EBER原位杂交过程.doc

预先准备的试剂胃酶浓缩液：将胃酶中加入4毫升的蒸馏水或去离子水，充分溶解后可根据使用量分装，冻存（-20）。胃酶稀释液：石蜡切片：将试剂瓶中的1N HCl用蒸馏水或去离子水10倍稀释，即成0.1N HCl溶液PBS配制：将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水，彻底溶解后加入Tween 20 5滴，混匀后使用。DAB工作液配制：在1毫升5A中加入50微升的5B，临用前配制，未用完的液体应弃去。也可按照上述比例，根据实际需要量配制。胃酶消化工作液的配制每1cm2的切片按照300-400微升准备胃酶消化工作液，必须现用现配，未用完的胃酶工作液应弃去。石蜡切片：将上述已分装好的胃酶浓缩液用已稀释至0.1N的HCl溶液100倍稀释，例如可将15微升的分装胃酶浓缩液加入到1.5ml的0.1N HCl溶液中，混匀后备用。所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行，避免试剂蒸发。一旦杂交程序开始，玻片不能干燥。样品的收集和预处理石蜡切片：常规福尔马林缓冲液固定，时间不宜超过12小时。石蜡包埋的温度不宜超过65。4-6微米的石蜡切片，56-60烤片2-16小时。处理好的切片可以立即使用，也可放置于室温条件下保存（至少可保存3个月以上）。在做原位杂交之前，切片需经新鲜二甲苯脱蜡（10分钟2）。脱蜡后的切片在新鲜100%乙醇中放置5分钟后，经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。酶处理（避免RNA酶污染，带手套操作）将切片放置于37中，每张切片加入300-400微升新鲜配制的胃酶工作液孵育。石蜡切片孵育30分钟。弃去胃酶工作液后，逐级酒精脱水（70%、95%和100%），每个梯度放置1分钟。空气干燥后杂交。杂交程序（避免RNA酶污染，带手套操作）杂交：混匀探针溶液，在每张切片上加10-20微升适量的探针（试剂3），加盖盖玻片（注意防止气泡！）。湿盒中37孵育2小时，杂交过夜效果更好。冲洗：将切片浸入PBS缓冲液中10分钟，直到盖玻片自然脱落，用PBS缓冲液冲洗切片2分钟3次，取出切片，擦干多余的缓冲液。检测和显色程序切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（试剂4），37孵育30分钟，PBS冲洗1分钟3次（期间可摇动容器数次），用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟1次。擦净切片边缘的水分，加入适量配制好的DAB工作液。显色5-15分钟，注意光镜下观察显色情况。用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟3次后，即可进行封片或复染。复染程序可苏木素复染，染色约5-10秒。用蒸馏水或去离子水短时间冲洗，常规脱水、透明，封片。无阳性表达可能原因：1塑料制品：尽可能使用无菌、一次性塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，有些厂家提供的产品已达到RNase-free，可以直接使用，再次处理容易造成二次污染，得不偿失。但原则上国产塑料制品处理后方可使用。处理方法如下：（1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC有致癌之嫌，须在通风柜中小心操作。（2）将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。（3）在通风柜中37或室温下处理过夜。（4）将EDPC水溶液小心倒入废液瓶中，用铝箔封住含DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。（5）用合适的温度（80-90）烘烤至干燥，置于干净处备用。2玻璃和金属制品：实验室用的普通玻璃和金属器皿经常有RNA酶污染，使用前必须于180干烤8小时或250烘烤3小时以上。另一种方法是用0.1%的DEPC水溶液浸泡。3电泳槽：用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1轕C处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿，塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。4移液器：RNase的又一污染源是移液器。根据移液器制造商的要求对移液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部，基本达到要求。移液器金属退头器是RNA酶的一个重要来源，实验前最好取下它。5溶液：用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液应用0.1轕C水于37至少处理12小时，然后于100加热15分钟或在15lbf/in2(1.034105Pa)的高压下蒸气灭菌30分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液，可存几瓶新的，未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。6研究人员：RNA酶广泛存在于人的皮肤上，最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离和分析RNA的材料和溶液时，以及在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。一、防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37处理1