（微生物学专业论文）一株假单胞菌尼古丁降解相关酶的初步研究.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 烟草中的主要生物碱尼古丁 是一种精神药品 由于人类长期的吸食习惯 导致了对烟草中尼古丁的依赖 同时吸烟和烟气环境严重威胁人类的健康 烟草 加工过程产生了含高浓度的尼古丁的废物 这些都属于有毒的污染物 因此有效 地控制卷烟和环境中的尼古丁的含量 对于维护人类健康有着深远的意义 由于 某些微生物具有降低烟草中尼古丁含量的作用 有关微生物代谢尼古丁的研究逐 渐引起了微生物学者和烟草研究人员的关注 但有关这方面的研究主要集中在细 菌的两个属 假单胞菌属和节杆菌属 其中 对氧化节杆菌 a r t h r o b a c t e r o x i d a n s 作了较系统的研究 阐明了它的代谢途径 涉及到的酶及基因序列已基本清楚 但对于假单胞菌属 p s e u d o m o n a ss p 细菌 只初步分析了代谢途径 相关的酶 学证据 酶和基因方面的研究还没有进行 本实验室经过前期的工作获得一株可 以降解尼古丁的假单胞菌株s 1 6 并纯化了代谢途径中的两种中间产物3 琥珀酰 吡啶 3 s u c c i n o y lp y r i d i n e s p 和6 羟基 3 琥珀酰吡啶 6 h y d r o x y 一3 一s u c c i n o y l p y r i d i n e h s p 本论文的工作中 以该假单胞菌株和上 述的2 种中间产物为研究对象 对粗酶液作用下的这两种化合物的反应开展初步 研究 以假单胞菌s 1 6 的粗酶液为催化剂 s p 和h s p 依次为底物 检测生成的产 物 进一步确定反应时底物s p 和产物h s p 底物h s p 和产物2 5 二羟基吡啶 2 5 d i h y d r o x y p y r i d i n e d h p 之间量的关系 结果证明s p 在s 1 6 粗酶液作用 下生成h s p 而h s p 继续反应生成d h p 和琥珀酸 进一步从酶学角度验证了代 谢途径中的这两步反应 为获得更多的细胞催化剂 优化s 1 6 的基础培养基 选择不同的碳氮源 并 通过综合考虑休止细胞对尼古丁的降解活性和获得的细胞量来确定外加碳氮源 的种类和比例 经过优化确定以葡萄糖为碳源 浓度l 硫酸铵为氮源 浓度 o 4 尼古丁浓度为lm g m l 在生长1 2h 后其o d 6 2 嘶可达到7 0 左右 细胞 的活性与未添加葡萄糖和硫酸铵的培养基培养得到的细胞基本一致 在该优化条 件下 设计实验验证s p h s p 和d h p 对假单胞菌s 1 6 的酶系的诱导作用 结果 一株假单胞菌尼古丁降解相关酶的初步研究 没有加入诱导物的粗酶液对这几种化合物都没有活性 加入诱导物后粗酶液出现 了对这三种中间物的降解能力 但不能降解尼古丁 由于尼古丁 s p h s p 和d h p 在结构上的相似性 不能直接通过分光光度 计法测定 首先建立了的各自的检测方法 在此基础上 优化各反应条件 如 p h 温度 反应所需的辅因子等 在对各酶进行了初步的条件摸索后 选择其 中的h s p 的降解的酶进行研究 根据该反应中底物和产物的性质 定名该酶为 6 羟基 3 琥珀酰吡啶氧化酶 经过实验确定该酶反应的最适p h 为8 0 最适温 度为2 0 底物浓度为0 4m g m l 时 反应速度最快 该酶的性质研究及纯化工 作正在进行中 关键词 假单胞菌尼古丁降解6 羟基 3 琥珀酰吡啶氧化酶 i i 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t n i c o t i n e am a j o ra l k a l o i di nt o b a c c op l a n t s i sak i n do fm e d i c a ld r u g s t h er e a s o n t h a tp e o p l es m o k ec h r o n i c a l l y l e a dt ot h ed e p e n d e n c eo ni t h o w e v e r s m o b n ga n d t h en i c o t i n e r e l e a s e di n t ot h ee n v i r o n m e n ta t eg r e a t l yh a r m f u lt oh e a l t h i n m a n u f a c t u r i n gt o b a c c op r o d u c t s p o w d e r ys o l i dw a s t e s i t hah i g hc o n t e n to f n i c o t i n e a st h em a i nt o x i cc o m p o u n da r ep r o d u c e d e x p l o r i n ga l le f f e c t i v ew a yt oc o n t r o lt h e n i c o t i n ec o n t e n ti nc i g a r e t t ea n de n v i