（茶学专业论文）早生优质和特异性状茶树品种资源筛选及RAPD分子标记分析.pdf

中文摘要 名优茶和功能成分开发在现代茶产业中经济效益越来越明显 生产实践证 明 上市期和品质是决定名优茶经济效益的主要因素 同时从茶叶中提取的功能 性成分也正越来越广泛应用于食品和医药领域 发芽期和品质成分含量主要是由 茶树遗传学特性决定的 因此 选育发芽早 茶多酚 儿茶素类和氨基酸含量高 或咖啡碱含量低的品种是近期茶叶育种的主要目标 在本研究中对1 2 份茶树种 质资源的发芽期和生化成分进行比较鉴定 应用r a p d 分析其遗传多样性 对品 种 株系 特异r a p d 分子标记进行d n a 序列检测 推断其功能 所得结果如下 1 对1 2 份种质资源的发芽期和生化成分进行比较鉴定 筛选出发芽早 并且茶多酚 氨基酸 咖啡碱含量较高的j p 一1 j p 一3 j 2 及j 3 作为进一步 开发研究早生 优质茶树品种的育种材料 j q j 2 和j p 一4 咖啡因含量较低 是培育低咖啡因品种的良好育种材料 s i 和s 2 是培育高儿茶素类品种的良好 材料 2 对1 2 份茶树种质资源进行r a p d 分析发现 它们可以分为3 组 日本引 进茶种有性后代4 个单株j p l 4 和 福鼎大白茶 乌牛早 和 浙农1 3 9 遗传距离接近 从 鸠坑种 后代分离的j 卜3 三个株系为独立一组 从浙江三 门当地群体茶树分离的s 一1 和s 2 两个单株为独立一组 3 对1 2 份来源不同和咖啡碱含量不同的茶树种质资源进行r a p d 分析 筛 选出品种 株系 唯一扩增的r a p d 位点1 6 个 这些位点可以作为品种 株系 鉴定的特异分子标记 对 4 3 0 4 序列进行测序 该序列为7 5 2 b p 的核苷酸序列 具有编码4 0 个氨基酸的开放阅读框 其相同氨基酸残基与b 一半乳糖苷酶的同 源性为7 2 关键词 茶树 株系 萌发期 化学成分 r a p d 特异分子标记 测序 i i i e n g l i s hs u m m a r y p r o d u c t i o no fc h i n e s ef a m o u st e a sa n dd e v e l o p m e n to ff u n c t i o n a lc o m p o n e n t s s e p a r a t e df r o mt e ap l a ym o r ea n dm o r ei m p o r t a n tr o l ei nt e ai n d u s t r y p r o d u c t i o n p r a c t i c es h o w e dt h a tt h ef a m o u st e a sp r o d u c t i o nd e p e n d e do nt w ok e yf a c t o r s i e t e a c u l t i v a r sa n dt h ep r o d u c t i o ns t a g ei nt h es p r i n g f t m c t i o n a lc o m p o n e n t se x t r a c t e d f r o mt e aa r en o ww i l yu s e di nm e d i c i n e sa n df u n c t i o n a lf o o dp r o d u c t i o n sa n dt h e i r d e m a n da r ei n c r e a s i n g t ki m p o r t a n tt a r g e t so ft e ab r e e d i n ga r en o wt ob r e e d c u l t i v a r sw i t hc h a r a c t e r i s t i c so fe a r l ys p r o u t i n g h i g hq u a l i t ya n dc o n t a i n i n gh i g h c o n c e n t r a t i o no ft e ap o l y p h e n o l so rc a t e c h i n sa n dl o w e rc o n c e n t r a t i o no fc a f f e i n e i n t h ep r e s e n ts t u d y c h e m i c a lc o m p o s i t i o no ft w e l v et e al i n e sw e r ec o m p a r e da n d i d e n t i f i e d g e n e t i cd i v e r s i t yw e r et e s t e dw i 也r a p dm e t h o da n dd n am o l e c u l a r m a r k e r sl i n k e dt oe c o n o m i ct r a i t so f t e ap l a n t sw e r ei n v e s t i l g a t e d 1 s p r o u t i n gs t a g