（化学工艺专业论文）dα生育酚琥珀酸酯制备精制工艺研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 摘要 垂小生育酚琥珀酸酯作为天然舢生育酚的酯化衍生物在保健品市场具有很 大的前景 同时也是一种有效的癌症辅助治疗药物 本文研究了小肛生育酚琥珀 酸酯包括制备 分离纯化 结晶等过程的工艺 首先 对于d a 生育酚琥珀酸酯的制各 采用含量较高的天然a 生育酚作为 原料 与琥珀酸酐酯化 以三乙醇胺作为催化剂 在正己烷溶剂中进行反应 通 过考察初始原料比 催化剂用量 溶剂用量 反应温度等条件对酯化反应的影响 结合前期实验结果确定酯化的条件为反应时间为4 小时 反应温度为9 0 c 琥 珀酸酐厌然a 生育酚为2 m o l m 0 1 三乙醇胺 天然出生育酚是0 0 6 m l g 正己烷 天然a 生育酚为2 5 m u g 工艺条件优化后 a 生育酚的转化率在9 6 以上 d a 生育酚琥珀酸酯的收率在9 3 以上 本文分别研究了采用硅胶和树脂两种固定相柱层析法分离纯化止a 生育酚 琥珀酸酯 先是采用硅胶作为固定相 以实验室自制品为原料 确定层析条件为 层析介质为1 0 0 2 0 0 目粗孔 号 洗脱液为氯仿甲醇梯度洗脱 流量为2 m l m i n 室温 上样量为3gd a 生育酚琥珀酸酯租品 4 0g 硅胶 上样浓度为 0 3 8g m l 此时 柱层析产物含量能从原料6 0 左右提高至7 8 以上 回收率 达到9 0 以上 然后采用树脂作为固定相层柝分离纯化办洳生育酚琥珀酸酯 通 过筛选 选定大孔吸附9 号树脂作为固定相 无水甲醇作为流动相 流量为2 m i m i n 柱温为3 0 c 上样量为3gd a 生育酚琥珀酸酯粗品 1 0 0m l 树脂 上 样浓度为o 2 5 鲈n l 此时 柱层析产物含量能从原料6 8 左右提高至8 5 以上 部分流份收集时含量能达到9 0 以上 回收率在9 0 以上 本文还通过包括溶剂的选择 结晶速率的考察等研究 对于d a 生育酚琥珀 酸酯的结晶做了初步研究 关键词 击洳生育酚琥珀酸酯柱层析法硅胶 树脂 结晶 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 a b s t r a c t a st h ed e r i v a t i v eo fd a t o c o p h e r o l d a t o c o p h e r y ls u c c i n a t ei ss t a b l e a n dh a s a n t i c a n c e re f f e c t t h e r e f o r ei ti sp r o m i s i n gi nt h ef i e l do fm e d i c i n e i nt h i sp a p e r w e s t u d i e dt h ep r e p a r a t i o n s e p a r a t i o na n dc r y s t a l l i z a t i o no f d 电 t o c o p h e r o ls u c c i n a t e f i r s t l y w es t u d i e dt h ep r e p a r a t i o no fd a t o c o p h e r y ls u c c i n a t e w eu s eh i g h c o n t e n td a t o c o p h e r o la n ds u c c i n a t ea n h y d r i d ea sr a wm a t e r i a l s t d e t h a n o l a m i n ea s t h ec a t a l y s t 开一h e x a n ea st h es o l v e n t d a t o c o p h e r o ls u c c i n a t ew a gp r e p a r e d e f f e c t s o fv a r i o u sc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r em o l a rr a t i oo f d a t o c o p h e r o i t os u c c i n a t e a n h y d r i d e 1 2 t h er a t i oo fn h e x a n ev o l u m et o d a t o c o p h e r o l2 5m l g t h er a t i oo ft r i e t h a n o l a m i n et od a t o c o p h e r o lo 0 6m l g r e a c t i o nt e m p e r a t u r e9 0 ca n dr e a c t i o nt i m e4h t h ec o n v e r s i o no fd a t o c o p h e r o l w a sa b o u t9 6 a n dt h ey i e l do f d x t o c o p h e r o ls u c c i n a t ew a sa b o u t9 3 t h e nw ep u r i f i e dt h ed a t o c o p h e r y ls