒子的荧光发射波长几乎保持不变 约为6 1 0n m 其发射峰的半峰宽 约为1 7n n l 尽管这些金纳米粒子的荧光量子产率很低 但在较高激发强 度下它们具有足够强的荧光亮度可在单粒子尺度上被荧光显微镜和荧光 相关光谱仪器所检测 尤其重要的是 在强光照射下 金纳米粒子不漂 白 基于金纳米粒子的抗漂白性质以及细胞自荧光易漂白的特点 我们 发展了一种以金纳米粒子作为荧光探针的细胞成像新方法 该方法的主 要原理是活细胞经金纳米粒子培育或特异性标记后 利用光照将细胞自 荧光迅速漂白 然后观察细胞内部或细胞膜上的金纳米粒子 基于上述 原理 我们使用金纳米粒子作为探针或者靶向探针成功实现h e l a 癌细胞 的荧光成像 而且 利用全内反射荧光显微镜甚至不需要经过光漂白步 骤就能够实现以金纳米粒子作为荧光探针的细胞膜成像 h 海交通人学博i j 学位论文 3 金纳米粒子在光照下由于表面等离子体共振效应会产生强烈的散 射信号 然而目前使用金纳米粒子作为散射光探针的生物成像方法主要 局限于暗场显微镜 视频增强微分干涉相衬显微镜等传统光学成像技术 本文基于全内反射荧光显微镜平台 设计了一套物镜型隐失波散射成像 系统 该系统通过使用一系列自制毫米级小孔对金纳米粒子的散射光和 激光的反射光束进行有效分离 实现单个金纳米粒子的隐失波散射检测 及溶液中单个金纳米粒子的快速跟踪 在本章中 我们详细阐述了物镜 型隐失波散射成像的实现原理以及研究了激光入射角 小孔孔径和视场 光阑开口直径等参数对该系统散射成像的影响 结果表明 通过适当地 调节激光光束的入射角 小孔可应用的孔径范围位于2 5m m 到4m m 之 间 最后 我们使用该隐失波散射成像技术成功实现了活细胞膜上单个 金纳米粒子的跟踪 并且进一步研究了单个金纳米粒子在活细胞膜上的 扩散行为并计算其相应的扩散系数 我们的研究结果表明以金纳米粒子 作为光学探针的隐失波散射成像技术是一种非常具有前途的用以研究活 细胞膜动力学的工具 而且 物镜型的光学配置构型更便于样品的放置 使得这种以金纳米粒子作为散射光探针的表面成像方法与膜片钳 原子 力显微镜 扫描电化学显微镜等其他探测技术联用成为可能 关键词 量子点 金纳米粒子 荧光 散射 细胞成像 i i i s t u d i e so no p t i c a li m a g i n gm e t h o d su s i n g n a n o p a r t i c l e s a sp r o b e s a b s t r a c t s i n g l em o l e c u l eo p t i c a li m a g i n gt e c h n i q u e sp r o v i d eg r e a tp o t e n t i a l f o r u n d e r s t a n d i n gb i o l o g i c a lp r o c e s s e sa tt h em o l e c u l a rl e v e la n df o rs e n s i t i v e c a n c e rd i a g n o s i s f r o mt h ed a yo ft h e i rb i r t h s i n g l em o l e c u l eo p t i c a li m a g i n g t e c h n i q u e sh a v eb e e nt h ei m p o r t a n tr e s e a r c hf r o n t i e ra n dh o t s p o t so fl i f e s c i e n c ea n dr e l a t e dd i s c i p l i n e s b e s i d e st h ei n n o v a t i o no fo p t i c a li m a g i n g p r i n c i p l e sa n dc o n f i g u r a t i o n s b i o l o g i c a li m a g i n gw i t ho p t i c a lt e c h n i q u ea l s o r e l i e sg r e a t l yu p o nt h eu s eo fs e n s i t i v ea n ds t a b l eo p t i c a lp r o b e s a ni d e a l o p t i c a lp r o b ef o rm a c r o m o l e c u l e s s h o u l dg e n e r a t ea ni n t e n s eo p t i c a ls i g n a l i t s h o u l da l s ob es m a l l d u r a b l e c h e m i c a l l yi n e r t a n da p tt ob i n dt ot h e m o l e c u l eo fi n t e r e s ti nac o n t r o l l e dm a n n e r a l lc u r r e n t l y u s e do p t i c a lm a r k e r s f a l ls h o r to ft h e i d e a lp r o b e s t a t u s i nt h i sd i s s e r t a t i o n c o m b i n i n gn a n o p a r t i c l et e c h n i q u ew i t ho p t i c a li m a g i n g m e t h o d