e sa n dc h e m i c a lc o m p o s i t i o n so f1 2 t e ag e r m p l a s m sw e r e i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i n e sj p l j p 一3 j 2a n dj 3h a d c h a r a c t e r i s t i c so fe a r l ys p r o u t i n g h i g hc o n c e n t r a t i o n so ft e ap o l y p h e n o l s a m i n oa c i d s a n dc a f f e i n e w h i c hw e r es u i t a b l ef o rb r e e d i n gq u a l i t yg r e e nt e ac u l t i v a r s t h e1 i n e s j 1 j 一2a n d j p 一4h a dl o w e rc o n t e n to fc a f f e i n e w h i c hm i g h tb eg o o dg e r m p l a s m sf o r b r e e d i n gl o wc a f f e i n et e ac u l t i v a r s t h e1 i n e ss la n ds 一2h a dh i g hc o n c e n t r a t i o no f t e ac a t e c h j n sa n dw e r eg o o dm a t e r i a l sf o rb r e e d i n gc 1 t l t i v a r sw i t hh i 交c o n c e n t r a t i o n o f c a t e c h i n s f 2 t h ed i v e r s i t yo f1 2t e ag e r m p l a s m sw e r et e s t e dw i t hr a p da n di ts h o w e d t h a tt h e yc o u l db ec l a s s i f i e di n t o3g r o u p s t h e1 i n e s 脚j 4i n t r o d u c e df r o mj a p a n a n d f u d i n g d a b a i c h a w u n i u z a o a n d z h e n o n 9 1 3 9 h a dc l o s eg e n e t i cd i s t a n c ea n d w e r ec l a s s i f i e da sg r o u p1 t h eg r o u p2h a d3l i n e s i e 1 i n e sj p 1 j p 一2a n dj p 一3 t h e l i n e ss la n ds 一2i n t r o d u c e df r o ms a n m e nc o u n t yo fz h e j i a n gp r o v i a c ew e r e c l a s s i f i e di n t og r o u p3 f 3 t w e l v el i n e sw h i c hw e r ei n t r o d u c e df r o mv a r i o u se s t a t e sa n dh a dv a r i o u s c o n c e n t r a t i o n so fc a f f e i n e w e r ei n v e s t i g a t e db yr a p dt e c h n o l o g y i nw h i c h16 m o l e c u l a rm a r k e r ss p e c i f i c a l l ya m p l i f i e do ns i n g l e1 i n e sw e r ei d e n t i f i e da n dt h e m o l e c u l a rm a r k e r sc o u l db eu s e da si n d i c a t o r si d e n t i l y i n gr e l a t e dt e ac u l t i v a r so r1 i n e s s o m eo ft h es p e c i f i cl o c iw e r es e q u e n c e d f o re x a m p l et h eb a n d 4 3 0 4h a d7 5 2b p s 蕊t har e a d i n gf r a m ee n c o d i n g4 0a m i n oa c i d s 厢8a m i n oa c i d ss e q u e n c eh a d7 2 i d e n t i t yw i t ht h eg e n ee n c o d i n g 一g a l a c t o s i