u c c i n a t et h r o u g hc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y s i l i c a g e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n dm a c r o p o r o u s a d s o r b e dr e s i nc o l u m n c h r o m a t o g r a p h yw e r ea p p l i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s o fs i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h yw e r ea sf o l l o w s c h l o r o f o r ma n dm e t h a n o lw e r eu s e da sm o b i l e p h a s e s t h el o a do fs a m p l e3g 4 0gs i l i c ag e l 1 0 0 2 0 0m e s h t h ef l o wr a t e2m i m i n r o o mt e m p e r a t u r e t h ec o n c e n t r a t i o ni nt h em o b i l ep h a s eo 3 8g m l t h ep u r i t yo fd c t t o c o p h e r y ls u c c i n a t ei n c r e a s e dt o7 8 f r o m6 0 w i t hr e c o v e r y9 0 a to p t i m u m c o n d i t i o n s b yu s i n gm a c r o p o r o u sa d s o r b e dr e s i nc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y w ec h o s e m a c r o p o r o n sa d s o r b e dr e s i nn o 9a ss o l i dp h a s e a n dm e t h a n o lw a su s e da sm o b i l e p h a s e s t h eo p t i m u m c o n d i t i o n so fm a c r o p o r o u sa d s o r b e dr e s i nc o l u m n c h r o m a t o g r a p h yw c i ea sf o l l o w s t h ef l o wr a t e2m l m i n t e m p e r a t u r e3 0 1 2 t h el o a d o fs a m p l e3 1 0 0m lr e s i n t h ec o n c e n t r a t i o ni nt h em o b i l ep h a s e0 2 5g m l t h e p u r i t yo fd a t o c o p h e r y ls u c c i r m t ei n c r e a s e dt om o r et h a n8 5 w i t l lr e c o v e r ym o r e t h a n9 0 a to p t i m u mc o n d i t i o n s w ea l s os t u d i e dt h ec r y s t a l l i z a t i o no fd r t o c o p h e r y ls u c c i n a t em c l u d i n gt h e s o l v e n t ss e l e c t i o n t e m p e r a t u r ed e c r e a s i n gr a t ea n ds oo n k e yw o r d s d 吨 t o e o p h e r y ls u c c i n a t e s i l i c ag e lc o h m mc h r o m a t o g r a p h y m a c r o p o r o u sa d s o r b e dr e s i nc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y c r y s t a l l i z a t i o n 2 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 1 j l 刖舌 维生素e v i t a m i ne 即生育酚 t o c o p h e r 0 1 其名字来源于希腊词汇 意 为 生育后代 于1 9 2 2 年被人们所发现 天然a 生育酚具有很强的生物活性 在生物活性和化学安全性方面都比化学合成维生素e 有很大的优势 具有抗衰 老 提高免疫力的作用 是重要的保健药品 但由于天然洳生育酚结构上有一个酚羟基 因此容易被氧化 且运输不便 给维生素e 的制备和储存带来许多不便 同时生育酚的表面活性较差 不具有润 湿 保湿等美化皮肤的功效 