s w ed e v e l o pn e wo p t i c a li m a g i n gm e t h o d sf o rh i g h l ys e n s i t i v e s t a b l e a n df a s tb i o l o g i c a li m a g i n g t h em a i nc o n t r i b u t i o n sa r ea sf o l l o w s 1 w eu s e dt o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y t i r f m t o i m a g ec l e a r l yi n d i v i d u a lc d t eq u a n t u md o t s q d s s y n t h e s i z e di na q u e o u s s o l u t i o na n dc d s e z n sq d ss y n t h e s i z e di no r g a n i cp h a s e a n di n v e s t i g a t e d t h e i rf l u o r e s c e n c ee m i s s i o nb e h a v i o ru n d e rc o n t i n o u sl a s e ri l l u m i n a t i o n w e f o u n dt h a ti n d i v i d u a lc d t eq d ss y n t h e s i z e di nm e r c a p t o p r o p i o n i ca c i d m p a o rg l u t a t h i o n e g s h s o l u t i o nd i dn o tb l i n kw h i l ec d s e z n sq d ss y n t h e s i z e d i n o r g a n i cp h a s e e x h i b i t e ds e v e r ef l u o r e s c e n c eb l i n k i n gb e h a v i o r o u r e x p e r i m e n t sh a v ec o n f i r m e dt h a tt h em p aa n dg s hc o a t i n go nt h ec d t eq d s p l a yak e yr o l ei ns u p p r e s s i n gb l i n k i n g f u r t h e r m o r e w ec o n j u g a t e dc d t e i v q d st oa n t i e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r a n t i e g f r a n t i b o d i e s a n d s u c c e s s f u l l yu s e d t h ea n t i e g f r g n p sc o n ju g a t e sa st a r g e t e dp r o b e sf o r f l u o r e s c e n ti m a g i n go fc a n c e rc e l l s t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tc d t e q d ss y n t h e s i z e di na q u e o u s s o l u t i o na r ew e l ls u i t a b l ef o ru s ei ns i n g l e m o l e c u l ed e t e c t i o na n db i o l o g i c a li m a g i n ga sf l u o r e s c e n tp r o b e sa st h e ya r e w a t e r s o l u b l e b i o c o m p a t i b l e b r i g h t a n dn o n b l i n k i n g 2 w ei n v e s t i g a t e dt h ef l u o r e s c e n tp r o p e r t i e so fg o l dn a n o p a r t i c l e s g n p s w i t hs e v e r a lt e n so fn a n o m e t e r sb ye n s e m b l ef l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y f c s a n df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y w 色o b s e r v e dt h a tg n p ss y n t h e s i z e db yt h ec i t r a t er e d u c t i o no fc h l o r o a u r i c a c i dp o s s e s s e dc e r t a i nf l u o r e s c e n c e n a r r o wf u l lw i d t ha th a l fm a x i m u m 1 7 n m a n dw i t ha ni n c r e a s eo fp