r o n m e n ti so fg r e a ts i g n i f i c a n c ef o rp e o p l e s h e a l t h s o m em i c r o o r g a n i s m sh a v et h ea b i l i t yt od e g r a d en i c o t i n ea n dt h er e s e a r c ho f m i c r o b i a ld e g r a d a t i o no fn i c o t i n eh a sb e e ng r a d u a l l yd e v e l o p e d u n t i ln o w t h e r e s e a r c hi sm a i n l yf o c u s e do nt w og e n e r a p s e u d o m o n a sa n da r t h r o b a c t e r t h e m i c r o b i a ld e g r a d a t i o no fn i c o t i n eb ya r t h r o b a c t e rh a sb e e ne x t e n s i v e l yi n v e s t i g a t e d a n dt h em e t a b o l i cm e c h a n i s m so fn i c o t i n e t h ei n v o l v e de n z y m e sa n dg e n es e q u e n c e s a r ea l m o s tc l a r i f i e d b u ta st op s e u d o m o n a so n l yi t sn i c o t i n em e t a b o l i cp a t h w a yw a s s p e c u l a t e da n da n a l y z e d t h er e l a t e de n z y m a t i ca n dg e n e t i cm e c h a n i s m sh a v en o ty e t b e e ns t u d i e d i no u rp r e v i o u sw o r k ap s e u d o m o n a ss t r a i ns 1 6w h i c hc o u l d m e t a b o l i z en i c o t i n ew a si s o l a t e da n dt h et w oi n t e r m e d i a t e s 3 s u c c i n o y l p y r i d i n e s p a n d6 h y d r o x y 一3 s u c c i n o y l p y r i d i n e h s v w e r ea l s op u r i f i e da n di d e n t i f i e d i nt h i s w o r k b o t ht h et w oe n z y m a t i c r e a c t i o n sf r o ms pt oh s pa n dh s pt o 2 5 一d i h y d r o x y p y r i d i n ep h p w e r ep r i m a r i l ys t u d i e d w i t l lt h ec e l lf r e ee x t r a c t so fp s e u d o m o n a ss 1 6a st h ec a t a l y s t t h eq u a n t i t a t i v e r e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h es u b s t r a t e ss rh s p a n dt h ec o r r e s p o n d i n gp r o d u c t sh s pa n d d h pw e r em e a s u r e d r e s p e c t i v e l y a n dt h e s er e s u l t sp r o v i d e dt h ee n z y m a t i ce v i d e n c e f o rt h e s et w or e a c t i o n se x i s t e di nt h en i c o t i n e d e g r a d e r p s e u d o m o n a ss 1 6 t og e tm o r ea c t i v ec e l l s t h eb a s i cm e d i u mf o rs 1 6c u l t i v a t i o nw a so p t i m i z e d d i f f e r e n tc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sw e r ei n v e s t i g a t e d c o n