限制了在化妆品行业中的应用 生育酚的衍生物 如醋酸酯 烟酸酯 琥珀酸酯改善了生育酚的物理性质 在人体吸收后水解为生 育酚和相应的酸 增加了生育酚在体内的停留时间 增加了它的药理性能 因此 其衍生产品应运而生 在其众多衍生物中 d a 生育酚琥珀酸酯表现出优于其他 衍生物的独特优势 d a 一生育酚琥珀酸酯为白色结晶体 并且包装 运输方便 可以压片 所以 是国际市场上常见的天然a 生育酚衍生物 在保健食品领域具有十分广阔的应用 前景 未洳生育酚琥珀酸酯作为营养剂补充剂在欧美日等发达国家广泛应用于健 康食品中 在1 9 8 2 年 正小生育酚琥珀酸酯还被发现 相比较其他维生素e 衍 生物 它还具有抗癌的能力 它可以在不影响正常细胞生长的前提下 诱导癌细 胞变异 抑制癌细胞增殖直至其自然凋亡 在过去的二十多年来 许多实验也都 证明了这项发现 西a 一生育酚琥珀酸酯被认为是一种具有很好前景的非常有效的 癌症辅助治疗药物 对于合成小舡生育酚琥珀酸酯的文献中有提及若干种合成的方法 前期已经 对于这些方案进行筛选并有所创新 对于分离方法 文献中报道较少 但对于整 个生产工艺是至关重要的 因此对于d a 生育酚琥珀酸酯的合成及精制工艺的研 究是十分具有意义的 本文根据文献 对于垂静生育酚琥珀酸酯的合成 分离 结晶等工艺都做了相关的研究 为具体工业化提供一定基础 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 1 1 生育酚概述 第一章文献综述 生育酚 即传统所指维生素e 是一类物质的总称 包括a 1 3 y 8 生育 酚和c t p t 6 一生育三烯酚 是人和动物必需的一种营养物质 缺乏生育酚 动物将不能生育 生育酚不仅与生殖系统 而且与中枢神经系统 消化系统 心 血管系统和筋肉系统的正常代谢都有密切关系 生育酚能够治疗冠心病 动脉粥 样硬化 贫血 脑软化 肝症 癌症等病症 临床研究证明 弘生育酚可以大大 降低心脏病的发病率 可降低7 5 血液中a 一生育酚含量低是最重要的心脏病 致死因素 因此 西方国家更用它作为预防心脏病的药物 在生育酚中 洳生育 酚是彼认为是生物活性最强的 与a 生育酚相比 b 生育酚只有2 5 4 0 的弘 生育酚活性 y 生育酚则为2 0 a 生育酚的生物活性 1 1 1 生育酚的结构与命名 生育酚有天然与合成之分 生育酚具体结构 1 3 如图1 1 和1 r 2 所示 c i i 为手性碳原子 r i c h 3r 2 c h 3 a 生育酚 r l c h 3 r 2 h争生育酚 r 2 c h 3r 2 h 1 生育酚 r l h r h 6 生育酚 图1 1 天然生育酚结构和命名 2 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 奶 弋f 榭v v 2 r4 r8 r 弭 t o d l h e m i b 舭f 2 r4 s8 r x t o c o p h e r 0 1 b 芦弋f v 2 r4 r8 sc t o c o p h e r o l 燃 弋f掰一 图1 2 合成生育酚结构和命名 天然存在的生育酚由四种仅含右旋光学异构体的同系物组成 早期将它们 命名为小昏生育酚 d a t o c o p h e r 0 1 a 1 3 一生育酚 d p t o c o p h e r 0 1 却 生育酚 d 吖 t o c o p h e r 0 1 和出6 生育酚 脚 t o c o p h e r 0 1 按照国际理论与应用化学联合会 i u p a c 和国际生物化学联合会 n y b 组成 的一个生化命名专门委员会的规定 2 1 天然存在的四种生育酚被命名为2 见4 r 8 r 生育酚 或 兄胜 生育酚 合成生育酚 a l l r a c 诉生育酚 主要指全消旋舻生育酚 由三甲基氢醌与异 植物醇合成得到 含8 种光学异构体 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 1 1 2 生育酚的性质与用途 1 1 2 1 生育酚的性质 舡生育酚化学名称为3 4 二氢 2 5 7 8 一四甲基 2 4 8 1 2 三甲基十三烷 基1 2 h 1 苯并毗喃 6 醇 是淡黄色粘稠状液体 无臭无味 分子量为4 3 0 5 分 子式为c 2 9 h 5 0 0 2 熔点为2 5 3 5 c 相对密度为砰5 o 9 5 0 不溶于水 易溶于 乙醇 混溶于丙酮 氯仿 乙醚和植物油 对热和酸相对比较稳定 露置于空气 中则缓慢氧化 有铁盐 银盐存在时氧化较快 不同生育酚的氧化途径和产物均不同 在过氧化物 单线态氧 氧气等存 在的一些温和的条件下 生育酚的氧化途径和产物就非常复杂 同时氧化过程 还受到许多条件如光照强度 金属离子 底物 溶剂 生育酚浓度 温度 p h 值等影响 生育酚的生物活性差别较大 生育酚生物活性常以国际单位 i u 或者洳 生育酚当量 a t e 来标示 国际单位 i u 的定义是 1n a g 合成d l c t 生育酚 醋酸酯的生物活性为11 v d a 生育酚当量 a t e 表示1m gd a 生育酚的生 物活性是1m g a t e 具体a 生育酚及其衍生物的生物活性见表1 1 表1 r 1 生育酚及其衍生物的生物活性 合成生育酚主要指全消旋a 生育酚 由三甲基氢醌与异植物醇合成得到 含 4 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 8 种光学异构体 