d a s e k e yw o r d s c a m e l l i as i n e n s i s s p r o u t i n gs t a g e c h e m i c a lc o m p o s i t i o n r a p d s p e c i f i cm o l e c u l a rm a r k e r s s e q u e n c i n g 术语与缩略语表 g l o s s a r ya n da b b r e v i a t i o n a f l p a m p l i f i e df r a n g r n e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 扩增片段长度多态性 b p b a s ep a i r 碱基对 c t a b c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e 十六烷基三乙基溴化胺 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 i s s r i n t e r s i m p l es e q u e n c er e p e a t 简单重复序列间隔区 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 r a p dr a n d o ma m p l i f i e dp 0 1 y m o r p h i s md n a d n a 随机扩增多态性 r f l pr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t l lp o l y m o r p h i s m限制性片段长度多态性 s c a r s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e d a m p l i f i e dr e g i o n s 特异性序列扩增 s s r s i m p l es e q u e n c er e p e a t s 简单序列重复 s t s s e q u e n c et a g g e ds i t e 序列标签位点 cc a t e c h i n 儿茶素 c gc a t e c h i ng a l l a t e儿茶素没食子酸酯 e c e p i c a t e c h i n 表儿茶素 e c g e p i c a t e c h i ng a l l a t e 表儿茶素没食子酸酯 e g c e p i g a l l a t e c a t e c h i n 表没食子儿茶素 e g c g e p i g a l l a t e c a t e c h i ng a l l a t e 表没食子儿茶素没食子酸酯 g cg a l l o c a t e c h i n 没食子儿茶素 gg r a m 克 m g m i l l i l i t e r 毫克 m i m i c r o l i t r e毫升 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r m a t o g r a p h y 高效液相色谱 1m i c r o l i t r e微升 r a i nm i n i t e 分钟 h h o u r小时 l l i t r e升 图表索引 表2 1 各个株系春茶营养芽物候期观察 日 月 2 1 袭2 2 各鑫耱讫学藏分分枣厅 鏊 2 2 袭2 3 不同株系儿茶索类组分分析 m g g 表3 1 不同引物的p c r 扩增结果 2 3 2 8 表3 21 2 个榇系数遗馋距离 2 9 表4 一l 各个单株鲜时蝴啡因含量 m g g 以鲜重计 3 3 表4 2 不同品种r a p d 标记位点统计4 3 6 表4 3 特异条带统计 3 7 表4 4 4 3 0 4 棱酸序列戳及b l a s t x 较缝袋 d q 4 4 3 4 7 3 3 9 图3 1 引物 7 6 在1 2 个晶系扩增的r a p d 图谱 2 7 图3 2 以引物 2 4 扩增的r a p d 图谱 2 7 錾3 31 2 令撩系夔d n a 分子系统舞霾 2 9 圈4 1 引物 5 5 扩增的r a p d 图谱 3 5 图4 2引物s 6 1 扩增图谱 3 5 强4 3 转纯质蕴p c r 鉴定魄泳图 3 8 l l 致谢 本论文是在导师梁月荣教授的精心指导下完成的 从最初的实验设计 到 最后的论文完稿 无一不倾注了梁老师的大量心血 梁老师高瞻远瞩的学术眼光 开放宽容的胸怀气度 严谨的治学态度 忘我的工作热情使我终生难忘 感谢导 师在研究生学习期间 对我在学习 工作和生活上所给予的无微不至的关怀 在 论文完成之际 向培养与教育我的导师致以最诚挚的谢意 感谢本实验室陆建良副教授在学习和实验过程中给予的理论指点 生活中给 予的充分帮助 陆老师从严治学 稳健处事的作风使我在学习和生活中学到了很 多宝贵的科学知识和生活的经验 这些在未来的工作中将使我受益无穷 感谢本实验室的郑新强博士后 吴姗博士 张凌云博士 吴颖博士 黄福平 