s i d e r i n gt h ea c t i v i t ya n d a m o u n to fc e l l s 9 1 u c o s ea n da m m o n i u ms u l f a t ew e r ed e m o n s t r a t e dt ob et h eb e s t c a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sr e s p e c t i v e l ya n dt h eo p t i m a lr a t i ow a s1 0 4 t h ec e l l l 一株假单胞菌尼古丁降解相关酶的初步研究 d e n s i t yg r o w no no p t i m i z e dm e d i u m c o u l dr e a c hah i g hc e l lo p t i c a ld e n s i t yo f 7 0a t 6 2 0n m w h i c hh a dt h es i m i l a rd e g r a d a t i o na c t i v i t yt on i c o t i n ew i t hc e l l sg r o w no n b a s i cm e d i u m b a s e do nt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s e x p e r i m e n t sw e r ed e s i g n e dt oc o m p a r e t h ee f f e c t i v e n e s so fs ph s pa n dd h pa si n d u c e r so ft h ec o r r e s p o n d i n ge n z y m e a c t i v i t i e s t h ec e l lf r e ee x t r a c t so fs 1 6c e l l sc o u l db ei n d u c e db ya l lt h et e s t e d s u b s t r a t e st oe m e r g et h ea b i l i t yt od e g r a d eo n ea n o t h e r b u tn i c o t i n ec a n n o tb e d e g r a d e db yt h ea b o v e c e l lf r e ee x t r a c t sa ti n d u c e do rn oi n d u c e dc o n d i t i o n s b e c a u s eo ft h es t r u c t u r es i m i l a r i t yo ft h en i c o t i n e s pa n dh s p as i m p l y s p e c t r o p h o t o m e t e rm e a s u r e m e n tc o u l dn o tb eu s e d t oe v a l u a t et h es u b s t r a t ec h a n g e s t h e r e f o r e t h em e t h o d sf o re a c hc o m p o u n dm e a s u r e m e n tw e r ee s t a b l i s h e di nt h i s s t u d ya n dt h er e a c t i o nc o n d i t i o n ss u c h a sp h t e m p e r a t u r e t h ee l e c t r o nt r a n s f e ri nt h e r e a c t i o n s w e r ea l s oo p t i m i z e d f u r t h e ri n v e s t i g a t i o nw a sf o c u s e do nt h ee n z y m a t i c m e c h a n i s mo fh s p d e g r a d a t i o n a c c o r d i n gt oi t ss u b s t a n c ea n dp r o d u c t t h ee n z y m e c a t a l y z e dh s pd e g r a d a t i o nw a sn a m e d 勰6 h y d r o x y 3 s u c e i n o y l p y r i d i n eo x y g e n a s e a n dt h eo p t i m i z e dp i aa n dt e m p e r a t u r ew e r e8 0a n d2 0 cr e s p e c t i v e l ya n dt h e o p t i m i z e dc o n c e n t r a t i o no fh s pw a sa l s od e m o n s t