天然生育酚从植物油脱臭馏出物中提取 经分离提纯精制得到 两者来源不同 天然小a 生育酚为单一右旋光性 合成品d 1 舡生育酚为无旋光性混合物 两者立体结构具有差异 天然正 生育酚被碱性铁氰化钾氧化后 可得到一种化 合物 比旋光度为b 塔为 3 1 5 可以通过旋光性的测定 来区分天然正口 生 育酚和合成品d l 一舡生育酚 合成生育酚生物活性没有天然强和天然的安全 f d a 美国食品与药品管理 局 w h o 世界卫生组织 u s p 美国药典 等就已承认了这一事实 他 们认为q 生育酚天然品比合成品的生物活性高3 6 因此现今市场上更倾向于 使用天然a 生育酚 研究者们得出结论 合成伽生育酚的生物活性大约只有天 然洳生育酚的一半 同时击洳生育酚比d 1 c 生育酚在人体内的保留时间要长 1 1 2 2 生育酚的用途 天然生育酚的用途主要在医药 食品 化妆品等与人体有关的方面 洳生育酚是细胞内抗氧化剂 能够抑制有毒的脂类过氧化物的生成 使不饱 和酸稳定 提高刺激性辅酶q 的免疫性反应 对脑垂体 中脑系统有调节作用 促进腺激素的产生 预防细胞生理衰老 防止致癌物游离基的产生 它在动脉硬 化 冠心病 血栓 习惯性流产 妇女不育症 月经失调 内分泌机能衰退 肌 肉萎缩 贫血 脑软化 肝病 癌症等许多方面 均有很好的医用价值 被人们 称为 西方人参 天然生育酚主要用作脂肪和含油食品的抗氧化剂 保持加工食品稳定持久的 新鲜风味 由于主要用的是其抗氧化性 所以主要用混合生育酚 已广泛应用于 食用油 乳制品 烘烤食品 婴儿食品 饮料等食品中 天然生育酚具有干扰自由基产生和防止色斑形成的作用 它易被皮肤吸收 能促进皮肤的新陈代谢和防止色素沉积 改善皮肤弹性 具有美容护肤 防衰老 的特殊功能 用生育酚作为营养添加剂的化妆品 已成为国际市场上营养性系列 化妆品的主流 5 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 p k c 是一类被生育酚所抑 制的同功酶 抑制是由于酶的自 磷酸化作用 同时是由于蛋白质 磷酸酶p p 2 a 对于p k c 的脱磷 酸作用 这步反应是由弘生育 酚启动的 许多生育酚对于细胞 信号的作用可以由p k c 被抑制 这点被解释 4 图1 3 平滑肌细胞中生育酚对p k c 活性的抑制 在中国林县的一份调查报告中显示 2 9 5 8 4 个成年人中有1 5 0 0 0 人在五年半的 时间中每天服用3 0n a g 弘生育酚及1 5m g1 3 胡萝卜素补充营养剂 数据结果显示 服用这些药剂的人比没有服用的人癌症死亡率降低1 3 胃癌及食道癌的发生率 降低了1 0 5 1 a 生育酚在很多关于前列腺癌的试验结果中表明能够抑制癌症 在a t b c 的 研究报告中表明 男性吸烟者服用小生育酚补充营养品比没有服用者前列腺癌症 病发率低3 4 死亡率低4 1 t 6 7 1 男性服用m 生育酚者与服用安慰剂者相比血浆中雄烯二酮和睾酮的含量要 明显降低 这项发现被a r b c 认为a 生育酚对于荷尔蒙激素的生成及代谢更新 有一定影响 8 1 是可以降低前列腺癌的发生 目前世界生育酚的用量约为2 5 0 0 0 吨 年 天然生育酚与合成生育酚市场份 额分别为2 0 和8 0 国际上天然生育酚主要生产厂家有a d m 公司 年生产能力1 8 0 0 t h e n k e l 和r o c h e c a r g i l l 公司以及日本的e i s a i 公司 年生产能力1 2 0 0t 和b a s f 公司 国内主要有浙江大学 华东中药工程集团 清华大学 西安油脂科学院 武 汉化工学院等 6 如 m o 一摹一 o麓dlllij u i 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 1 1 3 生育酚的局限性及存在的问题 传统的生育酚为粘性油状物 通常用于制作软胶囊 但制作片剂 硬胶囊工 艺上无法达到预期目的 普遍存在易吸潮 易染菌 不易压片 单位重量产品的 生物活性低 片剂和胶囊占用体积大等 生育酚在空气中会发生缓慢氧化 暴露在空气 光 热 碱并有r 2 c u 2 等金属离子存在下 氧化过程会加速进行 氧化产物主要包括生育酚氧化物 生 育酚醌 生育酚氢醌 还有生育酚二聚物 生育酚三聚物等 给生育酚产品的制 备 储存带来许多不便 另外生育酚的表面活性差 不具有润湿 保湿等美化皮 肤的功效 限制了在化妆品中的应用 1 2o 生育酚琥珀酸酯概述 针对a 生育酚所产生的氧化等问题 人们将视线转向a 生育酚的一系列衍 生产品 希望其衍生产品可以既保持 生育酚原有的优点 又能在一定程度上改 善原有的不足情况 相关衍生产品通常包括a 一生育酚醋酸酯 弘生育酚烟酸酯 a 生育酚琥珀酸 酯 弘生育酚琥珀酸钙 a 一生育酚丁二醇酯 小生育酚亚油酸酯等 它们不仅具 有协同效应 还具有本身独特的作用 相关重要衍生物结构见图1 4 o i c h a c a n 一生育酚醋酸酯结构 b f t 生育酚烟酸酯结构 图1 4 小生育酚相关衍生物结掏 7 丫 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 叶生育酚醋酸酯是由通过g 生育酚的酚羟基乙酰化得到的 a 生育酚醋酸酯 不易因环境原因如温度 光照紫外线 空气等氧化 小生育酚醋酸酯作为弘生育 酚的替代品在各个领域均得到应用 它能够充分体现出a 生育酚的功效 好多市 场上的维生素e 其实就是a 