博士 张广辉博士 d e v a j i t 博士 梁慧玲博士 叶倩博士 杜颖颖博士 林晨 博士 叶俭慧博士 孙其富硕士 孙庆磊硕士 吴金燮硕士以及潘顺顺硕士 是 他们让我的实验室生活显得丰富多彩 同时还要感谢本班同学及好友宿迷菊硕 士 同宿舍的刘成科博士 政炜硕士和赵立涵硕士 谢谢她们陪伴我一起走过三 年的研究生生活 在此谨向我系的刘祖生教授 童启庆教授 杨贤强教授 龚琦教授 沈生荣 教授 龚淑英教授 屠幼英教授 周巨根副教授 须海荣副教授 骆耀平副教授 汤一副教授 王岳飞副教授 赵正惠副教授 苏祝成副教授 赵东老师 黄志根 老师 钱利生博士 顾志蕾老师 朱晓玲老师 谢建勇老师等表示衷心的感谢 感谢大家在我的研究生期间给我的诸多帮助 同时 还要感谢 茶叶 编辑部的 徐梅生老师和张若梅老师对我的关心和照顾 最后特别要感谢我的家人对我的理解和支持 使我有勇气和动力完成研究生 阶段的学习 感谢济南工作的伯父 伯母一直以来对我的关心和照顾 感谢母校 山东农大的丁兆堂老师在学习和工作上对我的关心和帮助 谨以此文献给长期以 来所有关心我的人 王会 二零零六年五月于华家池 第一章文献综述 1 1 中国茶树育种和良种推广现状及其发展趋势 茶树品种是茶叶生产最基础 最重要的生产资料 也是茶业可持续发展的物 质基础 在市场经济条件下 茶叶产业的竞争主要是质量和价格的竞争 在影响茶 叶质量的因素中 品种是最主要的因素 用优良的品种去调整茶树种植结构是当 今茶界一项重要工作 2 0 世纪下半叶以来经过广大科技工作者的努力 茶叶育种 取得了许多显著的成果 主要有以下几个方面 1 新品种育成 2 0 世纪5 0 年代中期以来 茶树新品种选育一直是我国茶学领域的研究重点之 一 5 0 年来主要通过系统选种和杂交育种 育成了高产优质的国家审定或认定的 茶树新品种共6 7 个 同时 据不完全统计 各主要产茶省 包括台湾省 育成的省 级良种共1 2 0 多个 这些新品种在生产上的推广 对改变茶园面貌 增加茶叶单 产 提高茶叶品质和促进名优茶产业的发展 均产生了显著的促进作用 2 种质资源的搜集 保存 我国从2 0 世纪5 0 年代至6 0 年代中期就在全国各重点茶区陆续展开品种资源 的收集和保存工作 并于1 9 9 0 年在浙江杭州和云南勐海分别建立了2 个国家级的 茶树种质囤 至今 共收集和保存国内外资源2 6 6 5 份 福建福安由于保存了大量 福建的茶树种质资源 成为我国乌龙茶种质资源的保存中心 我国茶树种质资源 的保存通常采用种植保存 为了节省土地和人力 国内也开展了新的保存种质资 源方法的研究 茶树种籽和花粉的超低温保存研究已获得成功 茶树试管苗的培 育成功 为茶树种质资源的保存开辟了新的途径 3 育种新技术 沿用常规育种方法难以取得育种工作的突破性进展 创新育种方法势在必 行 近十几年来 随着生物技术的迅速发展和其它新技术新方法的应用 在茶树 育种方面也取得了较大的进展 生物工程技术的迅速发展 为茶树遗传育种研究开辟了一条崭新的途径 基 因工程技术在茶树育种上的应用 目前还处于基因组d n a 提纯和鉴定 重要基因 克隆和转基因试验阶段 目前国内未见有关转基因茶新品种育成及大面积推广的 报道 基因工程在茶树遗传育种中的应用主要包括d n a 分子标记技术 基因的分 离和克隆及转基因技术 王丽鸳等 2 0 0 4 应用分子标记技术对优良茶树品种 资源进行鉴定 直接从d n a 水平检测基因组的遗传变异 不受组织 发育时期 季节环境限制 且数量极多 多态性高 目前在植物遗传育种中常用的分子标记法 有r f l p 限制性片段多态性 r a p d 随机扩增片段长度多态性标记 a f l p 扩增片段长度多态性 等 其中r a p d 应用较多 在遗传多样性和亲缘关系分 析 种质资源的鉴定和分类以及遗传图谱的构建等方面取得很大进展 基因克隆 是基因工程研究的第一步 茶树基因的分离和克隆还处于起步阶段 但己取得了 一些成就 一些与茶叶品质密切相关的基因已被克隆 赵东等 2 0 0 1 根据多酚 氧化酶基因的保守序列克隆了决定红茶品质的多酚氧化酶基因 g e n b a n k a f 2 6 9 1 9 2 k a t o 等从茶叶中分离纯化了咖啡碱合成酶 c s 并成功 克隆了此酶基因的e d n a 李远华等 2 0 0 4 对此酶基因m r n a 表达进行了研究 浙江农业大学茶学系冯燕飞等成功克隆了s 一腺苷蛋氨酸合成酶 g e n b a n k a j 2 7 7 2 0 6 梁月荣等克隆了s a m 合成酶基因的部分序列 冯艳飞等 2 0 0 1 获得了此酶基因的全序列 安徽农业大学农业部茶叶生物技术重点开放 实验室成功克隆了茶树b 一1 3 葡聚糖酶 g e n b a n k a f 3 9 9 9 2 0 和紫黄素脱环氧化 酶 g e n b a n k a f 4 6 2 2 6 9 m a s a h a r u 等从茶叶中成功的克隆了与茶叶香气形成有 关的a 樱草糖苷酶基因并在大肠杆菌中进行了表达 而a 葡萄糖苷酶的克隆也正 在研究中 陆建良等 2 0 0 4 对茶树根际土壤真菌a l f 一1 耐酸铝基因片段进行了 克隆 这对防治土壤酸铝毒害有重大意义 梁月荣和杜颖颖等 2 0 0 6 获得了4 个自茶特异分子标记的d n a 序列 g e n