（微生物学专业论文）果胶酶高产菌种的筛选及其酶学性质的研究.pdf

摘要 摘要 果胶酶是分解果胶质酶类的总称 通常包括聚半乳糖醛酸酶 p g 果胶酯酶 p e 果胶裂解酶 p l 等主要组分 果胶酶是一种重要的工业酶制剂 广泛应用于果汁 果酒 加工 蔬菜汁提取 酒精发酵 饲料 木材防腐 麻类脱胶 棉织物精练加工等领域 我 国果胶酶生产大多采用固体发酵法 因该方法比较粗放 产品质量与国外产品差距较大 果胶酶市场基本被国外产品垄断 目前国内对果胶酶发酵生产的研究大多局限于单一聚半 乳糖醛酸组分 而对发酵过程中同时考察三种果胶酶系 p g p e p l 的研究相对较少 本论文采用产果胶酶的优良菌种一黑曲霉s s 9 通过研究培养条件对该菌所产三种酶组分 的活力影响 获得最佳产酶培养基和条件 并通过对国外酶产品与自制酶的酶系组份活力 比对 尝试分析国外酶与国产酶应用效果差距的内在原因 从本实验室保存的产果胶酶的黑曲霉 根霉入手 设计了三种不同类型的筛选培养基 对其进行自然分离复壮筛选 筛选出产酶能力较强的菌株一黑曲霉s s 9 通过实验对比 发现溴甲酚蓝变色圈法是一种有效的分离筛选方法 并采用该筛选方法从自然界采集的1 0 份土样中 分离筛选出1 2 株产果胶酶菌株 验证了所设计的筛选方法是有效可行的 为果 胶酶菌种的分离提供了一种较可靠有效的筛选方法 在确定各种因素对产酶影响的基础上 对黑曲霉液体发酵产果胶酶进行条件的优化 得出了适合三种酶组分产生的综合培养基 桔皮粉3g n h 4 2s 0 42g 麸皮1 2g 尿素 0 0 7 5g c a c l 2o 0 3g k h 2p 0 43 8g k 2 h p 0 4 3 h 2 00 2g 乙二醇1 5m l 水1 0 0m l p h6 0 产酶最高可达p g3 2 8 2 万u m l p e3 1 8 6 2u m l p l0 7 1 6u m l 在实验过程 中 对产p l 进行特别的研究 对产p l 的培养基特别是复合氮源 进行了优化 得到产 p l 的适合培养基 桔皮粉4g n a n 0 30 4g 麸皮2 0g 尿素o 0 7 5g c a c l 20 0 3g m g s 0 4 0 0 5g k h 2p 0 43 8g k 2 h p 0 4 3 h 2 00 2g 乙二醇1 5m l 水1 0 0m l p h6 0 产酶 最高可达到1 2 6 7u m l 并测定了三种不同酶系的发酵曲线 通过对果胶酶各组分酶学特性的研究 了解果胶酶各组分的最适p h p g4 0 p e6 0 p l6 o 酶稳定的p h 范围 p g2 0 8 0 p e4 o 7 0 p l5 0 一8 0 最适温度 p g5 0 p e5 0 p l4 5 稳定的温度范围 p g 在5 5 以下 p e 和p l 在5 0 以下 开展了发酵粗酶液提高苹果出汁率的应用研究 通过优化 得到最佳的工艺参数为 p h3 5 温度4 0 果胶酶的用量为o 5 处理时间9 0m i n 苹果的出汁率达到最高 并对发酵粗酶液与国外品牌商品酶制剂的酶活力和出汁率进行分析比较 其主要差距是p l 的活力偏低 对应的出汁率也偏低 经分析 在苹果出汁方面 除了p g 的作用外 p l 也 有着重要的作用 为果胶酶的应用研究提供了参考依据 关键词 果胶酶 黑曲霉 筛选 液体发酵 性质 出汁率 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep e c t i n a s ei st h et o t a lc a l lo ft h et h i n g st 1 1 a tc a nb r e a ku pt h ep e c t i n i t sc a t e g o r y u s u a l l yc o n c l u d et h ep g p e a n dp l t r a d i t i o n a l l yt h ep e c t i n a s ei su s e dt ot h ep r o c e s s i n go ft h e s y r u pa n dt h er a t a f e e n o wt h ea p p l i c a t i o ne x t e n dt o t h ef i e l d si n c l u d i n gt h ee x t r a c to ft h e v e g e t a b l ej u i c e a n t i s e p s i so ft h ew o o d e t h a n o lf e r m e n t a t i o n f e e d s t u f f c o l l o i dr e m o v eo ft h e h e m p r e f i n i n ga n dp r o c e s s i n go ft h ec o t t o nw e a v e i no u r c o u n t r yt h es o l i df e r m e n t a t i o ni s c o m m o n b e a c a u s et h i sm e t h o di se x t e n s i v ea