生育酚醋酸酯形式 a 一生育酚烟酸酯通过静生育酚和烟酸酯化制得 是理想的调节血脂和微循环 活化制 它分别具有m 生育酚和烟酸各自的生理作用 消除了因单独使用c t 生 育酚或烟酸所引起的毒副作用 而且比两者合用具有更稳定更持久的药理作用 疗效持久 稳定 可以主要用于心脑血管疾病的治疗 调血脂 抗氧化 有助于 阻断形成动脉粥样硬化 在这众多衍生物中 小生育酚琥珀酸酯引起了人们的很大关注 其延续了弘 生育酚的生物活性 产品为白色固体 满足了人们对于生产工艺的需要 而且在 原有的基础上 由于琥珀酸基团的作用 使得其具有了抗癌的功效 是一种很有 前景的有效的辅助抗癌药物 成为近年来研究的热点 口一生育酚琥珀酸酯还有一些独特的药理功能 例如 它是良好的催乳激素和 生长激素的分泌促进剂 而普通的旺 生育酚 n 生育酚醋酸酯 旺 生育酚烟酸 酯没有这种作用 除了直接作为一种维生素e 商品以外 a 生育酚琥珀酸酯还 可以作为合成水溶性维生素e 的中间体 a 生育酚琥珀酸酯的市场价格远高于一 般的维生素e 将a 生育酚转化成琥珀酸酯 是提高维生素e 产品附加值的有效 途径 1 2 1静生育酚琥珀酸酯理化性质 弘生育酚琥珀酸酯 a t o c o p h e r o ls u c c i n a t e a t o s 又名维生素e 琥珀酸酯 v i t a m i nes u c c i n a t e v e s 其结构如图1 5 所示 8 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 图1 5i i 生育酚琥珀酸酯结构 肛生育酚琥珀酸酯外观为针状晶体 分子式为c 3 3 h 5 4 0 5 分子量5 3 0 7 6 c a s 4 3 4 5 0 3 3 熔点7 3 7 8 c 在乙醇中的最大紫外吸收波长为2 8 5 舢 e 兹3 8 5 不溶于水 易溶于有机溶剂 a 生育酚琥珀酸酯是通过琥珀酸酐与a 生育酚的6 位游离羟基成酯而形成的 小生育酚衍生物 因为保护小生育酚的6 位羟基免于氧化 使舡生育酚琥珀酸酯 比小生育酚在储存和运输中稳定性增加 传统的维生素e 如a 生育酚 m 生育酚醋酸酯等物质状态均为粘油状 适合 制作软胶囊 疗效很好 但在制成片剂 硬胶囊时困难 工艺无法达成 舡生育 酚琥珀酸酯则克服了制作片帮和硬胶囊工艺上的麻烦 其常温下即是固体状态 具体产品规格见表1 2 表1 2 a 生育酚琥珀酸酯规格 项目指标 性状 含量 酸度 重金属 以p b 计 堆积密度 比旋度 熔点 白色或类白色晶体状粉末 无味或几乎无味 9 6 o 1 0 2 0 1 8 0 r 1 9 3m l 1 0 m g k g 0 4 5 0 6 0e c e m 3 2 4 7 3 7 8 9 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 1 2 2a 生育酚琥珀酸酯的制备工艺 弘生育酚琥珀酸酯的合成是以小生育酚和琥珀酸酐为主要反应物 在某一催 化剂的作用下生成目标产物 为一步酯化反应1 9 1 8 所用催化剂通常是碱性的 酸性催化剂会使得产物变黑 使用的碱性催化荆一般有 乙酸钠 乙酸钾 碳酸 钾 碳酸钠 乙酸钙 碳酸氢钠 琥珀酸钾及琥珀酸钠等 也有用吡啶或胺作催 化剂的 反应所用的溶剂可以是乙醚 石油醚 正己烷 丙酮等 或不用溶剂 反应温度范围为8 0 1 8 04 c 但也有在室温下进行的 反应时间从几分钟到几小 时不等 反应式见图1 6 厂弋催化剂 i i 5 0 h io 尺o d c i c 日艄7 c d 口j j r l 飞 厶 图1 6 弘生育酚琥珀酸酯合成反应式 p e t e rm c 幢a n t 课题组在1 2 0 1 4 0 c 下制备洳生育酚琥珀酸酯 在他们的合成 方法中 他们以无水碱金属作为催化剂 他们合成方法的优势在于合成过程中不 需使用溶剂 但是在其方法中提到 如果使用这种方法 反应催化剂需在使用前 经烧熔后迅速与反应原料混合然后反应 这种方法在实验室中少量反应时可行 而在实际生产过程中运用的话是比较困难的 9 j o h n d c a w l e y 等人的实验方法为 将生育酚与琥珀酸酐9 0 c 下反应4 h 反应产物用乙醚稀释 然后在3 c 以下维持1 5h 以沉淀未反应的琥珀酸酐 并将 其过滤掉 滤液再用醚冲稀 再用稀盐酸和水连续洗涤 干燥 蒸馏回收醚 得 到黑色油状物质 1 0 该实验方案中多次使用乙醚 在具体工业生产中乙醚比较危 险 t e t s u y a 等人发明的弘生育酚琥珀酸酯的制取方法 克服了酯化反应混合物变 黑的问题 反应是在还原性环境中进行的 并用无水乙酸钠作催化剂 将d z n 生育酚与琥珀酸酐 无水乙酸钠 锌粉和乙酸混合在一起 然后在1 0 0 1 4 0 c 搅 拌 反应时间一般以2 8h 为宜 将反应混合物与适量水混合 用正己烷萃取 1 0 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 正己烷萃取液用水洗涤 再用无水硫酸钠干燥 过滤 滤液在减压下浓缩 得到 生育酚的琥珀酸酯粗品 一2 1 该反应中产生的氢气在高温1 0 0 1 4 0 c 会造成安 全隐患 y o s h i m u r a 等报道了一种制取生育酚酯的新工掣 l 采用叔胺做催化剂 在 低于4 0 c 的条件下进行酯化反应 而在以前的工艺中 以吡啶为催化剂的酯化反 应在低于4 0 c 的条件下是无法实现的 由于酯化反应在温度高于8 0 c 