r a t e dt o b e0 4m g m 1 t h e p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f6 h y d r o x y 3 s u c c i n o y l p y r i d i n eo x y g e n a s ew a s b e i n gu n d e rw a y k e yw o r d s p s e u d o m o n a sn i c o t i n ed e g r a d a t i o n6 h y d r o x y 3 s u c c i n o y l p y r i d i n e o x y g e n a s e p c 原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独立进行研究所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方 式标明 本声明的法律责任由本人承担 论文作者签名 玉孕l 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权山东大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名 翅j导师签名 论文作者签名 翘 导师签名 平 地一7 山东大学硕士学位论文 1 尼古丁对环境的污染 第一章前言 1 1 吸烟过程中产生的尼古丁对环境的污染 目前全世界的吸烟人数约有十二亿以上 大约每分钟就会吸掉十吨烟草 还 有一个惊人的数字 现在地球上每十三分钟就会有一个人死于烟草和烟草有关的 疾病 世界卫生组织的研究表明 目前全世界每年死于烟草人数达4 9 0 万 到 2 0 2 5 年将增加到1 0 0 0 万 a m e r i c a nc a n c e rs o c i e t y 2 0 0 4 我国是全球最大的 烟草生产和消费国 占世界五分之一的人口消费了全世界大约3 0 的卷烟 h o l d e n 2 0 0 1 据专家分析 吸烟产生的烟气 可分为主流烟 即吸烟者吸入 口内的烟 和副流烟 烟草燃烧后外冒的烟 被动吸烟者要接受由直接吸烟者 喷出的主流烟 还要接受混合烟和副流烟 其毒性比主流烟大2 5 倍 在吸烟者吐出的烟雾和香烟燃烧时产生的烟雾中 含有的烟焦油和尼古丁的 比例是吸烟者的一倍以上 苯并芘为2 倍 一氧化碳为4 倍 其中含有高于5 0 倍的氨 6 0 倍的镉 周国珍 1 9 9 6 年 如此多的有害物质对周围的人特别是儿 童 孕妇和老年人造成很大的危害 其中被动吸烟的主要致癌机理是 产生活化 氧的自由基损伤基因和细胞膜蛋白 促发疾病和肿瘤等 同时还会减少血红蛋白 携氧量 并使心肌利用氧的能力下降 被动吸烟的危害较之主动吸烟者更为严重 曾正斌 1 9 9 6 年 1 2 卷烟加工过程中产生的有毒废物 由于人们日常生活中对烟草产品的依赖 尤其是低含量的尼古丁卷烟的需 求 在卷烟加工过程产生了大量的废物 n o v o t n ya n dz h a o 1 9 9 9 烟叶中的主 要生物碱尼古丁 有强烈的毒性 不容易降解而导致长期存在于环境中 给我们 的自然和生存环境带来很大的影响 据统计这些废物中的尼古丁平均含量达1 8 班g 干重 欧盟法律对尼古丁是否属于 危险的有毒废物 c i v i l i n ie ta l 1 9 9 7 的规定上限为为5 0 0 m g k g 干重 从上可以看出 环境中堆积的烟叶中尼古丁的 一株假单胞菌尼古丁降解相关酶的初步研究 含量已经大大超过标准 同时尼古丁的结构决定了它有很好的水溶性 很容易造 成水质的污染 威胁着我们的生存环境 因此我们需要采取一些有效措施解决这 个问题 1 3 卷烟加工中上部烟叶的积累 一般来说 烟草植株中的不同部位的烟叶其尼古丁含量也不相同 上部烟叶 的尼古丁含量最高 近年来随着科技经济的发展 我国部分烟区生产的烟叶外观 质量已经有了很大的提高 基本接近国际水平 但烟叶中的主要生物碱尼古丁的 含量偏高 目前 我国生产的烤烟尼古丁的平均含量为3 4 白肋烟平均高 达6 而美国烤烟的尼古丁含量在1 5 3 5 之间 一般优质白肋烟的尼古丁 含量在1 5 4o 之间 以3 o 为佳 美国白肋烟的尼古丁含量为2 9 左右 国内卷烟企业在卷烟制作过程中 由于上部烟叶中的尼古丁含量较高 很难用于 叶组配方中 所以目前的情况是上部烟叶贮存较多 这个问题已引起有关部门的 重视 如何降低这些烟叶中的尼古丁的含量是各卷烟企业所面临的一个现实问题 张彦东等 2 0 0 3 国内外都对这个问题采取了措施 例如为了适应意大利环 保法的要求 r o s s is 等进行了用假单胞菌降解烟尘废料中烟碱的研究 其实验 中用含有假单胞菌的水来浸透烟粉 约一周后 烟碱含量由原来的2 o 2 5 降 低到4 0 x1 0 4 7 0 x1 0 4 之间 因此如何利用微生物或酶的作用提高卷烟的燃吸品 质和安全性 提高烟叶资源的利用率 具有巨大的实用价值和经济效益 随着人 们对吸烟与健康意识的普遍增强 今后仍将是烟草业继续深入研究的一个重要课 题 1 4 吸烟过程中尼古丁对人体的危害 尼古丁是一种无色透明的油状挥发性液体 既是一种兴奋剂 