a r t i c l es i z e s t h ee m i s s i o ni n t e n s i t ys h o w e da g r a d u a li n c r e a s ew h i l et h ee m i s s i o nw a v e l e n g t hr e m a i n e da l m o s tc o n s t a n t a t 610n m e s p e c i a l l y t h ef l u o r e s c e n c e o fg n p sp o s s e s s e dt h ee x c e l l e n t b e h a v i o r so fa n t i p h o t o b l e a c h i n gu n d e rs t r o n gl i g h ti l l u m i n a t i o n d e s p i t et h e i r l o wq u a n t u my i e l d s g n p se x h i b i t e d s t r o n g n a t i v ef l u o r e s c e n c eu n d e r r e l a t i v e l yh i g he x c i t a t i o np o w e r t h e f l u o r e s c e n c eo fg n p sc o u l db e c h a r a c t e r i z e db yf l u o r e s c e n c ei m a g i n ga n df c sa ts i n g l ep a r t i c l el e v e l b a s e d o nt h i se x c e l l e n ta n t i p h o t o b l e a c h i n go fg n p sa n de a s yp h o t o b l e a c h i n go f c e l l u l a ra u t o f l u o r e s c e n c e w ed e v e l o p e dan e wm e t h o df o ri m a g i n go fc e l l s u s i n gg n p sa sf l u o r e s c e n tp r o b e s t h ep r i n c i p l eo ft h i sm e t h o di s t h a ta f t e r c e l l ss t a i n e dw i t hg n p so rg n p sb i o c o n j u g a t e sa r ei l l u m i n a t e db ys t r o n g l i g h t t h ec e l l u l a ra u t o f l u o r e s c e n c ea r ep h o t o b l e a c h e da n dt h ef l u o r e s c e n c eo f g n p so ne e l lm e m b r a n eo ri n s i d ec e l l sc a nb ec o l l e c t e df o rc e l li m a g i n g b a s e do nt h i sp r i n c i p l e w ei m a g e dl i v i n gh e l ac e l l su s i n gg n p sa s f l u o r e s c e n tp r o b e s a n do b t a i n e dg o o dc e l li m a g e sb yp h o t o b l e a c h i n go f c e l l u l a ra u t o f l u o r e s c e n c e i np a r t i c u l a r u n d e rs o m es p e c i f i ci l l u m i n a t i o ns u c h a st o t a li n t e m a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y g n p sc a na l s ob ed i r e c t l y u s e d n o tr e q u i r i n gt h ep h o t o b l e a c h i n gp r o c e d u r e o u rp r e l i m i n a r yr e s u l t s v 海交通j j 学博i j 学位论丈a b s t r a c t i 一 一 i i 鼍曼曼皇曼曼量曼皇曼曼曼曼鼍曼曼 曼曼曼曼曼曼曼曼曼量皇皇曼曼曼曼皇曼皇皇曼曼曼曼曼量曼鼍皇皇曼曼 d e m o n s t r a t e dt h a tg n p sa r eg o o df l u o r e s c e n tp r o b e si nc e l li m a g i n ga n dt h e c e l l u l a ri m a g i n gm e t h o dd e s c r i b e dh a s p o t e n t i a la p p l i c a t i o n s i nc a n c e r d i a g n o s t i c sa n ds t u d i e sa n di m m u n o a s s a y s 3 w ep r o p o s ean o