时生成的酯 就会变黑 而在4 0 以下基本上不着色 因此该催化剂的发现是很有价值的 而 且 在此低的温度下 该工艺仍能在较短时间 3 4h 内完成酯化反应 叔胺 催化刺包括 三乙胺和n n n n 四甲基乙二胺等 溶剂采用非质子性溶剂如丙 酮 甲乙酮等 具体工艺为 伍 生育酚与琥珀酸酐及甲乙酮一起溶解 然后加入 三乙胺 在室温下搅拌3 4 h 用薄层色谱法 丙酮 冰乙酸 1 9 1 判断反 应终点 向反应混合液中加入异丙醚 然后用稀硫酸溶液 5 洗涤有机相 用水洗至中性 无水硫酸钠干燥 有机相减压浓缩 即得生育酚琥珀酸酯 1 1 l j a m e sgb a x t e r 等a t l4 1 则是将3 5 0g 2 8 6 生育酚和l o og 琥珀酸酐及4 0 0 m l n t l 啶在氮气下8 0 加热3 d 时 混合物在5 下过夜 过滤除去过量的琥珀酸 酐 干晶体用乙醚充分洗涤以除去生育酚 乙醚溶液再用5 的盐酸洗涤除去吡 啶 然后水洗 干燥 此外 还有毗啶作溶剂反应 小a 生育酚先与格氏试剂反应 再与琥珀酸酐 反应生成目标产物的 5 1 用吡啶作催化剂时 价格昂贵 且需要增加洗涤次数以 彻底除去催化剂 易德莲 伍林等人 1 9 1 对于甜生育酚琥珀酸酯的合成做了 些研究 他们以 丙酮作为溶剂 三乙胺作为催化剂 分别考察了反应温度 反应物配比 溶剂用 量 催化剂用量等条件 对于反应进行优化 优化工艺条件后肛生育酚的转化率 为5 9 6 2 孙登文等 2 川研究了 生育酚琥珀酸酯的合成工艺 反应体系以乙酸作溶剂 无水乙酸钾作催化剂 体系中加入锌粉与乙酸一起形成还原环境以避免舡生育酚 的氧化损失 考察了溶剂 催化剂 琥珀酸酐用量 锌粉用量等条件对于反应的 影响 最后得到优化条件 反应0 l 生育酚酯化率为9 1 7 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 1 2 3n 生育酚琥珀酸酯的分离纯化工艺 分离纯化对于m 生育酚琥珀酸酯合成的工艺十分重要 通过分离纯化 将 合成粗品的含量提高 减少了一定量的杂质 使得在最终结晶纯化阶段 杂质对 于产品结晶的影响尽量小 可以提高产品的含量 避免共析造成杂质对于产品的 污染 同时也会在 定程度上减少母液中产品的残留量 交献中对于产品分离纯化的研究相对合成较少 j a m e sg b a x t e r 等在粗品合成之后 采用层析吸附的方法对其进行纯化 在 氮气压力下 将粗品通过一个特殊的吸附相 然后用醚类溶剂将其洗脱 得到黑 褐色的油状产品 其收率在6 2 左右 1 4 j o hd c a w l e y t l 0 1 将粗品溶解在石油醚中 用薄层色谱除去杂质 用乙醚洗 提 回收乙醚 得到小生育酚琥珀酸酯 再用石油醚结晶精制 得尖状结晶产物 他们所采取的是薄层色谱除去杂质 这在实验室小批量反应处理可行 但在大规 模生产中明显无法适合生产需要 不具有工业化的意义和优势 a n t o n ys t e p h e nh o w s h i p 等在酯化合成粗品 后处理后 直接进行结晶 在 实验室中通过多次结晶 冰石油醚洗涤可以得到含量较高的纯品 1 8 l 但母液中残 留较多 在具体工业生产中 必定会造成很大的浪费 工业化生产单单通过结晶 是不可行的 t e t s u y a 等人 n j 在得到合成粗品之后 进一步用氧化铝作为固定相对于产品 层析精制 得到了纯度9 9 5 的精品 李卫红 2 1 1 等提及在合成黄色油状粗品后采用硅胶柱作为固定相对粗品进行 了分离纯化 伍林等 2 2 1 采用静置离心的方法对于a 生育酚琥珀酸酯粗品进行提纯 他们 首先将反应液在3 c 下冷却静置1 0h 左右 琥珀酸酐沉淀析出 产品回收率8 2 6 其次在o 0 8m p a 下减压蒸馏出三乙胺和丙酮 蒸馏余液用正己烷溶解 溶 液很快沉淀分层 经离心过滤 洗 涤得到m 生育酚琥珀酸酯 回收率为8 2 纯度为9 3 辛嘉英等 2 3 1 采用了生物酶的方法对于a 生育酚琥珀酸酯粗品进行提纯 生物 催化反应条件温和 反应速度快 副产物少 它对底物结构有严格的选择性 它 能做有机化学方法难以完成的高选择性反应 他们利用脂肪酶对于不同类型a 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 生育酚琥珀酸酯具有底物选择性的特点 将b 生育酚琥珀酸酯和 t q 育酚琥珀酸 酯水解 采用硅胶柱进行分离 以乙酸乙酯 石油醚 1 1 0 v v 为洗脱剂洗脱 掉水解产生的p 一生育酚和t 一生育酚 然后再用乙酸乙酯 冰醋酸 1 0 0 1 v v 洗 脱a 一生育酚琥珀酸酯 旋转蒸发后得到淡黄色油状液体 在石油醚中重结晶 得 到白色针状结晶 1 2 4 伽生育酚琥珀酸酯的用途 1 2 4 1 在保健品中的用途 在健康食品中使用小生育酚琥珀酸酯有诸多优点 l 1 单位重量产品的生物活性高 市场上弘生育酚水分散性于粉是通过微囊化 喷雾干燥得到 受包油率限制 最高含量一般达到5 0 会占用较大片荆和胶囊 体积 固体类天然a 生育酚琥珀酸酯可以减小片剂或者胶囊的体积 2 熔点高 可耐受任何条件的压制和造粒 a 生育酚琥珀酸酯的熔点为7 3 7 8 完全可以满足片剂和硬质胶囊的加工 工艺要求 a 生育酚琥珀酸酯可以直接或与其他固体成分混合 用于压片或套胶 囊 非常方便 而干粉类产品压片或剧烈混合时 有可能造成囊材破裂 漏油 3 稳定性好 不易吸潮 不易染菌 由于 生育酚6 位活性基团 