b a n k 录号分别为 d q 4 4 3 4 7 5 d q 4 4 0 5 3 1 d q 4 4 3 4 7 3 和d q 4 4 3 4 7 4 以上这些研究为茶树基因工程育种从根本上降低咖啡 碱含量 提高品质增强抗逆境 包括抗强光 抗寒 抗病虫等 能力提供理浍依据 为通过分子标记育种手段培育优质 高产 高抗的茶树新品种 系 提供了可能 另外 多倍体育种 通过辐射以及体细胞杂交结合早期鉴定等技术也越来越 多地应用到茶叶育种中 大大地缩短了茶树育种年限 提高选育效果 目前己经 有很多通过远缘杂交 辐射处理等获得多倍体的实例 我国曹达仁 董丽娟等研 究发现不同茶树品种对y 射线的敏感性差异极为显著 杨跃华等对茶树人工诱变 技术进行了系统研究 进一步探明不同茶树品种的敏感性和辐射损伤的生理机 制 为开展茶树诱变育种提供了有益的资料 4 良种繁育体系建设及技术 茶树是一种多年生作物 其种植时间长达数十年 因此 实行茶树良种化是 实现茶园持续高产 稳产 优质的一项重要措施 1 9 8 2 年农业部成立了全国茶树 良种审定委员会 1 9 9 0 年更名为全国农作物审定委员会茶树专业委员会 并制定 了 全国茶树品种审定实施细则 和 国家茶树品种区域试验实施细则 1 9 8 4 1 9 8 7 1 9 9 4 年和2 0 0 1 年4 次审 认定品种9 7 个 其中2 0 世纪5 0 年代以来育成的无 性系茶树品种6 7 个 为了加速良种繁育推广 农业部和地方联合投资在各茶i 1 r 主 产省 区 建立5 q 2 个省级茶树良种繁育场 据统计 目前我国无性系茶树良种面 积占总面积的3 0 以上 无性繁殖能保持优良种性 提高繁殖系数 己成为良种 茶树繁殖的主要方法 近年来 对扦插繁殖技术研究亦较多 陈亮 1 9 9 2 在 扦插基质研究方面 夏兵认为红 t l 土作基质好 汤一凡认为泥碳 黄沙作基质好 对遮阳材料研究 沈丰年认为黄色薄膜作覆盖材料 扦插效果最好 傅建羽认为 红 黄色薄膜覆盖 发根较迟 靛兰色薄膜覆盖发根早而多 杨为候也认为兰色 薄膜覆盖发根数和成活率都最高 植物激素对扦插成活率的影响研究 潘根生等 研究结果表明 用增产灵处理的促进地上部分生长效果大 用2 4 一d 处理的 促进地下部生长效果大 用增产灵与2 4 一d 共同处理的 则大大促进了全株的 生长 粱月荣等用8 0 p p m b a 喷施母树二周后 发现个别品种插穗在离开母树时 己分化出不定根根原体 所以成活率较高 5 茶树育种的发展趋势 有人预计 茶叶将成为2 l 世纪的最受欢迎的饮料 随着人口不断增长和生活 水平的提高 茶叶需求量将不断上升 要在有限的土地上生产出更多 更丰富的 茶叶产品以满足人们对茶叶的需求 茶树新品种选育工作就显得尤为重要 总的 来说有以下发展趋势 对现有种质资源的研究 由于茶树种质资源在茶树品种改良中的重要作 用 未来茶树育种工作的成败在很大程度上取决于种质资源的研究和不断地发掘 利用 因而加快资源的研究已成为一个相当重要的问题 有必要利用不同学科各 自的优势 开展学科交叉研究 以加快研究的进展和取得更大的成效 同时要不 断引进新的技术和方法 不断提高研究的水平 品质育种和抗性育种将是未来茶树育种的主流方向 2 0 世纪中期以前 在 茶叶商品不足的情况下 育种目标以提高产量为主 但目前处于供需平衡或供大 于求时 品质显得尤为重要 随着人类社会的发展 生活水平的提高 人们对食 品的要求也越来越高 茶叶中的农药残留问题越来越受到人们的重视 培育出抗 病虫的茶树品种 从而从根本上解决农药残留问题迫在眉睫 加强基础研究 积极运用育种新技术 与其它农作物相比 茶树遗传育种 的基础研究还比较薄弱 必须在这方面投入大量的人力 物力和财力 将来 常 规育种方法将继续采用 同时渗入高新育种技术 利用中子 离子 激光等现代 辐射技术 结合传统的化学诱变技术 产生大量的变异材料 给茶树育种更广泛 的选择余地 随着生物工程技术的飞速发展 它必将带动茶树育种工作发生一场 新的技术革命 使茶树育种更方便 更快捷 目标更明确 选育出的茶树品系性 状更优良 茶树良种将大面积推广 在继续采取传统的短穗扦插繁育良种的同时 利 用微繁技术 实行工业化育苗 可以在有限时间内获得大量的植株 其它植物中 已实验成功的人工种子技术也将运用到茶树育种中来 使良种繁殖效率更进 步 提高 农业部对新世纪的茶业提出了新的要求 到2 0 1 0 年 在茶树种植结构上 有3 0 的茶园为无性系良种茶园 至1 2 0 3 0 年基本实现良种化 前面一个目标 已 经提前实现 但2 0 3 0 年的目标还需要付出很大努力 1 2 强化功能性化学成分的茶树品种选育 研究表明 茶叶中含有大量的生物活性成分 包括茶多酚 生物碱 氨基酸 茶多糖 茶皂素 茶色素 维生素 微量元素和矿物质等多种成分 其中茶多酚 咖啡碱和氨基酸是决定茶叶品质的三大主要成分 近年来的研究表明 茶多酚具 有抗氧化和清除自由基 抑制微生物生长 抑制肿瘤细胞生长等多种生理活性 其研究范围己涉及茶学 食品科学和医药学等许多领域 氨基酸是绿茶品质构成 的极重要成分之 其含量与绿茶品质呈现正相关关系 多年来一直倍受重视 茶叶中的咖啡碱 对于茶叶的消食 少睡 利尿 益思等保健功能的发挥具有重 要的作用 同时由于其高度的兴奋作用 会引起焦燥不安 失眠 易醒 