v e le v a n e s c e n tw a v es c a t t e r i n gi m a g i n gm e t h o du s i n g a no b j e c t i v e t y p et o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o ns y s t e mt o i m a g ea n dt r a c ks i n g l e g o l dn a n o p a r t i c l e s g n p s i n s o l u t i o n i nt h i s i m a g i n gs y s t e m a m i l l i m e t e r s c a l eh o l ei so n l ye m p l o y e dt oe f f i c i e n t l ys e p a r a t eg n p ss c a t t e r i n g l i g h t f r o mt h e b a c k g r o u n d r e f l e c t e db e a m t h ed e t a i l e d e x p e r i m e n t a l r e a l i z a t i o no ft h ei m a g i n gs y s t e mw a sd i s c u s s e d a n dt h ee f f e c to ft h eh o l e s i z eo ni m a g i n gw a si n v e s t i g a t e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e h o l ed i a m e t e r sf r o m2 5m mt o4m mw e r es u i t a b l ef o rt h es c a t t e r i n gi m a g i n g b ya d j u s t i n gt h ei n c i d e n c ea n g l e f u r t h e r m o r e w ea p p l i e dt h et e c h n o l o g y s u c c e s s f u l l yt ot r a c ks i n g l eg n p sb o u n dt ol i v ec e l lm e m b r a n ev i at h e a n t i e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o ra n t i b o d y a n dm e a s u r e dt h ed if f u s i o n c o e f f i c i e n t so fs i n g l ep a r t i c l e sb yr e c o r d i n gt h e i rc o r r e s p o n d i n gt r a j e c t o r i e s c o m p a r e d t o f l u o r e s c e n t d y e s o r q u a n t u md o t s g n p sh a v en o p h o t o b l e a c h i n ga n dn ob l i n k i n g a n dt h ee v a n e s c e n tw a v es c a t t e r i n gi m a g i n g m e t h o d sb a s e do ng n p sw i l lb e c o m eav e r yu s e f u lt o o lt os t u d ym e m b r a n e d y n a m i c si nl i v i n gc e l l s a d d i t i o n a l l y t h eo b j e c t i v e b a s e dc o n f i g u r a t i o n p r o v i d e s af r e e s p a c ea b o v et h ec o v e r s l i p a n da l l o w si m a g i n ga n d c o n c o m i t a n t m a n i p u l a t i o n o fl i v ec e l l si nc u l t u r e b ym i c r o i n je c t i o n p a t c h c l a m p i n g a f ma n do t h e rt e c h n i q u e s k e y w o r d s q u a n t u md o t s g o l dn a n o p a r t i c l e s f l u o r e s c e n c e s c a t t e r i n g c e l l i m a g i n g v i b f p b s a c c d e g f e g f r f b s f c s g n p s m p a m s d p b s p e o p m m a p v p q d s t e m t i r f m 符号与标记 后焦平面 b a c kf o c a lp l a n e 牛血清白蛋白 b o v i n es e r u ma l b u m i n 电荷耦合器件 c h a r g ec o u p l e dd e v i c e 表皮生长因子 