n di t sp r o d u c ti sh a r dt or e a c ht h er e q u e s to fs o m e i n d u s t r i e se s p e c i a l l yt h ef o o di n d u s t r y t h ep e c t i n a s ei sl i m i t e dg r e a t l yt oa p p l yi nt h ei n d u s t r y p r o d u c i n g n o wt h er e s e a r c h e si no u rc o u n t r yi sm o s ta b o u tt h es i g l ep e c t i n a s ea n dt h ec o m p l e x s t u d yo nt h ep g p ea n dp li nt h ep r o c e s so ft h ef e r m e n t a t i o ni sl e s s t h es t u d yi sb a s e do na e x c e l l e n c es t r a i n a s p e r i l l u sn i g e rs s 9a n dg e tt h eo p t i m u mc o n d i t i o no ft h ep e c t i n a s e p r o d u c i n gt h r o u g ht h ee n z y m ea c t i v i t ya n a l y s eo ft h et h r e ep e c t i n a s e w ec a nf i n dt h ed i s t a n c e b e t w e e no u r p r o d u c t i o na n dt h eo v e r s e a st h r o u g ht h ee n z y m ea c t i v i t yc o n t r a s t t h ee x p e r i m e n ti ss t a r t e dw i t ha s p e r i l l u sn i g e ra n dr h i z o p u ss t r a i n ss e l e c t i n gw h i c hi s c o n s e r v e di nt h el a b f o rt h ev a r i e t yo ft h es e l e c t i n gm e t h o d st h ee x p e r i m e n tc h o o s e dt h r e e d i f f e r e n tm e d i u m s a n dt h r o u g ht h ec o n t r a s tae f f e c t i v ep a t hh a sb e e nc o n c e m e d as t r a i nw h i c h h a st h eg r e a ta b i l i t yt ob r e a ku pt h ep e c t i nc o m et r u e o nt h es t u d yw ec a nc o n f i r mt h a tt h e3 t h s e l e c t i n gm e d i u mi su s e f u la n de f f e c t i v e t ol e a mt h el i v ec h a r a c t e ra n do f f e rt h er e f e r e n c et o t h en e x te x p e r i m e n t w em e a t u r et h es t r a i n sg r o w t hs p e e d w eh a v eg o tt w e l v es t r a i n sw h i c hh a s t h ea c t i v i t yf r o mt e ns o i ls w a t c h e s t h er e s u l ti st h ec o n f i r m a t i o no dt h es e l e c t i n gm e t h o dw e d e s i r e da n dt h i sw i l lb eae f f e c t i v ea n dd e p e n d a b l ew a yf o r t h ep e c t i n a s es t r a i ns e l e c t i n g t h r o u g has e r i e so fr e s e a r c h ss o m ef a c t o r sw h i c hc a l li n f l u e n c et h ep e c t i n a s ep r o d u c t i o n h a v eb e e nr e s e a r c h e da n dc o m f i r m e d w em a d et h ec u l t r u eo p t i m i z e