也是一种抗焦 虑药 可使吸烟者感受到一种轻柔愉快的感觉 但过量则引起抑制或麻痹作用 尼古丁还会使支气管纤毛丧失活力 甚至脱落 致使支气管粘膜受损 易发炎和 感染 尼古丁刺激中枢神经系统 使心率和脉率增加 血压上升 血管发生狭窄 影响血液循环 并使心脏负担加重 y i l d i z 2 0 0 4 尼古丁最大的危害还在于它的成瘾性 尼古丁作用极为迅速 吸入纸烟烟雾 2 山东大学硕士学位论文 中的尼古丁只需7 5 秒就可到达大脑 经静脉注射尼古丁要1 3 5 秒才能到达大 脑 这是主要的成瘾源 尼古丁在血浆的半衰期为3 0m i n 如每天吸一包纸烟 者 每3 0 4 0r a i n 就要吸一支烟 以维持大脑尼古丁稳定水平 当不能达到这 水平时吸烟者就会感到烦躁 不适 恶心 头痛并渴望补充尼古丁 y i l d i z 2 0 0 4 研究结果还表明 妇女抽烟还会导致不孕率增加 尤其妇女在怀孕期间抽烟 还会导致早产 流产和婴儿发育不良等 与此同时 那些分娩不久的妇女如果抽 烟的话 对新生婴儿将产生多种不良影响 这其中包括 新生婴儿肺部发炎和各 种呼吸道疾病 何燧源 2 0 0 2 2 0 0 3 年3 月e l i o ts p i n d d 在 生命科学杂志 上发表了自己的研究成果 香 烟中的尼古丁不仅会导致癌症发生 还会刺激产生一种分子物质 后者会增加肺 癌的侵袭性 并促进癌细胞的分裂和生长 另外尼古丁和烟草中的其它生物碱在烟草加工过程中和吸烟瞬间被亚硝化 生成烟草中特有的 亚硝胺 t o b a c c o s p e c i f i c n i t r o s a m i n e s t s n a 如n i t r o s a m i n e 4 m e t h y l n i t r o s a m i n o 1 3 p y r i d y l 1 b u t a n o n e n n k 它们是强烈的肺癌 等致癌剂 肖协忠 1 9 9 7 d a v i sa n dn i e l s e n 1 9 9 9 1 5 微生物和酶在生产高品质卷烟中的作用 针对烟草给我们的健康和生存环境带来的危害 各国政府已经颁布了多种法 规和政策 其主要内容之一就是降低卷烟生产过程中烟叶尼古丁的含量 并鼓励 生产低尼古丁含量的卷烟 以逐步降低人们对尼古丁的依赖 b e n o w i t za n d h e n n i n g f i e l d 1 9 9 4 美国卫生协会已经签署了一项政策 强制规定了烟草产品 中尼古丁的含量 h e n n i n g f i e l de ta 1 1 9 9 8 我国也对卷烟产品的质量提出了要 求 明确了卷烟产品 高香气 低焦油 低危害 的目标 微生物和酶在烟叶的调制 陈化 加工和贮存期间起着非常重要的作用 研 究最多的是通过发酵的方法 用微生物或酶降解烟碱 合成香料和改善烟叶 烟 草薄片及烟梗的品质 自1 9 世纪5 0 年代中期开始人们就对微生物和酶在烟草中 的作用进行研究 至今己取得了大量的研究成果 已经分离使用了一些微生物来 改进烟草的风味 以增加香气 降低刺激 同时 烟草中尼古丁的微生物降解也 引起众多烟草工作者和微生物学者的注意 这些微生物被认为具有降低烟草中尼 一株假单胞菌尼古丁降解相关酶的初步研究 古丁含量的潜能 近年来国内外的研究者把其研究重点都放在了尼古丁在人及动物体内的代 谢降解 对神经系统 呼吸系统的作用机理以及是否致癌等方面上 而对其微生 物降解的研究较少 研究水平也较低 因此开展有关微生物代谢尼古丁的研究 对代谢产物进行定性和定量分析 阐明微生物代谢尼古丁的生化途径 同时纯化 尼古丁代谢的关键酶 克隆和表达微生物代谢尼古丁的相关基因 揭示微生物代 谢尼古丁的遗传机理 不仅具有十分重要的科学意义 更为该类微生物在相关领 域的应用提供理论支持 2 微生物代谢尼古丁的酶学研究进展 烟碱的微生物降解已经研究许多年了 所用的微生物不同 烟碱的分解途径 也不同 人们对可代谢烟碱微生物的研究集中在应用方面 详细的作用机理研究 的并不多 迄今为止 仅有两个属的细菌 假单胞菌属和节杆菌属 对氧化节杆 菌作了较系统的研究 其代谢机理已基本清楚 相关的代谢酶也已经纯化 并得 到了相应的基因簇序列 给微生物的应用提供了理论依据 相对来说 假单胞菌 的研究只是初步分析了它的代谢途径 相关的酶还没有报道 2 1 尼古丁的微生物代谢途径 通过总结以前微生物对尼古丁代谢的实验结果 1 9 5 5 年f r a n k e n b u r g 在对来 自烟草种子的细菌进行了研究后 分析总结出三种降解途径 1 9 5 7 年w a d a 等详 细研究了尼古丁等生物碱的微生物降解过程 归纳得出这些生物碱的代谢途径 或从吡啶环的羟基化作用开始 或从吡咯烷的脱氢作用开始 二者的先后顺序可 以不同 根据中间产物可以判断出w a d a 报道的代谢途径就是f r a n k e n b u r g 所描 述的2 b 途径 美国学者r i t t e n b e r g 等 1 9 5 9 1 9 7 2 对a r t h r o b a c t e ro x i d a n s 尼 古丁的降解进行了详尽的研究 确定了它的降解途径 它与f r a n k e n b u r g 所报道 的第一种相似 但f