e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r 表皮生长因子受体 e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r 胎牛血清 f e t a lb o v i n es e r u m 荧光相关光谱 f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y 金纳米粒子 g o l dn a n o p a r t i c l e s 巯基丙酸 m e r c a p t o p r o p i o n i ca c i d 均方位移 m e a ns q u a r e dd i s p l a c e m e n t 磷酸盐缓冲溶液 p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n 聚环氧乙烷 p o l y e t h y l e n eo x i d e 聚甲基丙烯酸甲酯 p o l y m e t h y lm e t h a c r y l a t e 聚吡咯烷酮 p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 量子点 q u a n t u md o t s 透射电子显微镜 t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y 全内反射荧光显微镜 t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y 第1 0 4 页 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独立进行研究工作所取得 的成果 除文中已经注明引用的内容外 本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或 撰写过的作品成果 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式 标明 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 了可纯 日期乒诉 f 月拥 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 i 司意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权上海交 通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密口 在一年解密后适用本授权书 本学位论文属于 不保密彤 请在以上方框内打 学位论文作者签名 万争 j 指导教师签名 日期户 喙手 1 月劣日 纠瓴 1 日期 矽缉ff 月哆日 一1 海交通人学博l j 学位论文第 一章 绪论 1 1 引言 第一章绪论 约在四百年前眼镜片工匠们开始创制放大镜 当时放大镜的放大倍数只有3 5 倍 但是这种原始的尝试已将人类的视力引向了微观世界的广阔领域 由此人们开始 探索物质世界的微细构造 1 5 9 0 年 荷兰眼镜制造商h j a n s e e n 和他的儿子z j a n s s e n 发明了世界上第一台光学显微镜 在随后的几百年间 显微科学取得了迅猛的发展 人们逐渐地改进了成像质量 而且按照各种学科领域及研究对象的不同要求 利用不 同的光学原理 设计出多种多样的显微镜 传统的光学显微镜以光学透镜为主体 利 用材料的折射率和透镜的曲率 将被观察的物体放大 以获得其细节信息 在生物学 发展的历程中 传统光学显微镜曾起着至关重要的作用 尤其是早期成像领域的某些 重要发现 直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展 随着生命科学研究的 深入 人们迫切需要从单细胞和单分子尺度上原位 活体 实时地了解物质之间的相 互作用及生命的过程 但是光学显微镜由于受到光衍射效应的影响 存在分辨极限 即成像放大倍数不能任意增大 瑞利将之归纳为r 旦尝 其中兄为成像光波波长 以s i n n s i n 0 为物镜的数值孔径 即n a 值 对可见光来说 光学显微镜的空间分辨极限为2 5 0 3 0 0n l i l 从应用的角度 传统光学显微镜无法满足更高分辨率的要求 电子显微镜 以及近十几年来出现的非光学类扫描探针显微技术 如原子力显微镜 虽然能够将成 像的分辨率推进到纳米的精度 但是它们均在不同程度上存在系统结构复杂 成像检 测环境要求苛刻等困难 不能广泛地用于观察蛋白质分子 尤其是不能象光学显微镜 那样提供重要的光学信息 如偏振态 折射率 光谱等 和进行无损伤性的生物活体 探测 2 0 世纪8 0 年代以来 随着光学 激光 光电以及计算机视频与图象处理技术的 飞速发展 新型物镜透镜 聚光器和超灵敏探测器不断出现 光学显微镜技术也进入 第1 页 i 8 交通人学博i 学位论文 第一章绪论 了一个新的发展阶段 研究和生产光学显微镜的各国专家学者和制造商们相继提出了 多种新颖的激光显微镜设计 并且很快推出了融入大量先进技术的新一代商品化的显 微镜仪器 这些新一代的光学显微镜以其高空间分辨率和时间分辨率 无损伤以及对 单分子活体探测的可行性 再次成为生物学家 物理学家和成像学家们研究的热点 目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技术有激光扫描共焦显微术 近场扫描 光学显微术和全内反射荧光显微术i i 捌 这些技术在分子生物学 分子化学 激光医 学及纳米材料等领域受到广泛关注 并产生了深远的影响 