da n dt h er e s u l ts t u d y i n gi s i n d i c a t e d i ni n i t i a lp h 5 7 t e m p e r a t u r e2 8 一3 0 c t h eb e s ts o n s t i t u eo f t h ec u l t u r ei sc i t r u sp e e l p o w d e r3g b r a n1 2g u r e a0 0 7 5g n h 4 2 s 0 4 2g c a c l 20 0 3g k h 2 p 0 43 8 g k 2 h p 0 4 3 h 2 00 2g g l y c o l15m l h 2 010 0m l p h6 0 o u t p u ti s p g3 2 8 2 0 0 0 0u m l p e 318 6 2u m l p l0 716u m l i nt h ep r o c e s sw es t u d yt h ec u l t u r eo p t i m i z a t i o no ft h ep l e s p e c i a l l y b a s e do nt h ec o m p l e xn i t r o g e nr e s e a r c h sw em a d et h ec u l t u r et h a tc a np r o d u c ep l c o n f o r m a b l y c i t r u sp e e lp o w d e r4 9 b r a n2 0g u r e a0 0 7 5g n a n 0 30 4g c a c l 2o 0 3g m g s 0 4 0 0 5g k h 2 p 0 43 8g k 2 h p 0 4 3 h 2 00 2g g l y c o l1 5m l h e o1 0 0m l p h6 0 t h ep l c a nr e a c h1 2 6 7u m l a n dw e m a d et h ef e r m e n tc u r v eo ft h et h r e ee n z y m e s t h r o u g ht h er e s e a r c ho nt h ec h a r a c t e ro ft h ed i f f e r e n tp e c t i n a s e w el e a r n e dt h a tt h e o p t i m a lp h p g4 0 p e6 0 p l6 o t h ep hs t a b i l i t yo f t h et h r e ep e c t i n a s e p g2 0 8 0 p e 4 o 7 0 p l5 0 8 0 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e p g5 0 c p e5 0 c p l4 5 c t h et e m p e r a t u r e i i a b s t r a c t s t a b i l i t yo f p e c t i n a s e p gb e l o w5 5 p ea n dp lb e l o w5 0 t h ep e c t i n a s el i g u i do ft h ef e r m e n t a t i o ni sa p p l i e dt ot h er e s e a r c ht h a ti m p r o v et h er a t eo f t h ea p p l ej u i c el i x i v i a t e d t h r o u g has e r i e so ft h eo p t i m i z a t i o naf i tc o n d i t i o nf o rt h ee x p e r i m e n t i st h a t t h ei n i t i a lp hi s 3 5 t h et e m p e r a t u r ei s4 0 c t h eq u a n t i t yo ft h ep e c t i n a s eu s e di s 0 5 p e r c e n t t h et i m eo ft h er e a c t i o ni sn i n t ym i n u t e s t h er a t eo ft h ej u i c el i x i v i a t e di st h eh i g h e s t w e c a nf i n dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h ep e c t i n a s ew ep r o d u c e da n dt h ee n z y m ep r o d u c to v e r s e a s t h r o u g ht h ec o n t r a s to ft h ec o m p o n e n ta n a l y s e d t h r o u g ht h er e s e a r