羟基 被琥珀酸保护起来 所以稳定性非常好 不会被空气中的氧气氧化 另外 a 生育酚琥珀酸酯为脂溶性 不易吸潮和染菌 而干粉类产品由于外层为淀粉等囊材 特别容易吸潮和染菌 在包装 运输和生 产过程中会造成较大麻烦 比如包装袋稍有漏气 干粉类产品就会吸潮成团 而 固体类产品却无此后顾之忧 4 产品无味无臭 适合于制成各种品味的咀嚼片 在欧美和日本等发达国家 小生育酚琥珀酸酯在食品保健品中的应用十分普 遍 市场上以片剂和硬质胶囊形式出现的维生素e 营养剂基本上均为弘生育酚 琥珀酸酯 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 1 2 4 2 独特的抗癌作用 全世界各种死亡病因中 癌症位于第二位 仅次于心脏病 研究发现 小 生育酚琥珀酸酯在抗癌方面非常有效 具有独特的抗癌保健功能 舡生育酚其他 的酯化形式 如a 生育酚醋酸酯 小生育酚烟酸酯都没有类似的抗癌效果 自小生育酚被发现以来 关于其抗癌性能并未被很大研究或者提及 可能是 由于目前广泛使用的伽生育酚和小生育酚醋酸酯 溶于乙醇 在生物体内体外 实验中均未显示出很强的抗癌性能f 2 5 在1 9 8 2 年 科学家首次发现a 生育酚琥珀酸酯具有抗癌性能 在随后的几 年中 1 9 8 2 1 9 9 0 年 科学家做了许多的体外实验 这一性能被不断得到确认 2 从上世纪9 0 年代 k l i n e 课题小组做了一系列实验 发表文章阐明a 生 育酚琥珀酸酯的抗癌机理 3 1 州 2 0 0 0 年后 m a l a f a 3 5 3 6 1 n e r l z i l t 3 w e b e r r 3 8 1 等分 别在动物体内移植人类癌细胞 用d 一生育酚琥珀酸酯处理 得到成功 通过研究发现 低浓度含量的 生育酚琥珀酸酯可以诱导细胞变异 抑制癌 细胞增殖 高浓度含量的a 生育酚琥珀酸酯能够诱导细胞凋亡 研究发现 a 生育酚琥珀酸酯对于许多种类癌细胞均具有抑制增殖 诱导凋 亡的作用 其中包括人类黑色素瘤细胞 3 9 1 鼠类神经胶质瘤细胞 柚 人类前列 腺癌细胞 3 4 川1 人类腮腺上皮瘤细胞 4 2 1 乳腺癌细胞盼4 3 1 人类肺癌细胞 4 5 1 人类结肠癌细胞 4 5 1 人类胃癌细胞1 4 6 4 7 1 人类胰脏癌细胞1 4 8 人类子宫颈癌及 卵巢癌细胞 4 9 等 但洳生育酚琥珀酸酯并不会破坏正常细胞 对正常细胞的生 长无影响 因而非常安全 弘生育酚琥珀酸酯抑制肿瘤生长是通过阻断t g f 1 3 配体和f a s 感受器 化 学抑制t g f 1 3 配体活性等途径起作用 研究还发现 小生育酚琥珀酸酯可阻断前列腺定抗原p s a 的上升 p s a 是 前列腺癌发展的指标 还可抑制雄激素感受器的功能 降低导致前列腺癌的男 性荷尔蒙和遗传因子的活性 因而对防治前列腺癌特别有效 t u r l e y 和他的合作者更多研究表明a 生育酚琥珀酸酯对人类所有类型的肿 瘤中超过9 0 的恶性肿瘤有效 c t 生育酚琥珀酸酯的有效浓度是1 0 5 0m g l w e b e r 实验室作了这样的实验 将a 一生育酚琥珀酸酯溶于d m s o 中 以1 0 0 m g k g 体重比例注射入大鼠体内 每三天一次 共1 2 天一个周期 结果表明大鼠中结 1 4 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 肠癌细胞生长率降低8 0 而同期比较静生育酚的效果只有3 5 f 3 引 小生育酚琥珀酸酯与其他治疗癌症手段同时实施 也具有良好的抗癌辅助效 果 电离放射是目前通常所使用的一种癌症治疗手段 经报道 在采用x 射线或 者丫射线放射治疗同时 辅助以一定浓度的a 生育酚琥珀酸酯比单独使用x 射线 或者1 r 射线放射治疗更能抑制癌细胞的增长 同时一定浓度的a 生育酚琥珀酸酯 会加强放射对于癌细胞染色体突变的诱导 加速癌细胞死亡 并且保护正常的纤 维原细胞 降低放射对其的损害f 矧 过热疗法是一稀尚处于实验阶段的针对早期癌细胞的治疗方法 其一般治疗 温度在4 3 c 此温度虽然对癌细胞有杀伤作用 但对于正常细胞也有所损害 会对机体有一定不可预知的副作用 通过加入一定浓度a 一生育酚琥珀酸酯辅助治 疗 此温度可以从4 3 c 降低至4 1 而不影响对于杀伤癌细胞的治疗效果 5 1 a 生育酚琥珀酸酯同样对于一般抗癌的化学疗法有一定作用 例如 辅助以 舡生育酚琥珀酸酯 可以增强多柔比星 抗肿瘤药物 对于前列腺癌细胞的杀伤 能力 加入舢生育酚琥珀酸酯 他莫惜芬及氨烯咪胺 5 2 能更有效地杀死人类黑 色瘤细胞 a 一生育酚琥珀酸酯也对一些抗癌新药如紫杉醇 卡铂有一定辅助治疗 作用 5 3 1 1 3 分析方法 近几十年以来 生育酚的分析方法多种多样 文献报道的生育酚的分析方法 主要有 5 4 5 5 硫酸铈滴定法 铈量法 紫外线吸收光谱法 比色法 薄层层析 法 气相色谱法 高效液相色谱法等 其中广泛使用的方法有比色法 薄层层析 法 气相色谱法和高效液相色谱法等 见表1 3 1 5 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 对于a 生育酚琥珀酸酯 文献提到的分析方法基本上是气相色谱法 在本实验中主要采用薄层层析法及高效液相色谱法对小生育酚和舡生育酚 琥珀酸酯进行检测分析 1 3 1 薄层层析法 薄层层析法 又称t l c 法 这是一种固 液吸附色谱技术 它具有微量 1 6 