1 2 传统光学成像技术 1 2 1 明场显微术 明场显微术 b r i g h t f i e l dm i c r o s c o p y 是以标本的颜色及其透过率为基础的显微 镜哪 其照明法有透射式和落射式两种 透射式是最常见的方法 一般标本需经过 染色处理才能达到应有的效果 落射式显微镜是近年来出现较多的显微镜 用来观察 不透光的金属 矿物等标本 基本结构与透射式相同 区别在于将物镜又充当聚光镜 使用 物镜上方的半透膜镜将照明光线经物镜射入到标本上 标本一般不用盖玻片 1 2 2 暗场显微术 暗场显微术 d a r k f i e l dm i c r o s c o p y 通过在明场显微镜上安装暗场聚光镜 使 来自聚光镜的光线不直接入射到物镜内 而被标本散射的光则可以进入物镜 从而达 到在黑暗的背景下可看到标本的外部形态 3 4 其照明方式也有透射式和落射式两种 聚光镜 暗场显微镜特别适用于胶体化学领域中观察溶质粒子的布朗运动 适用于观 察原虫 细菌的鞭毛 伪足运动 医学检验学范围适用于观察人体体液中螺旋体 结 晶或各种粒子 在这一点上 暗场显微镜远比其他种类显微镜要优越得多 第2 页 j j 海交通人学博i j 学位论文第一章绪论 1 2 3 偏光显微术 偏光显微镜 p o l a r i z a t i o nm i c r o s c o p y 是依据波动光学的原理观察和精密测定标 本细节 或透明物体改变光束的物理参数 以此判别物质结构的一种显微镜 3 4 1 广 泛应用于矿物 晶体 陶瓷 金属 药物和生物组织等具有双折射性偏光物质的观察 研究和鉴别 1 2 4 相衬和微分干涉相衬显微术 对于无色透明标本 在明场显微镜下不易清晰可辨 而用相衬显微镜 p h a s e c o n t r a s tm i c r o s c o p y 则清晰可见 当光线透射透明的 折射率与周罔介质折射率不 同的物体时 其相位会发生变化 而振幅 明 暗差别 和波长 颜色 的变化不明 显 因此无法被人的眼睛识别 相衬显微术则是依靠装在物镜内的相位板 使照射物 体点的直射光与衍射光发生干涉 使相位差转换成振幅差 明暗差别 从而使人们 可以观察无色透明的标本f 3 4 1 微分干涉相衬显微镜 d i f f e r e n t i a li n t e r f e r e n c ec o n t r a s t m i c r o s c o p y d i c 是利用偏光干涉原理的一种显微镜 3 4 其功能与相村显微镜相似 它是把无色透明的标本转换成明暗和颜色的变化而增强衬度的另一种显微术 从起偏 镜出来的偏振光通过渥拉斯顿棱镜后 分成相互垂直的两束偏振光 两束光分别在距 离很近 小于显微镜的最小分辨距离 的两点上通过被检物体 两束光在相位上略有 差别 两路光通过物镜后 经第二组渥拉斯顿棱镜相吻合 在经过检偏镜后使它们振 动方向一致而发生干涉 从而形成较连续的明暗反差 构成具浮雕感的图象 2 0 世 纪8 0 年代以后 人们也逐渐使用一些视频设备 比如照相机 代替人眼进行相衬观 察 在很大程度上提高了显微成像的清晰度以及衬度 5 9 1 因此 也形成了相应的视 频增强相衬显微镜 d e o e n h a n c e dp h a s ec o n t r a s tm i c r o s c o p y 和视频增强微分干涉 相衬显微镜 v i d e o e n h a n c e dd i f f e r e n t i a li n t e r f e r e n c ec o n t r a s tm i c r o s c o p y 第3 页 i 海交通人学博f j 学位论文 第一章绪论 1 3 单分子光学成像技术 1 3 1 宽场落射荧光显微术 宽场落射照明 w i d e f i e l de p i i l l u m i n a t i o n 是最直接的单分子成像方式 只要 将普通落射荧光显微镜加以改进或增加附件就可以实现单分子水平上的成像 光学系 统通常包括激光光源 聚焦光学装置 高性能的二色分光镜 无荧光浸油物镜 n a 1 3 以及超灵敏的制冷型c c d 或i c c d 相机 它们能以毫秒级时间分辨率对成像平 面的单个移动荧光团成像 还可以对多个单荧光分子同时成像 也可以跟踪反应过程 反复成像 实时检测单分子动力学和单分子反应 但其探测体积相对较大 信噪比低 国际上有多个课题组使用了这种宽场落射荧光显微技术研究了在空气中表面上的或 在水介质 比如生物缓冲液 中的单分子 f u n a t s u 等人通过该方法得到了单个肌球 蛋白的荧光像 l0 1 s a s e 等人观察了肌丝滑动时标记在其上的单个四甲基罗丹明分子 1 1 1 s c h m i d t 等人也通过该方法观测了单个脂质分子的自由二维扩削1 2 1 3 1 3 2 全内反射荧光显微术 影响液相中单分子荧光检测的主要因素来自液体分子的拉曼散射和非焦平面的 荧光发射 全内反射荧光显微术 t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y t i r f m 是近年来新兴的一种光学成像技术 它利用光线全内反射时产生的隐失场 或 称为隐失波 照明样品 使照明区域限定在样品表面百纳米级厚的薄层范围内 非常 有效地控制了激发体积 因此 t i r f m 具有其它光学成像技术无法比拟的高信噪比 和对比度 同时 细胞的光损伤和光漂白也很小 t i r f m 的成像装置简单 极易和 其它成像技术 探测技术相结合 目前已成功地实现1 0 0n l n 甚至更低的空间分辨率 上世纪8 0 年代早期 a x e l r o d 等生物物理学家对t i r f m 技术及基本原理进行描述 