c hw ec a nd i s c o v e rt h a tt h e a c t i v i t yo fo u rp r o d u c t i o ni sl o w e ra n dt h ej u i c er a t ei sa l s ol o w e r t h er e s u l ti sn o to n l yt h ep g b u ta l s ot h ep li si m p o r t a n tt ot h ea p p l e ju i c e t h ef a c t o r si n f l u e n c et h ej u i c el i x i v i a t e dc a na l s o b ea n a l y s e da n dt h i sr e s e a r c hw i l lb eu s e f u lf o rt h en e x ts t u d y k e yw o r d s p e c t i n a s e a s p e r i l l u sn i g e r s e l e c t i n g l i q u i d f e r m e n t a t i o n p r o p e r t i e s j u i c e l i x i v i a t e dr a t e i i i 独创 生声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名 张海农 日 期 二d 弼 王3 j 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留 使用学位论文的规定 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允 许论文被查阅和借阅 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名 导师签名 日 期 2 d 田 3 3 1 第一章绪论 1 1 概述 1 1 2 果胶质 第一章绪论 果胶质是广泛存在于高等植物组织 尤其是水果和蔬菜组织的细胞间质和细胞初生壁 中的结构多糖类 在胞间层则基本上由果胶质组成 果胶质在植物的细胞组织中起着 粘 合 的作用 并作为一种支撑层 在维持果蔬的组织上起重要的作用 在细胞璧中果胶质 和纤维素及金属离子相结合形成不溶于水的原果胶质 在果实或蔬菜成熟过程中可转变为 可溶性果胶质 一旦植物组织中的果胶质分解便引起细胞的离散 直至腐坏 果蔬类在成 熟和收获后的储存过程中 组织上的变化多为本身所含的果胶酶分解果胶所造成 因此在 果蔬类产品的加工工艺中 必须对这类果胶酶和微生物产生的果胶酶给予重视 迄今 关 于果胶酶己有大量的评述 郑寿亭 高培基等对果胶酶在果汁加工中的应用 从制汁到果 汁澄清具体应用工艺及效果均进行了较全面的评述 3 果胶质的基本组成为d 半乳糖醛酸以0 1 4 糖苷键连接而成的直链状聚合物 其中d 半乳糖醛酸上的羧基可为甲醇所酯化形成甲酯 或为一种或几种碱部分或全部中和 对果 胶质结构化学的研究结果表明 果胶质中还含有其他的糖类 即除0 1 4 聚半乳糖醛酸外 还含有高度分支的l 5 可拉伯糖和d 1 4 半乳聚糖 鼠李糖也可插入半乳糖醛酸主链 再与 阿拉伯糖 葡聚糖或阿拉伯糖葡聚糖连接 果胶质分为 1 原果胶 p r o t o p e c t i n 果实成熟时可转变为可溶性果胶 2 果胶酸 p e c t i ca c i d 脱水半乳糖醛酸单位上的羧基基本上是游离的 3 果胶酯酸 p e c t i n i ca c i d 或低甲酯含量果胶 分子中甲酯基团含量低 4 果胶 p e c t i n 果胶属果胶酯酸 分子中 约7 5 基是甲酯化的 它的溶液中加适量的糖和酸时形成凝胶 果胶按其分子中d 半乳糖 醛酸上羧基的酯化程度不同又分为高甲氧基果胶 酯化度大于5 0 和低甲氧基果胶 酯 化度低于5 0 果胶的分子结构如图1 1 所示 果胶溶于水形成粘稠状液体 其粘度和溶解度一方面与其聚合和酯化程度有关 另一 方面也与悬浮介质中的电解质种类和浓度有关 在酸糖环境中由于果胶分子链的缔合作用 促成了三维网状结构的形成 进而形成凝胶 高甲氧基果胶的凝胶形成可以用 酸 糖成胶 机制 来解释 环境中的酸可避免过多游离的羧基 这样可减少分子中阴离子之间的相互 排斥力 而高浓度的糖使系统中水活度降低 果胶分子借脱水效果更容易结合 低甲氧基 果胶在酸糖存在下也形成凝胶 但因甲氧基含量低 需要与二价阳离子结合 特别是c a 2 在相对低的可溶性固形物和一定的p h 范围内存在多价阳离子如c a 2 即能形成凝胶 目前果胶质主要采用果皮渣或甜菜渣等作为主要原料回收 在这些材料当中的果胶含 量相对较高 可达1 0 以上 一般的果蔬中总含量则在1 左右 江南大学硕士学位论文 辑 图1 1 果胶的分子结构 x 代表h 或o h t s l f i g u r el 一1m o l e c u l es t r u c t u r eo fp e c t i n xm e a n sho ro h l 1 1 3 果胶酶的分类及作用机理 果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称 