腹泻 头痛 心悸等症状 不适于儿童 妇女 老人及神经衰弱等疾病患者饮用 随着 科学技术的迅速发展 现在已经可以从茶叶中单独提取茶多酚或儿茶素类化合 4 物 氨基酸和咖啡碱加以利用 并作为原料加工功能食品或药品投入市场 另一 方面 随着生活水平的不断提高及茶叶中生化成分药理功能研究的不断深入 消 费者对传统饮用茶提出了更高的要求 开始寻找低酚氨l k 茶多酚 氨基酸 低 u j 口i i p t b 碱含量的功能性饮用茶 由于不同茶树品种的茶叶中所含化学成分不同 因 此匕上功能性成分做为主要育种目标 符合市场需求和茶产业发展的需求 1 2 1 茶多酚研究现状 1 2 1 1 茶多酚的组成和结构 茶多酚类在茶叶鲜叶中的含量一般在1 8 3 6 干重 之间 主要由儿茶 素类 黄酮类 花青素类及酚酸类四大类组成 在茶多酚各组成成份中以儿茶素 类物质 黄烷醇 为主 其含量占茶多酚总量的6 0 8 0 是茶树次生代谢的 重要成分 也是茶叶保健功能的首要成分 对茶叶的色 香 味品质的形成有重 要作用 茶叶中的儿茶索是2 苯基苯并毗喃的衍生物 包括非酯型儿茶素和酯型儿茶 素 非酯型儿茶素有 儿茶素 d l c 一 表儿茶素 l e c 没食子儿茶素 d l g c 一 表没食子儿茶素 l e g c 酯型儿茶素有 一 表儿茶素没食子酸酯 l e c g 一 表没食子儿茶素没食子酸酯 l e g c g 茶叶中含量最高的儿茶素 为e g c g 其次为e c g 再次为e g c 1 2 1 2 茶多酚的抗氧化作用及其应用 茶多酚有很强的抗氧化作用 据有关部门研究证明 1 毫克茶多酚清除对人 体有害的过量自由基的效能相当于9 微克超氧化物歧化酶 s o d 大大高于其它 同类物质 茶多酚中抗氧化作用的主要成分是儿茶素类 其作用机理为 儿茶素 分子结构上的羟基 o h 起到供氢 h 体的作用 与脂肪酸中的游离基相结合而 中断脂肪酸氧化的连锁反应 能抑制氢过氧化物的形成 起到了抗氧化作用 据 研究 四种有强抗氧化能力的儿茶素按等摩尔浓度抗氧化能力依次是 e g c g e g c e c g e c 按等重量浓度抗氧化能力e g c e g c g e c e c g 可见 抗氧化能力最强的为e g c g 和e g c 两成分 茶多酚是一种纯天然的抗氧化剂 具有很强的抗氧化性和生理活性 并具有 抗癌 抗衰老 抗辐射 清除人体自由基 降血糖 降血压 降血脂及杀菌等一 列药理功能 目前已经广泛应用在油脂 食品 医药 化妆品及饮料等领域 成 为各工业化国家的技术竞争目标和研究开发热点 据业内人士初步估算 茶多酚 约有十几亿元的市场需求 亟待国内企业深入挖掘 开发 我国茶多酚市场尚处 萌芽阶段 但在饮料 化妆品 保健品等领域 茶多酚正逐步取代原来使用的化 学原料 应用领域不断加大 在日本 北美地区 天然食品配合剂和添加剂市场 的年平均销售增长率达n 5 6 其中 茶多酚作为抗氧化剂的年平均增长率达到 6 2 其它发达国家和一些发展中国家也在食品工业中逐步淘汰合成抗氧化剂而 采用天然抗氧化剂 据了解 茶多酚用量最大国 美国己将减肥药中曾经使用 的麻黄素一律改为茶多酚 并颁布相关法律保障执行 这直接导致茶多酚的市场 需求更加看涨 专家预计 未来几年 国内外茶多酚需求量将迅速攀升至2 0 0 0 t 左右 其中美国年耗量就高达5 0 0 t 1 9 9 0 年美国医学基金会主席认为 茶多酚是 2 1 世纪对人类健康产生巨大效果的化合物 1 2 1 3 茶多酚含量对绿茶品质的影响 茶多酚是构成绿茶品质的主要成分之一 茶多酚的总量及其儿茶素构成均对 茶汤滋味有显著的影响 由于茶多酚在茶叶中含量比较高 在水浸出物中所占比 重比较大 因此是决定茶汤浓度的主要物质 一定范围内对品质有积极作用 同 时由于它又是绿茶苦涩味形成的主要物质 当超过一定限度后 便会对品质带来 消极影响 施兆鹏等研究表明 茶多酚含量在2 0 以内时 滋味得分与其含量表 现为显著正相关关系 在2 2 左右时达到顶峰 在2 0 2 4 以内仍维持茶汤浓度 醇度和鲜爽度的和谐统一 当茶多酚含量进一步增加时苦涩味开始加重 另外 许多研究表明以茶多酚与氨基酸的比值 即酚氨比 可以较好的反映绿茶的滋昧 品质 一般情况下 只有多酚类 氨基酸二者的含量都比较高而比值低时 味感 才浓而鲜爽 是优质绿茶原料的特征 1 2 1 4 茶叶中茶多酚含量的影响因素及高茶多酚含量茶树品种选育 茶叶中茶多酚含量受多种因素的影响 如品种 生态条件和栽培措施等 适 制红茶的大叶类品种的茶多酚含量 儿茶素类含量和酯型儿茶素 如e g c g 和e c g 的比例一般都高于适制绿茶的中小叶种 茶树体内茶多酚和儿茶素类合成和积累 随气温和光照强度的提高而增加 夏季气温高 光照强度大 在无遮荫条件下 夏茶的茶多酚含量高于春茶 秋茶随气温的下降和光照强度的降低 茶多酚含量 6 又有所减少 海拔高度对茶多酚含量的影响随季节而异 高海拔地区春茶茶多酚 含量低于低海拔地区 而夏秋季则相反 高海拔地区高于低海拔地区 土壤酸度 在p h 5 0 5 5 时 茶叶儿茶素类和茶多酚类含量最高 高于或低于这一范围有下降 趋势 生长在红壤上的茶树 儿茶素类总量高于生长在黄棕壤的茶树 李明君 1 9 8 8 土壤相对含水量9 0 左右时 茶多酚 儿茶素类 酯型儿茶素类含量最高 