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 快速 简便等特点 可以适用于小样样品的分离 也可以用来做样品的精制 这种方法适用的范围为 一 物质的挥发性较小 二 物质在高温下容易发生 变化无法采取如气相色谱等方法进行分析 在本文中采用薄层层析法主要用于作为在柱层析分离过程中 产品何时洗 脱以及洗脱是否完全情况的判定 通过点板可以实时了解层析分离情况 判定 层析分离终点的情况 这种方法简单快捷 不用通过高效液相色谱分析结果控 制层析条件 实验采用薄层层析的展开剂为正己烷与乙酸乙酯混合溶剂 其配比为v 正 己烷 v 乙酸乙酯 5 1 具体分离情况见图1 7 图1 7a 生育酚琥珀酸酯和a 一生育酚的t l c 分析 在此条件下 通过与小生育酚琥珀酸酯标样点进行比较 可以很快了解到柱 层析口一生育酚琥珀酸酯流出点及流出终点 1 3 2 高效液相色谱法 高效液相色谱 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c 是根据被 1 7 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 测定的各种物质与色谱柱中固定相之间有着不同的相互作用 从而达到分离的 目的 目前 高效液相色谱作为一种十分重要的检测手段 被广泛适用于有机 化学 生物化学 医药开发 化工 食品 环境监测分析之中 适用于分析高 沸点不易挥发 大分子量 极性不同的物质 使用时待测产品首先被注入色谱 柱 在一定的压力条件下在色谱柱固定相中移动 并且一定顺序地离开色谱柱 通过相应的检测器检测可以得到不同的峰信号 起到分离的目的 根据实验室现有仪器设备条件以及实验测定需要对于岱 生育酚和肛生育酚 琥珀酸酯主要采用的分析方法为高效液相色谱法 双波段检测 主要方法及分 析条件如下 5 6 1 h p l c 系统组成 高压泵 w a t e r s5 1 0h p l cp u m p 进样系统 w a t e r s7 1 7p l u s l q 动进样器 色谱柱 s u p e l c od i s c o v e r yc i s4 6 x 2 5 0m i l lc o l u m n 5 m c a t a l o gn o 5 0 4 9 7 1 检测器 w a t e r s2 4 8 7 可调波长紫外检测器 数据处理系统 b r e e z ev e r s i o n3 3 0 w a t e r sc o r p o r a t i o n 滚扭条件 柱温 流动相 流速 检测波长 标样 定量方法 进样量 3 0 甲醇 冰乙酸 5 0 0 3 2 v v 1 m l m i n 2 9 2n i n a 生育酚 及2 8 4n n l a 生育酚琥珀酸酯 a 生育酚琥珀酸酯标样 美国s i g m a 公司 含量9 9 垂生育酚标样 东京化成工业株式会社 含量9 8 外标法 1 0m 分析操作步骤 1 配置标准溶液 准确称取标准样品弘生育酚和a 生育酚琥珀酸酯 放入5 0 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 m l 容量瓶内 无水乙醇定容至刻度 从中取一定量的溶液 分别加入5 0m l 容 量瓶内 无水乙醇稀释至不同刻度 避光冷藏 2 配置待测溶液 准确称取待测样品 放入5 0m l 容量瓶内 无水乙醇稀释 至刻度 待测 3 设备准备 开启高效液相色谱装置 预热 配置流动相 取足量色谱纯甲 醇 以甲醇 冰乙酸 5 0 0 3 2 v 比例加入冰乙酸 超声脱气 设置h p l c 系统流动相流速 柱温 检测波长等 h p l c 系统稳定后 设置进样量 进样时 间等 进样分析 4 数据处理 根据i i p c 分析结果 以标准样品浓度为横坐标 峰面积为纵 坐标 得到一直线 拟和得到拟和的标准曲线方程 将待测产物的峰面积值代入 相应标准曲线方程内 得出相应产物浓度 待测产品含量为 c i c 待捌 5 0 m e d g 其中 c i 为产品含量 g g c 为代入标准曲线所得产品浓度 g m l m 为容量瓶中加入待测产品质量 g 具体色谱峰图如下 r a m 生育酚琥珀酸酯标准色谱图 1 9 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 皇 b o r 生育酚琥珀酸酯与小生育酚色谱图 图1 8典型色谱图 从图中可以看出a 生育酚琥珀酸酯保留时间为1 0 8 1 4r a i n 舡生育酚保留时 间为1 2 8 8 7m i n 两者可以达到良好的基线分离 1 4 课题研究意义及研究内容 本课题以高纯度d a 生育酚琥珀酸酯产品为目标 从天然洳生育酚出发 通过酯化合成小a 生育酚琥珀酸酯 采用柱层析法对其进行精制纯化 建立优化 的柱层析条件 通过有效的纯化工艺除去原料中的杂质 得到高纯度的小舡生育 酚琥珀酸酯产品 具体内容包括 1 采用高纯度天然a 生育酚与琥珀酸酐进行酯化反应 得到小a 生育酚琥珀 酸酯粗品 通过对于各种反应条件的选择 对合成工艺进行优化 2 采用硅胶作为层析固定相 对于合成粗品进行精制纯化 通过考察层析条 件得到优化 使得产品含量提高 3 采用吸附型树脂作为层析固定相 对于合成粗品进行精制纯化 考察层析 条件 优化层析工艺 同时对于树脂再生进行考察 使得树脂能够重复利用 4 通过溶剂 降温速率等条件的选择 对结晶工艺进行初步的研究 浙江大学硕士学位