该酶主要由植物和微生物合成 在自然界中对 果实成熟 叶片的腐坏 植物残体的降解和植物的致病性方面起重要作用 由于果胶分子 结构的复杂性 通过植物对果胶改性或通过微生物完全降解果胶需要很多不同的酶 a l k o r t a 认为果胶酶分类的标准有四点 1 果胶 果胶酸或低聚半乳糖醛酸是否为其 优先底物 2 酶的作用方式是反式消去作用还是水解作用 3 切割方式是任意的 内 切酶 还是发生在末端方向的 外切酶 4 作用适宜p h 酸性或碱性果胶酶 以果胶为底物的酶可分为两大类 即去酯化酶类 果胶酯酶 p e c t i n e s t e r a s e s 和解聚 酶类 d e p o l y m e r a s e s 果胶酯酶 p e c t i n e s t e r a s e 简称p e 是羧酸酯水解酶 系统分类名 为p e c t i np e c t y l h y d r o l a s e e c 3 1 1 1 l 随机切除甲酯化果胶中的甲基 产生甲醇和游离羧 基 如图1 2 所示 该酶对果胶的去酯化过程是沿底物分子线性进行的 这被称作单链机 制 s i n g l e c h a i nm e c h a n i s m 通常酶的去酯化不能完全 当酯化度大于1 0 这一过程即停 止 p e p e c t i n e s t e r a s e 对于果胶溶液的粘度几乎没有影响 去酯化的果胶通过钙桥发生 相互作用 为聚半乳糖醛酸酶 p g 果胶裂解酶 p l 等其它果胶酶的作用创造条件 聚半乳糖醛酸和甲醇对a s p e r g i l l u sn i g e r 的p e 分别有竞争性抑制和非竞争性抑制 单宁酸 对p e 有抑制作用 6 蠢 图1 2 果胶酯酶的作用方式 8 1 f i g u r e1 2t h er e a c t i o nm o d eo fp e c t i n e s t e r a s e 2 第一章绪论 果胶解聚酶类 如表1 1 所示 通过水解作用 水解酶类h y d r o l a s e s 或p 一消去作用 裂 解酶类l y a s e s 分解果胶 表l 一1 果胶解聚酶类的分类 t a b l e1 1c l a s s i f i c a t i o no f p e c t a t ea n dp e c t i nd e p o l y m e r a s e 87 竺嗍 ht c 硝 酶 芝尊 麓鞘曩冀辅节 0 1 1 0 1 1 t 阳一 叼了 函 江南大学硕士学位论文 体 外切型果胶酸裂解酶 e x o p e c t a t el y a s e p o l y 1 4 g a l a c t u r o n i d e e x o l y a s e e c 4 2 2 9 简 称e x o p a l 切割果胶的还原末端生成不饱和二聚体 果胶裂解酶 p e c t i n l y a s e p o l y m e t h o x y g a l a c t u r o n i d e l y a s e e c 4 2 2 1 0 简称p l 是唯一专性作用于高 酯化果胶的解聚酶类 它以随机方式作用于果胶 产生不饱和寡聚半乳糖醛酸甲酯 1 1 4 果胶酶的应用 t o i i l 0 h 罐 口 秘 书辅 冀蚕 图1 4 聚半乳糖醛酸裂解酶的作用方式 8 f i g u r e1 4t h er e a c t i o nm o d eo fp o l y g a l a c t u r o n a s el y a s e 果胶酶主要应用于食品工业特别是果汁果酒的加工业 如表1 2 所示 近年来也不断 开拓了新的用途 我国学者对果胶酶的应用开展了较广泛而深入的研究 一 果汁果酒澄清 果胶酶可以降低果汁粘度 使果汁易于被处理而透明澄清 用于果酒处理 可避免失 光和出现混浊 从而保持果酒的稳定性 果胶酶还可保持果粒的完整性 据n o v on o r d i s k 公司报道 该公司生产的注册商标为n o v os h a p e 的p e 产品可以使果粒在加工中受到的组 织结构损失减到最小 保持果粒原有形状和硬度 增加成品的果粒数量 果胶裂解酶对苹 果汁有较好的澄清作用 但对葡萄汁效果不明显 对于柑橘汁 因要求雾样混浊 应当使 用不含果胶酯酶的聚半乳糖醛酸内切酶 e n d o p g 进行处理 由于果胶裂解酶可避免甲 醇的产生 也可避免部分脱酯的果胶同钙离子形成沉淀 还可避免构成各种水果芳香性成 分的酯类物质的损失 所以有研究表明果胶酶制剂若用于果蔬汁和果酒加工 最好含有较 多量果胶裂解酶 二 果蔬汁提取 果胶酶制剂有助于提高水果在压榨过程中的出汁率 有些水果在榨汁过程中 破碎后 浓稠枯滑 若不加果胶酶处理难以压榨出大量果汁 经果胶酶处理后 水果破碎的自流汁 和总出汁率均有所增加 n o v on o r d i s k 公司1 9 9 9 年度推出的果胶酶复合酶制剂 p e c t i n e x u l t r as p l 除含有果胶酶的主要组分外 还具有蛋白酶 纤维素酶和半纤维素酶活 用于萝卜 香蕉的处理 可使汁液得率分别提高2 0 和8 0 4 第一章绪论 表1 2 果蔬加工中的果胶酶 t