并探索了其生物应用 1 4 d6 但直到9 0 年代 随着新型物镜透镜 聚光镜和超灵敏探 测器的出现 t i r f m 技术才得到充分发展 1 9 9 5 年 f u n a t s u 等人首次使用t i r f m 直接观察到溶液中单个的荧光染料分子 通过对荧光标记的单个肌球蛋白分子成像成 l 海交通人学博l 学位论文第一章绪论 功探测了单个a t p 的翻转反应 1 0 至今 t i r f m 己广泛用于生命科学研究 特别在 单分子检测中更显示其强大的生命力 成为当今世界上最具前途的生物光学显微技术 之一 1 3 3 激光扫描共焦显微术 因为传统光学显微镜使用的是场光源 所以标本上每一点的图象都会受到邻近 点的衍射光或散射光的干扰 标本中细微结构的成像不够清晰 激光扫描共焦显微镜 l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y l s c m 技术1 1 7 1 9 是在传统光学显微镜基础上 加上激光扫描装置 利用激光束通过光栅针孔形成点光源 然后在标本的焦平面上逐 点扫描 采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管 p h o t o m u l t i p l i e r t u b e p m t 再经过信号处理 在计算机监视屏上形成图像 由于激光光源的光栅针孔和探测针孔 对物镜焦平面是共轭的 焦平面上的点同时聚焦于光栅针孔和探测针孔 进行点扫描 时 扫描点以外的点不会成像 经逐点扫描后才形成整个标本的光学切片 虽然共焦 成像的思想早在5 0 年代就由m a r v i nm i n s k y 等人提出 2 0 但由于受到技术条件的限制 直到8 0 年代后期 随着激光技术 计算机图象处理技术的迅速发展 才使人们逐渐认 识到其重要性 并且发展成性能稳定的产品 l s c m 系统主要包括激光光源 显微镜 扫描模块 包括共聚焦光路通道和针孔 扫描镜 检测器 数字信号处理器 计算 机以及图象输出设备等 一般情况下 人们基于共焦构型的显微镜 可获得三种光的 信息 1 样品的反射光或散射光 2 透过样品的透射光 3 样品的荧光 探测荧 光信息的显微镜也称为 共焦荧光显微镜 目前 激光扫描共焦显微镜由于其高分辨率 高灵敏度以及独特的轴向层析成像 能力几乎适用于细胞生物学 细胞生理学 神经生物学和神经生理学等所有涉及细胞 研究的医学和生物研究领域 它不仅可以通过对活的或固定的细胞及组织进行无损伤 的 光学切片 获得精细的细胞骨架 染色体 细胞器和细胞膜系统的三维图像 并 同时进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析 还可以用于活细胞 的生理信号诸如膜电位 p h 值以及n a c a 2 m 孑 离子含量的实时动态分析监测 第5 页 i 海交通人学博i 学f 论文 第一 章绪论 粘附细胞的分选和光陷阱技术等 此外 还可以应用荧光光漂白恢复技术 f l u o r e s c e n c er e c o v e r ya f t e rp h o t o b l e a c h i n g f r a p 和光漂白中的荧光丢失技术 f l u o r e s c e n c el o s si np h o t o b l e a c h i n g f l i p 研究活细胞中蛋白质分子的运动以及应 用荧光共振能量转移技术 f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r f r e t 研究蛋白 质分子之间的相互作用等 激光扫描共焦显微术的问世是显微成像技术发展史上具有划时代意义的重大进 展 至今一直处于不断发展进步中 近年来 一系列新型的共焦显微镜相继研制成功 并投入使用 诸如荧光寿命成像共焦显微镜 f l u o r e s c e n c el i f e t i m ei m a g i n g m i c r o s c o p y 2 l 双光子共焦显微镜 t w o p h o t o nm i c r o s c o p y 2 2 4 p i 共焦显微镜 4 p im i c r o s c o p y 2 3 多焦点多光子共焦显微镜 m u l t i f o c a lm u l t i p h o t o nm i c r o s c o p y 2 4 等 它们较传统的共焦显微镜有着各自独特的优势 特别的是 最近德国马普研 究所s t e f a nh e l l 课题组发展的受激发射损耗 s t i m u l a t e de m i s s i o nd e p l e t i o n s t e d 显微技术 2 5 2 7 1 以及哈佛大学庄晓薇课题组发展的随机光学重建显微技术 s t o c h a s t i c o p t i c a lr e c o n s t r u c t i o nm i c r o s c o p y s t o r m 2 8 3 0 1 更是突破传统的光学衍射障碍 达 到纳米级分辨率 成为真正意义上的超分辨成像技术 1 3 4 近场扫描光学显微术 物体表面外场的分布可以划分为两个区域 一个是距物体表面小于波长九的区 域 称为近场区域 另一个是从近场区域至无穷远处 称为远场区域 在近场区域内 既有可向远处传播的辐射场 传播场 又有仅限于物体表面一个波长以内的非辐射 场 隐失场 它的强度随离开表面距离的增加而迅速衰减 而在远场区域只存在辐 射场 常规的光学仪器如显微镜 望远镜等主要用于探测远场区域 近场扫描光学显微 镜 n e a r f i e l ds c a n n i n go p t i c