r a n k e n b u r g 只确定了第一种代谢中间物 故不能肯定 关于 f r a n k e n b u r g 所报道的第二种途径 2 a 至今尚无别的研究者发现 该途径前三 步反应与2 b 途径一致 但不同点是烟酸作为该途径的一种中间代谢物 归纳总 结 微生物降解尼古丁主要有三种途径 吡啶途径 p v r i d i n ep a t h w a y 吡咯途 4 山东大学硕士学位论文 径 p y r r o l i d i n ep a t h w a y 和脱甲基化途径 m ep a t h w a y e b c r h a r d t 1 9 9 5 2 1 1 吡啶途径 p y r i d i n ep a t h w a y 由节杆菌属细菌的代谢途径总结得出 如a o x i d a n s 和a n i c o t i n o v o r a n 等 该途径是先从尼古丁的毗啶环6 位羟基化反应生成6 羟基尼古丁 6 h y d r o x y n i c o t i n e 开始 然后毗咯烷被氧化脱氢生成6 一羟基 甲基麦喔斯明 6 h y d r o x y n m e t h y m y o s m i n e 该物质不稳定自发水解打开吡咯烷 毗啶环进 一步通过羟基化反应被打开 见图1 1 微生物在沿着这条途径代谢尼古丁时 培养液中常出现颜色变化 原因是代谢过程中生成了一种叫做 尼古丁蓝 的物 质 2 1 2 吡咯途径 p y r r o l i d i n ep a t h w a y 主要有假单胞菌属细菌 如p s e u d o m o n a ss p n o 4 1 pc o r l v e x i p c l p p u t i d a 以及真菌如棘孢小克银汉霉属的ce c h i n u l a t a1 i 0 4 4 4 4 该途径先从尼古丁的吡 咯烷的脱氢作用开始 生成 甲基麦喔斯明 n m e t h y m y o s m i n e 和假氧化尼古 丁 p s e u d o o x y n i c o t i n e 进而打开吡咯烷 然后通过吡啶环的羟基化作用打开吡 啶环 见图l 2 5 一株假单胞菌尼古丁降解相关酶的初步研究 图1 1 吡啶途径 左图 1 尼古丁脱氢酶 2 砂 6 羟基尼古丁氧化酶 3 口妙 6 羟基 尼古丁氧化酶 4 酮脱氢酶 5 未知酶 6 2 6 z 羟基吡啶 3 羟化酶 f i g 1 lp 蜘d i n ep a t h w a y 1 e f t 1 n i c o t i n ed e h y d r o g e n a s e 2 l 6 h y d r o 珂n i e o l m eo x i d a s e 3 d 6 一h y o 碍n i c o t i n e j d e 4 k e t o n ed e h y d r o g e n a s e 5 u l l k n o w l le n z y m e 6 2 6 d i 吣o x y p y r i d m e 3 h y d r o x y l a s e 图1 2 吡咯途径 右图 方括号中的化合物为推测中间物 f i g 1 2p y r r o h d m ep a t h w a y f i g h t lc o m p o u n d si nb r a c k e t sw o l en o td e t e c t e d 6 山东大学硕士学位论文 2 1 3 脱甲基化途径 m ep a t h w a y 主要存在于一些真菌中 如ce c h m u l a t ai f 0 4 4 4 4 ce c h m u l a t an r r i 3 6 6 5 户f i l a m e n t o s a m 卿s e ma t c c1 1 3 9 5 s e p e d o m u mc h y r o s p e r u ma t c c 1 3 3 7 8 sg r i s e u s u i1 1 5 8 和s p l a t e n s e s a t c c1 3 8 6 5 该途径主要特点是从尼古 丁的吡咯烷的脱甲基化开始 生成去甲基尼古丁 n o r n i c o t i n e 然后沿去甲基尼 古丁的代谢途径进一步被代谢 另外1 9 5 9 年h y l i n 发现菌株a n i c o t i n o p h a g u m 在菌体生长过程中细胞处 于快速分裂状态时 它经过类似吡啶途径生成6 羟基尼古丁 最后以脂肪酸的形 式进入细胞能量循环 而当到达成熟期有一个细胞停止分裂时 便转向一个类似 吡咯途径的去向 经过假氧化尼古丁 最后生成6 羟基 3 琥珀酰吡啶 从以上可以看出 微生物利用不同的代谢途径 将尼古丁逐步降解转化为羧 酸和氨基酸 为细胞的生物合成提供碳氮源和能源 2 2 微生物代谢尼古丁的相关酶学研究进展 节杆菌属细菌的尼古丁代谢的酶学和分子遗传学的研究 主要是围绕a o x i d a n sp a 0 1 后来重新分类为a n i c o t i n o v o r a n s 展开的 在上述的尼古丁代 谢途径的6 个主要反应步骤中 共涉及到6 个酶的作用 见图l 1 除了催化第 五步的酶还不清楚外 其它的5 