a b l el 2p e c t i ce n z y m e si nf r u i ta n dv e g e t a b l ep r o c e s s i n g 三 水果和蔬菜的浸解 液化 生产单细胞果汁和菜汁 所谓单细胞果汁和菜汁是指果蔬细胞间质发生降解但细胞仍保持完整 果胶酶可专性 作用于果蔬细胞间质 导致组织结构松散而液化 国外用于生产儿童食品的专用酶制剂 软 化酶 m a c e r a s e s 兼有果胶酶活 纤维素酶活和半纤维素酶活 四 果实脱皮 含有纤维素酶和半纤维素酶的粗果胶酶制剂能作用于果实皮层 使细胞分解而脱落 橘子囊衣 莲子内皮和大蒜膜层经果胶酶处理后可以很快脱落 据报道a s p e r g i l l u sn i g e r 产生的e n d o p g 具很强的脱橘子囊衣作用 五 木材防腐 刚砍伐的木材经常对防腐剂如杂酚油或铜 铬 硼的处理有抗性 经果胶酶制剂或产果 胶酶细菌处理 木材的通透性增加 从而加强了防腐剂的使用效果 六 麻类脱胶 麻类植物中含有纤维素 果胶半纤维素 木质素等 其中非纤维部分称为胶 占麻类 成分的2 0 3 0 纺织时须去除 化学脱胶法操作条件艰苦 且产生大量废水 我国土法脱 胶就是将麻浸入池塘或河沟 利用存在于麻类植物本身或浸泡水中的细菌等微生物产生的 果胶酶分解果胶质 细菌脱胶的主体果胶酶是聚半乳糖醛酸裂解酶 p g l 七 棉织物精练加工 t s a k a i 4 1 等人发现碱性果胶酶可使原果胶水解成为可溶于水的高聚合度的果胶分子 从而开发了一种针对棉织物精练的生物化学工艺 并称之为生物精练 b i o s c o u r i n g 1 9 9 9 江南大学硕士学位论文 年 n o v on o r d i s k 公司将碱性果胶酶产酶基因克隆至芽抱杆菌中 经发酵生产 推出品牌 为 b i o p r e p 碱性果胶酶 该酶在p h7 9 温度5 0 6 0 的条件下使用 能有效改善 棉织物后续处理工艺 我国从二十世纪九十年代初开始也对碱性果胶酶进行了研究 2 0 0 1 年国家 8 6 3 高技术发展计刻中设定了 利用生物技术实现纺织产品的高档化和生产的 清洁化 项目 八 酒精发酵 甘薯等是酒精生产中重要原料之一 甘薯中胶体 果胶质等粘性物质较多 高浓度发 酵时醪液的粘度很大 给酒精的浓醪发酵带来困难 蒸煮或在果胶酶的作用下 果胶质分 解成果胶酸和甲醇 降低了醪液粘度 增强糖化酶的活力 九 固定化果胶酶的应用 t y a g i 和g u p t a 5 将a s p e r g i l l u sn i g e r 果胶酶p g 商业制剂p e c t i n e x3 x l 固定于磁性乳胶 珠 偶联效率为8 1 固定化对酶最适p h 没有影响 游离和固定化酶均为p h 4 5 对 k m 影响也不大 游离和固定化酶分别为0 7 m l 和1 o m l 固定化酶可在6 0 保持至少3 小时 s z a n i a w s k i a n d r z e j 和s p e n c e r g a r t h 6 j 报道了大孔钛膜固定化果胶酶超滤果胶溶 液试验 在果胶浓度在0 4 2 6 范围内 通透流速在o 8 2 6m s 范围时 这种大约固 定了5g m 2 果胶酶的钛膜的透过性比没有固定化果胶酶的膜要高得多 果胶浓度和通透流 速对渗透性有影响 当果胶浓度降低而通透流速升高时 渗透性提高 1 1 5 果胶酶产生茵 果胶酶的工业化生产均采用微生物发酵方法进行 许多霉菌都可产生果胶酶 主要的 有a s p e r g i l l u s p e n i c i l l i u m r h i z o p u s f u s a r i u m g e o t r i c b u m 等属中的一些种 一些细菌和酵 母也能产生果胶酶 如e r w i n i a p s e u d o m o n a s b a c i l l u s c l o s t r i d u m x a n t o m o n a s 等属 其中 e r w i n i ac a r o t o v o r a 常被用于果胶酶类的分子生物学研究 酵母有t r i c h o s p o r m k l u y v e m m y c e s a c c h a r o m y c e s a u r e o b a s i d i u m 等属可产生果胶酶 r e d d y 概括了曲霉属中产果胶酶的一些菌种 主要有a s p e r g i l l u sf l a v i p e s a s p e r g i l l u s f u m i g a n t s a s p e r g i l l u ss y d o w i i a s p e r g i l l u sn i d u l a n s a s p e r g i l l u sn i g e r a s p e r g i l l u sn i c e u s a s p e r g i l l u ss y d o w i i a s p e r g i l l u st e r r e u s a s p e r g i l l u su s t u s 和a s p e r g i