干旱或过湿都妨碍这些化合物的合成和积累 杨跃华 1 9 8 7 目前高茶多酚茶树品种选育主要有两种途径 一种是通过对现有茶树种质资 源进行筛选 选出茶多酚含量高 其它性状优异的茶树品种 如齐桂年等人 2 0 0 0 研究了四川栽培的十个茶树品种的功能性化学成分含量 证明茶树品种英红l 号的 茶多酚含量最高 达4 0 5 7 比对照福鼎大白茶的茶多酚含量高了2 4 另外 也可以通过杂交育种或生物技术等方法培育高茶多酚品种 湖南茶叶研究所董丽 娟等 2 0 0 4 以福建水仙为母本 单株 优混 涟茶二号 英红二号 为父本进行人工 杂交授粉 所获f i 代通过系统选种程序育成茶树高多酚新品种7 9 1 0 o 该品 种茶多酚含量高达4 2 0 2 1 8 5 1 2 2 啡啡因的研究现状 1 2 2 1 咖啡因的性质和功能 咖啡碱 可可碱和茶叶碱是茶叶中存在的生物碱的主要形式 这三种均是黄 嘌呤的衍生物 其中以咖啡碱含量最高 咖啡碱化学名称为i 3 7 一三甲基黄嘌 呤 为白色针状结晶体 有苦味 是茶叶的主要呈味物质 在普通茶叶中咖啡因 约占干物重的2 4 研究表明咖啡因有一系列的药理作用 早在i 9 1 2 年 贸易杂志 就报道了 m e d i c o c h i r u r g i c 药物系w o o d 研究结果 认为茶叶中咖啡碱在脊髓内对神经中枢作 为兴奋剂 使肌肉收缩更有力 而无副作用 在随后几十年中 随着研究的深入 人们对咖啡碱的兴奋中枢作用有了更深的认识 咖啡碱能兴奋中枢神经 主要作 用于大脑皮质 使精神振奋 工作效率和精确度提高 睡意消失 疲乏减轻 目 前临床上已用于治疗神经衰弱和昏迷复苏 此外 咖啡因还可以强心解痉 助消 化 利尿 促进机体代谢和增加胃酸分泌等 1 2 2 2 低咖啡因茶的兴起 适度地食用咖啡因有祛除疲劳 兴奋神经的作用 但是对于咖啡因敏感的人 群 低剂量的咖啡因摄入足以影响他们的正常睡眠 通常一杯咖啡 1 5 0 m 1 含 咖啡因5 0 7 0 m g 一杯茶 1 5 0 m 1 含咖啡因4 0 8 0 m g 而对咖啡因敏感的人摄 取1 0 m g 就会引起不适症状 同时有研究表明长期过量摄入咖啡因 会使饮用人 群对咖啡因产生 定的依赖性 具体表现为咖啡因饮料 咖啡 茶或其它饮品 嗜好人群 一旦停止饮用 他们情绪低落 工作效率下降 低咖啡因茶叶产品是 满足这一人群饮茶需求的前提条件 具有较好的市场前景 尤其是在美 欧国家 低咖啡因茶是2 0 世纪8 0 年代兴起的茶叶产品 主要面对那些对咖啡因敏感的 消费者 由于这类低咖啡因茶叶是以一般的成品茶为原料的再加工产品 成本高 其售价比同类的普通茶叶高5 0 1 0 0 目前低咖啡因茶生产是通过有机溶剂或 c 0 2 超临界法脱去咖啡因 成本较高 前者还存在有机溶剂残留等问题 选育低 咖啡因茶树品种可以从根本上解决这些问题 目前日本已经通过生物技术培育出 低咖啡因茶树 另外 咖啡因生物合成途径中几种关键酶基因克隆的成功 也使 利用生物技术途径培育低咖啡因茶树成为了可能 1 2 2 3 培育低咖啡因品种研究进展及存在的问题 1 培育低咖啡困茶树品种的途径 目前认为利用生物技术降低茶树咖啡因的含量至少有两种途径 一是抑制咖 啡因的生物合成 可以利用反义r n a 技术或r n a 于涉技术促使咖啡因生物合成 途径中关键酶基因的沉默 从而抑制咖啡因的生物合成 最近 o g i t a 等 2 0 0 3 报道利用r n a 干涉技术抑制咖啡可可碱合成基因 国d z 硼盯 表达 获得了低 可可碱含量 较对照减少3 0 8 0 和低咖啡因含量 较对照减少5 0 7 0 的转 基因咖啡植株 该研究证实了可以利用生物技术途径降低咖啡或茶树中咖啡因含 量 另外 还可以促使咖啡因的体内降解 达到降低茶叶中咖啡因含量目的 茶 树和咖啡体内咖啡因的积累是由于咖啡因代谢途径中7 n m d 的活性过低引起 的 因此可以通过7 n m d 的超表达来提高其活性 加快咖啡因的降解 从而降 低咖啡因的含量 这就需要茶树7 一n m d 的分离和基因克隆进行研究 2 咖啡因合成酶和相关基因的克隆 s a m 合成酶基因的克隆 s a m 不仅是黄嘌呤核苷甲基化的唯一甲基供体 而且是茶树咖啡因生物合成中黄嘌呤核苷的主要来源 因此 研究s a m 合成酶 基因对于培育脱咖啡因茶树具有重要的意义 本实验室曾克隆了茶树s a m 合成 酶基因 所得序列长1 3 0 3 b p 编码3 9 4 i 氨基酸 其核昔酸序列和氨基酸序列与 其他植物有高度同源性 证明所获得的基因序列为茶树s a m 合成酶基因f 冯艳飞 2 0 0 1 s a m 合成酶基因的克隆为培育脱咖啡因茶树品种提供了可能 目前本实 验室正在构建茶树s a m 合成酶基因反义基因表达载体和应用r n a 干涉技术培育 转基因植株 以期降低茶树中咖啡因的含量 研究已经取得实质性进展 咖啡因合成酶基因的克隆 咖啡因酶难以纯化分离并容易变性 但其n 端 序列已有报道 k a t o 等 2 0 0 0 根据咖啡因合成酶的n 端序列设计简并引物 利用 c d n a 末端快速扩增法 r a c e 获得了一个长1 3 l k b 的c d n a 去除其5 非翻译 区后的c d n a 被称为t c s l t e ac a f f e i n es