个酶都已经研究的很明确 2 2 1 尼古丁脱氢酶 1 9 6 5 年 d e c k e r 等报道a o x i d a n sp a 0 1 可以利用d 尼古丁和l 尼古丁作 为唯一碳氮源生长 发现催化尼古丁氧化的第一步酶尼古丁氧化酶 后改名为尼 古丁脱氢酶 可被d 尼古丁和l 尼古丁同时诱导 而被葡萄糖和铵盐的同时存 在所阻遏 1 9 8 8 年w i l f r i e df r e u d e n b e r g 等纯化了a r t h r o b a c t e ro x i d a n sp 3 4 后 来重命名为a u r e a f a c i e n s 中的尼古丁脱氢酶 指出该酶的分子量为1 2 0 0 0 0 其中含有钼 铁 硫 黄素蛋白 由三个亚基组成 大小分别为8 2 0 0 0 3 0 0 0 0 和 1 5 0 0 0k d a 该酶含有1 个f a d 辅酶 1 个钼原子 4 个铁原子和2 个酸不稳定 的硫原子 1 9 8 9 年m a t t h i a sn a g e l 等报道a r t h r o b a c t e ro x i d a n sp 3 4 的尼古丁脱氢 7 一株假单胞菌尼古丁降解相关酶的初步研究 酶中含有一个分子量为7 5 0 的细菌蝶呤 b a c t o p t e r i n 钼辅因子 它是细菌脱氢 酶中的一个组分 1 9 9 4 年s u s a n n eg r e t h e r b e c k 等对a r t h r o b a c t e ro x y d a n sp a 0 1 中的该酶基因进行了克隆表达 发现n d h 酶由三个亚基组成 分子量分别为 3 0 0 1 1 1 4 9 2 4 和8 7 6 7 7 以钼蝶呤二核苷酸 f a d 和f e s 簇作为辅因子 并 推断该酶的小亚基 n d h b 带有一个f e s 簇 中等大小的亚基 n d h a 结合 有一个f a d 最大的亚基 n d h c 结合有钼蝶呤 这与w i l f r i e df r e u d e n b e r g 等和m a t t h i a sn a g e l 等人报道一致 2 2 2l 6 一羟基尼古丁氧化酶和嗍 羟基尼古丁氧化酶 这两个酶催化第二步反应 它们是一对严格光学特异的酶 6 h l n o 和 6 玎 n o 可被d 尼古丁和l 尼古丁诱导 而被葡萄糖和铵盐的同时存在所阻 遏 1 9 6 5 年d e c k e r 对它们进行了部分纯化 结果表明它们具有不同的分子量 各被底物的光学对映体竞争抑制 k m 和硒都非常接近 1 9 6 7 年d e c k e r 等揭示 了好氧条件下 这两个酶催化6 羟基尼古丁生成6 羟基假氧化尼古丁的反应机 理 它是先经过酶催化的脱氢作用生成6 羟基 n 甲基 麦喔斯明 第二步反应 然后自发水解生成产物 第三步反应 并进一步说明f a d 是这两个酶的辅酶 它们对底物有高度的专一性 与大多数黄素酶不同的是对于l 广6 羟基尼古丁氧化 酶只有氧气可以作为反应的电子受体 1 9 6 8 年v o d a n g d a i 等对l 6 羟基尼古丁 氧化酶进行了纯化 发现该酶蛋白是一个同源二聚体 分子量为9 3 0 0 0 亚基的 分子量测定为4 7 0 0 0 每个酶分子以非共价键结合有两个f a d 并推测每个亚 基上有一个酶的活性位点 对i 6 羟基尼古丁氧化酶的研究较多 因为该酶结 构简单 是一个单体酶 并共价结合有一个f a d 分子 因此成为研究f a d 与脱 辅基酶共价结合机理的模式酶 1 9 7 2 年 m a r g a r e t eb r t l h m u l l e r 等报道对d 6 羟 基尼古丁氧化酶进行了纯化 发现它是一个分子量为5 3 0 0 0 仅由一个多肽链组 成的酶 每分子酶共价结合一个f a d 分子 与l 6 羟基尼古丁氧化酶不同的是 它反应时分子氧可由亚甲基蓝和2 6 二氯酚靛酚等电子受体代替 但单电子受体 没有这个作用 后来证明f a d 是通过8n 州 3 组氨酰 核黄素连接到脱辅基的 d 一6 羟基尼古丁氧化酶上的 h a n n sm o h l e r 等 1 9 7 2 f a d 肽序列为 s e r g l y g l y a s n a s h p r o a s p h i s t y r g l n p r o a l a 1 9 7 3 1 9 7 5 年b r u h m t l l l e r g 山东大学硕士学位论文 等通过免疫实验 证明存在一个没有活性的d 6 羟基尼古丁氧化酶的前体蛋白 并推测f a d 的共价结合会使该酶重新表现活力 自此 有关d 6 羟基尼古丁氧 化酶的研究进入了新的阶段 1 9 7 6 年h e n r yc r e e v e s 等用休止细胞来证明d 6 羟基尼古丁氧化酶的诱导 实验表明 d 尼古丁和d 6 羟基尼古丁都可以诱导 该酶的合成 而相应的对映光学异构体及该酶的产物则没有诱导能力 同时l 6 羟基尼古丁可以抑制d 尼古丁和d 6 羟基尼古丁对该酶的诱导 而l 尼古丁仅 抑制d 6 羟基尼古丁对该酶的诱导 此外葡萄糖 2 脱氧 d 葡萄糖和三羧酸循 环的中间物都有抑制作用 该实验还发现在f a d 共价结合到该酶的前体蛋白形 