l l u sv e r s i c o l o 等 r o n a l d 7 j 等概括了曲霉属真菌所产果胶酶的一些重要性质 如表1 6 所示 黑曲霉 彳 n i g e r 是国际公认的安全菌株 g r a s g e n e r a l l yr e g a r d e d a ss a f e 也是美国 f d a 认 可的使用安全的产酶微生物之一 作为食品用产果胶酶微生物 一方面黑曲霉 a n i g e r 的代谢物可直接用于食品工业 另一方面黑曲霉 彳 n i g e r 产生的果胶酶酶系全 产生p g p e p l 等 所以研究的最多 表1 7 概括了黑曲霉 彳 n i g e r 生产的食品级酶制剂中三 大类果胶降解酶的酶学性质参数 6 第一章绪论 表1 3 常用产果胶酶菌种 t a b l e1 3 u s u a l l yu s e dm i c r o o r g a n i s mp r o d u c i n gp e c t i n a s e 微生物产果胶酶菌属 霉菌 细菌 酵母 a s p e r g i l l u s p e n i c i l l i u m r h i z o p u s f u s a r i u m g e o t r i c h u m e r w i n i a p s e u d o m o n a s b a c i l l u s c l o s t r i d i u m a a n t o m o n a s t r i c h o s p o r m k l u y v e r o m y c e s s a c c h a r o m y c e s a u r e o b a s i d i u m 表1 4 曲霉类真菌果胶酯酶的物理性质 8 1 t a b l e1 4 p h y s i c a lp r o p e r t i e so fa s p e r g i l l u sp e c t i n e s t e r a s e 表1 5 曲霉属真菌所产果胶裂解酶类的物理性质 8 1 t a b l e1 5 p h y s i c a lp r o p e r t i e sd f a s p e r g i l l u sl y a s e 7 a s p e r g i l l u sc a r b o n a r i u s a s p e r g i l l u sc a r b o n a r i u s a s p e r g i l l u sc a r b o n a r i u s a s p e r g i l l u sm g e r a s p e r g i l l u sm g e r a s p e r g i l l u sm g e r a s p e r g i l l u sr o g e r a s p e r g i l l u sm g e r a s p e r g i l l u sm g e r a s p e r g i l l u sm g e r a s p e r g i l l u sn i g e r a s p e r g i l l u sm g e r a s p e r g i l l u sm g e r a s p e r g i l l u so r y z a e a s p e r g i l l u so r y z a e a s p e r g i l l u so r y z a e e x o p o l y g a l a c t u r o n a s e s a s p e r g i l i u sa c u l e a t u s a s p e r g i l l u sa l l i a c e u s a s p e r g i l l u sa l l i a c e u s a s p e r g i l l u sn i g e r a s p e r g i l l u sn i g e r a s p e r g i l l u sn i g e r r h a m n o g a l a c t u r o n a n h y d r o l a s e s a s p e r g i l l u sa c u l e a t u s a s p e r g i l l u sa c u l e a t u s a s p e r g i l l u sa c u l e a t u s p g i p g i i p g i i i e l e 2 e n d o i e n d o i i e n d o i l i a e n d o i i i b e n d o p g a p g b p g d p g i p g a p g b e x o p g l e x o p g 2 e x o p gi e x o p gi i e x o i p h g a r g a s e a r g r h 6 1 4 2 4 7 3 5 8 0 5 5 3 8 5 7 5 7 5 9 3 5 3 5 5 1 4 1 3 9 4 2 4 0 4 0 6 6 6 3 5 1 5 9 8 4 3 5 6 0 3 8 4 