y n t h a s eg e n e 长1 4 3 8 b p 编码3 6 9 个氨 基酸蛋白 并且通过在大肠杆菌中表达t c s l 证明t c s l 编码咖啡因合成酶 可可碱合成酶基因的克隆 o g a w a 等从咖啡叶片中成功克隆出咖啡树的可 可碱合成酶基因 被称为c a m x m t c o f f e am e t h y l x a n t h i n em e t h y l t r a n s f e r a s e 2 0 0 1 最近 u e 删i 等 2 0 0 3 3 l 从咖啡树中克隆出三个参与黄嘌呤核苷甲基化合 成咖啡因的基因 分别是 c a x m t l 催化黄嘌呤核苷生成7 一甲基黄嘌呤核苷 i c a m x m t 2 催化7 甲基黄嘌呤生成可可碱 i i i c a d x m t l 催化可可碱合成咖啡 因 1 v 甲基黄嘌呤核苷合成酶基因的克隆 甲基黄嘌呤核苷合成酶催化咖啡因合 成的第一步甲基化反应 i 该酶的基因 脚s 已经从咖啡中克隆成功 m o i s y a d i 1 9 9 8 另外 m i z u n o 等也报道了咖啡甲基黄嘌呤核苷合成酶基因的克 隆 获得i 拘c d n a 被称为c t c s l 咖啡假定咖啡因合成酶 c o f f e et e n t a t i v ec a f f e i n e s y n t h a s e 3 存在的问题 利用反义r n a 技术或者r n a 干涉技术培育脱咖啡因茶树都需要建立高效 的遗传转化体系 但遗憾的是 茶树遗传转化的频率非常低 而且转化后细胞的 植株再生也存在很大难度 进一步开发高效的转化方法和有效的筛选体系仍然是 今后研究的重点内容 在茶树上除了s a m 合成酶基因和咖啡因合成酶基因已经得到克隆以外 其他与茶树咖啡因合成相关的基因尚未获得克隆 同时对这些基因的转录和表达 部位及影响因素等缺乏了解 因而 咖啡因合成途径有关酶基因的克隆及遗传转 化仍需要进一步深入的研究 l 2 3 茶叶氨基馥研究 1 2 3 1 茶叶中氨熬酸的组贼和生理功能 氨旗酸是茶叶中具有氮基和羧基的有机化合物总称 怒茶叶中主要化学成分 之一 荣叶中游离氨基酸的含量一般为2 4 融经鉴定的氨基酸有2 6 种 其中 以荼氨酸台量最离 约占荼盱中氨基黢总量的6 0 7 0 茶时中氨纂疆酶含量与 组成对荣叶品质肖重要作用 并且也肖一定的药理作用和营养价值 目前对氨熬 酸懿玺瀵作用磺究较多夔必荼氨酸巍 氨基了麓 茶氨酸是茶叶中的特征氨基酸 也是茶叶的星味物质 其含量齑接决定了茶 咛载燕蔟 在茶时存在魏2 6 秘氮基酸中 茶氨酸与其它的氮基酸不瓣 宅不 又禽 量高 而且其生化特性也非常特殊 滋年来 国外对茶氨酸的研究主要集中在其 药用功效上 研究表骤 茶爨酸具蠢键进大脑功能和辛孛经豹生长 颈爨泊金森氏 症 老年痴呆症及传导性神经功能紊乱等疾病 增加肠道谢益菌群和减少血浆胆 固醇 降压安神 改善睡眠秘抗氧化等作用 y 一氨基丁酸广泛分布猩动物 被物体内 由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转 化而来 是存在于哺乳动物脑 脊髓中的抑制性神经传递物质 除脑和脊髓外 己在多种崤乳葫秘的近3 0 释夕 周蕴缀中发现 一鬣基丁酸懿存在 箕中大多数缝 织y 一氨基丁酸的浓度仅是脑的1 已有研究表明 y 一氨旗丁酸具霄降血压 抗 菝簌 镶瘫 改饕麟裰麓 精毒孛安定 健遗长麓 基忆 捉避生长激豢分泌 篱功 能活化 肝功能活化等作用 目前已经广泛应用于食品和医药领域 1 2 3 2 荼卧氨基羧含量霹绿茶晶囊酶影响 茶叶中的氨蘩酸不仅是构成茶叶鲜浓滋味的童要成分 它们对茶叶香气的形 成氇畜鬟要煞锋耀 尹杰等 1 9 9 8 对爨翔名荼氨薹酸含潦及缀或与潞矮遂行磺 究 得出氨基酸总量与茶汤滋味里显著正相关 其相关系数为0 7 5 3 据中川致 之磅究 1 9 7 3 g l u t h e a a s p 和a r g 对绿茶滋昧熬 睾援竣六 这几糖氨基毅与 滋味评分的相关系数分别为0 8 9 2 0 7 8 7 0 7 5 2 5 1 0 6 4 1 氨基酸在茶叶加工中 参与茶叶香气的形成 它所转化两成的簿发性醛藏其它挥发性产物 都是茶时番 气物质的成分 此外 有些氨基酸本身也具有一定的香味 l j t h e a 有焦糖香 g l o e 有花香等 由于茶叶中氨基酸对茶叶品质有重要作用 近年来 人们对不同茶类 和等级的茶叶中氨基酸含量与茶叶品质的关系进行研究 大多数研究都表明绿茶 氢基酸含量与品质级别有明显的相关性 朱珩 1 9 8 3 刘文斌 9 8 3 即氨基酸 或茶氨酸含量越高 绿茶品质档次也越高 另外 其它研究也证明 茶氨酸 谷 氨酸 天冬氨酸 精氨酸等氨基酸与绿茶品质呈极显著正相关 黄建安 1 9 8 7 由此可见 选育氨基酸含量较高的茶树品种是提高绿茶品质的又一重要因素 1 2 3 3 影响茶叶氨基酸含量的因素及高氨基酸含量的茶树品种选育 茶叶中氨基酸含量受到诸多因素的影响 如品种 光照 土壤 温度和合成 前体等 研究发现当温度为2 5 c 黑暗条件下 在培养基中加入盐酸乙胺能明显 增加茶氨酸的积累 1 9 9 2 年李荣林等对茶树新梢中茶氨酸的分布情况及其在不同 季节 不同品种和不同栽