成有活性的酶需要蛋白合成和氧气 这暗示该过程需要能量 在考察a r t h r o b a c t e r o x y d a n sp a 0 1 的核黄素突变株中 发现这两个酶的合成的调节不仅发生在尼古 丁的诱导的基因表达水平上 而且还表现在f a d 限制的翻译水平上 h a n s h e i n r i e hh a m m 等 1 9 7 8 1 9 8 2 年r o d e f i c hb r a n d s c h 等报道大肠杆菌旋 转酶抑制剂新生霉素和萘啶酮酸轻微抑制l 6 羟基尼古丁氧化酶的诱导合成 但 会导致d 6 羟基尼古丁氧化酶活力的增加 葡萄糖对d 6 一羟基尼古丁氧化酶的 抑制不能被c a m p 解除 但可被萘啶酮酸解除 1 9 8 9 年l u d w i gm a u c h 等报道 d 一6 羟基尼古丁氧化酶的酶活 是从独立的转录单元表达的 并依赖于生长时期 2 2 3 酮脱氢酶 该酶催化尼古丁反应的第四步反应 1 9 9 8 年s c h e n ks 等人对酮脱氢酶 k e t o n ed e h y d r o g e n a s e k d h 进行了克隆表达 发现该酶为异源三聚体 三 个亚基分别为8 90 2 1 7 1d k d h c 2 67 7 86 5d k d h a 和1 76 3 8 8 8d k d h b 2 0 0 1 年b a i t s c hd 等人报道它依赖一个钼蝶呤辅因子 m o c o k d h c f a d k d h a 和f e s 簇 砌昭 2 2 42 6 一二羟基吡啶氧化酶 该酶催化2 6 二羟基吡啶氧化为2 3 6 三羟基吡啶的反应 1 9 7 2 年p a u le h o l m e s 等对a r t h r o b a c t e ro x i d a n sp 3 4 中2 6 二羟基吡啶氧化酶 2 6 一d i h y d r o x y p y r i d i n e 3 一h y d r o x y l a s e 2 6 d h p h 进行了部分纯化 发现它是 一个分子量为8 9 0 0 0 的单加氧酶 并结合有一个黄素 其反应需要还原性的吡 9 一株假单胞菌尼古丁降解相关酶的初步研究 啶核苷酸如n a d h 的参与 当二羟基毗啶 n a d h 和氧气量为1 l l 时 反应终 产物为一种蓝色素 2 0 0 1 年b a i t s c hd 等人对2 6 d h p h 的基因进行了克隆表达 发现它是分子量为9 0k d a 的同源二聚体 每摩尔的二聚体紧密结合2 摩尔的 f a d 酶活对n a d h 严格依赖 2 3 假单胞菌与氧化节杆菌中尼古丁的代谢相似性及其与烟酸代谢的相似性 关于假单胞菌代谢尼古丁的相关酶系 至今还没有明确的报道 但假单胞菌 与氧化节杆菌对尼古丁的代谢有一定的相似性 我们可以据此来研究假单胞菌中 尼古丁的代谢涉及到相关酶 氧化节杆菌中在对尼古丁代谢的过程中有下列反应 r s 卜憎e o l i m 图l 3 尼古丁到6 羟基尼古丁的反应 f i g 1 3t h er e a c t i o no f n i c o t i n et o6 h y d r o x y n i e o t i n e h 解 图l 46 羟基 n 甲基麦喔斯明到6 羟基 假氧化尼古丁的反应 f i g 1 4t h er e a c t i o no f 6 h y d r o x y n m e t h y l m y o s m i n et o6 h y d r o x y p s e u d o o x y n i c o t i n e 假单胞菌对尼古丁的代谢过程涉及的相关反应 c h 9 2 c o o h 3 s u c c i n o y l p y r i d i n e 图1 53 琥珀酰吡啶到6 羟基 3 虢珀酰吡啶的反应 f i g 1 5t h er e a c t i o no f 3 一s u c c i n o y l p y r i d m et o6 h y d r o x y 一3 s u c c i n o y l p y r i d n e 1 0 一 g 山东大学硕士学位论文 n m e t h y l m y o s m i n e 一可 心b 洲洲3 图l 6n 甲基麦喔斯明到假氧化尼古丁的反应 f i g 1 6t h er e a c t i o no f n m c t h y l m y o s m i n ct op s e u d o o x y n i c o t i n e 从图1 3 和1 5 的反应式我们可以看到 产物都是在含取代基的毗啶环上引 入一个羟基 引入位置在取代基的对位上 从1 4 和1 6 的反应式可以看出 产 物均为毗啶环上的取代基吡咯环的开环 并且开环方式相似 尼古丁与烟酸在假单胞菌中代谢过程的相似性 在假单胞菌作用下尼古丁参与的反应 p 恸筘二一 假单胞菌对烟酸的降解反应 p 洲一 从以上两反应式中的反应底物与产物之间的结构关系 我们可以看到 在假 单胞菌中 尼古丁和烟酸代谢后都生成了中间产物2 5 二羟基吡啶 而且生成方 式类似 经过以上的比较 我们可以得出 氧化节杆菌中的尼古丁代谢以及假单胞菌 中的