5 4 o 3 4 3 5 4 4 5 5 0 3 0 3 5 6 0 6 0 3 2 3 5 4 6 5 9 3 3 3 3 3 7 3 4 3 6 1 9 4 1 4 3 5 7 6 3 5 6 5 8 4 0 5 0 3 0 5 0 4 5 6 0 4 9 5 4 a s p e r g i l l u sa c u l e a t u s r g g h 6 64 5 05 12 袁1 7 黑曲霉生产的食品级酶制剂三大类果胶降解酶的酶学性质拳数p t a b l e1 7 e n z y n i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fp e c t i n a s ef r o ma n i g e r 酶类型分子量 等电点最适p h 比活力米氏 帝数 u m g p e3 90 0 0 9 454 0 6 3 p g 4 2 0 0 0 4 9 0 0 0 6 0 6 44 0 2 7 5 p l3 5 4 0 0 0 3 3 1 0 0 0 3 6 5 3 7 56 0 6 0 1 7 4 4 5 0 0 9 8 一一 5 o 5 沁b 淄 父熨熨 6 4 5 0 1 3 8 9 8 3 5 名d d 2 d d 国似 乱引 训牝屯今乱孓禾乱曼支 第一章绪论 八十年代以来我国学者对果胶酶菌种选育进行了广泛的研究 有关报道集中在曲霉 属 较早报道有杨天波 l 引 等以碳黑曲霉 a s p e r g i l l u sc a r b o n a r i u s a s p 3 3 9 6 为出发菌株 对孢子悬液进行紫外线和高能电子辐射复合处理 获得产酶能力提高的白色孢子突变株 崔福绵 l3 j 等以o 0 3 亚硝基胍处理黑曲霉 彳 n i g e r c p 一8 3 1 获得高产果胶酶突变株 c p 8 5 2 11 此菌株在无锡酶制剂厂通过了中试 作为生产菌株进行批量生产 张玉樨 1 4 j 用 紫外线和c o 跚 y 射线诱变黑曲霉 a n i g e r 得到的突变株果胶酶活力达到1 4 9 0u g 干曲 许坤一 l5 j 等也用相同的方法对p e n i c i l l i u mc r u s t o s u m 诱变得到突变株 李强军 l6 j 等采用 e m s 和c 0 6 0 一y 射线对黑曲霉 4 n i g e r 进行了诱变和筛选 刘自溶 l7 等诱变得到一高产 菌株后 又对其进行了五吨罐试验和工厂化生产 张应玖 18 等也报道了黑曲霉 么 n i g e r a s 3 8 8 3 的亚硝基胍诱变 获得j b 5 1 3 变异株 产酶能力提高近一倍 刘海森 l 刎等报道了 碳黑曲霉口 c a r b o n a r i u s a s p 3 3 9 6 经亚硝基胍和c 0 6 0 y 射线获得果胶酶高产突变株 g 5 5 1 2 韩北忠 2 0 1 报道黑曲霉 a n i g e r 经紫外线和亚硝酸诱变 获得2 株果胶酶高产突 变株 朱宝成 2 l 等报道采用原生质体诱变方法更加简洁有效 将制备的碳黑曲霉 4 c a r b o n a r i u s a s p 3 3 9 6 原生质体装于安培管 以5 1 0 4r a d 高能电子辐射 从再生 菌株中获得果胶酶酶活提高一倍的变异株 陈哲超 2 2 2 3 等人报道了黑曲霉 么 n i g e r a s 6 1 0 4 经半导体激光辐照获得b l 菌株 固体发酵酶活可达2 8 0 0 0u g 干曲 张宁欣 2 4 j 等从土 壤分离到具有较强果胶酶分解能力的野生菌株n 3 2 8 鉴定为宇佐美曲霉翻 u s a m i i 经 紫外线 c 0 6 0 y 射线和d e s 连续诱变获得酶活力为出发株1 0 倍且性能稳定的突变株 陈 峰 赵学慧 2 5 2 6 连续报道了米曲霉 彳 o r y z a e c 4 9 1 液体发酵和固体发酵法生产果胶酶的 研究 近年来我国对果胶酶菌株选育的工作扩大到了其它微生物种类上 王传槐 2 7 1 报道了碱 性果胶酶产生菌e r w i n i ac h r y s a n t h e m i2 0 1 的筛选和诱变工作 该菌株可使红麻快速脱胶 曹军卫 2 8 1 等分离到一株产碱性果胶酶的嗜碱性细菌菌株 可用于麻类的浸解 后经诱变得 到抗利福平的突变株 吴琼和刘自溶 2 圳从埋麻土壤中分离到产果胶酶放线菌 并研究了其 产酶条件 项吲3 0 等研究了禾黑芽枝霉产果胶酶的摇床产酶条件 在此基础上研究了该菌 株深层发酵产酶的发酵动态 郭爱莲 3 l j 等从污物中分离出一株产果胶酶的兼性厌氧芽孢杆 菌x g 1 并对其诱变筛选而得到果胶酶活力提高了3 4 倍的突变株x g 0 2 1 1 6 发酵方式对微生物产果胶酶的影响 酶制剂的工业化生产主要有两种方法 即固体发酵法 s o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n s s f 和 液体深层发酵法 s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n s m f 因为易于控制 液体深层发酵法被广泛 地应用于各种酶制剂的生产 但在我国果胶酶的生产仍大量使用