（植物学专业论文）根瘤菌ngr234的一种Ⅲ型效应因子nopp的功能研究.pdf

论文题目 根瘤菌n g r 2 3 4 的一种i i i 型效应因子n o p p 的功能研究 姓名 金诚 专业 植物学 导师 c h r i s t i a ns t a e h e l i n 摘要 根瘤菌n g r 2 3 4 能够与多种豆科植物通过形成固氮根瘤而建立共生关系 有些 宿主植物对根瘤菌分泌的i i i 型效应因子产生阳性的反应 如大叶千斤拔和非洲山 毛豆 有些植物则以消极的方式回应 如菽麻和豆薯 i i i 型分泌系统是一个 复杂的蛋白转运体系 革兰氏阴性细菌利用该系统转运效应蛋白进入真核寄主细 胞 由根瘤菌分泌出来的i i i 型效应因子在宿主特异性结瘤方面起重要作用 结瘤 胞外蛋白p n o p p 和l n o p l 是假定的由根瘤菌n g r 2 3 4 分泌的i i i 型效应因 子 在体外试验中这些蛋白能被植物蛋白激酶磷酸化 然而它们在植物中的分子 功能仍然不清楚 在本论文中 在大肠杆菌中表达t n o p p 基因 6 个组氨酸标记 的重组n o p p 蛋白通过亲和层析被纯化并被用来免疫兔子 制备好的抗n o p p f f l l 清 既能识别来自大肠杆菌的重宝f n o p p 蛋白 也能识别来自根瘤菌n g r 2 3 4 l 清培养 基中的经类黄酮诱导表达的天然n o p v 蛋f l 为了研究n o p p 在豆科植物和根瘤菌 共生过程中的作用 构建了根瘤菌n g r 2 3 4 中的n o p p 突变体并且对宿主植物进行 了结瘤实验 实验结果显示 n o p p f l c j 突变导致非洲山毛豆和菜豆 玉豆一号 的根瘤数目减少 带有n o p l 和l n o p p 基因缺失的双突变体在非洲山毛豆上诱导产 生更少的根瘤 然而在菜豆 玉豆一号 上却观察到更多的结瘤 除此之外 构 建了一种带有两个突变氨基酸残基 e 1 3 9 d e 1 4 1 d 的突变 f 4 4 n g r q n o p p d d 以鉴定对于n o p p 功能必须的氨基酸 初步结果表明 n o p p 的这两个氨基酸的突 变轻微地 然而不是显著地减少了根瘤菌n g r 2 3 4 在菜豆 玉豆一号 上的根瘤 数目 为了开始n o p p 磷酸化位点的研究工作 n 端带有6 个组氨酸标签序列的 n o p p 被克隆至i j p y e s 2 载体上并且在酿酒酵母w 3 0 3 a r 扣表达 这种酵母被用作真核 表达体系 重组蛋e i h i s n o p pn j 在酿酒酵母w 3 0 3 a q b 成功地表达 然而表达水平 相对较低 将来的实验须对表达条件进行优化以得到足够多的磷酸化的n o p p 蛋 白 关键词 根瘤菌n g r 2 3 4 共生 i i i 型分泌系统 结瘤胞外蛋白p n o p p 磷 酸化 非洲山毛豆 菜豆 玉豆一号 结瘤 酿酒酵母w 3 0 3 a f u n c t i o n a la n a l y s i so fn o p p at y p e3e f f e c t o ro fr h i z o b i u m s p s t r a i nn g l 也3 4 n a m e c h e n g j i n m a j o r b o t a n y s u p e r v i s o r c h r i s t i a ns t a e h e l i n a b s t r a c t r h i z o b i u ms p s t r a i nn g r 2 3 4e s t a b l i s h e san i t r o g e n f i x i n gn o d u l es y m b i o s i sw i t h m a n yl e g u m e s s o m eh o s tp l a n t so ft h i ss t r a i nr e a c tt op r o t e i n ss e c r e t e db yt h et y p e t h r e es e c r e t i o ns y s t e m t 3 s s i nap o s i t i v e f l e m i n g i ac o n g e s t a t e p h r o s i av o g e l i oo r n e g a t i v e c r o t a l a r i aj u n c e a p a c h y r h i z u st u b e r o s u s m a n n e lt 3s s sa r ec o m p l e x p r o t e i nt r a n s p o r ts y s t e m st h a tg r a m n e g a t i v eb a c t e r i au s et oi n j e c te f f e c t o rp r o t e i n s i n t ot h ec y t o p l a s mo fe u k a r y o t i ch o s tc e l l s n o d u l a t i o no u t e rp r o t e i np n o p p a n d n o p lo fs t r a i nn g r 2 3 4a r et y p e3e f f e c t o r ss e c r e t e dv i at h et 3 s s t h ep r o t e i n sc a l l b ep h o s p h o r y l a t e db yp l a n tp r o t e i nk i n a s e si nv i t r o h o w e v e lt h e i rm o l e c u l a rf u n c t i o n i np l a n t sr e m a i n se l u s i v e i nt h i ss t u d y t h en o p pg e n ew a se x p r e s s e di ne s c h e r i c h i a c o l i r e c o m b i n a n t 6 x h i s t a g g e dn o p pp r o t e i n w a s p u r i f i e db ya f f m i t y c h r o m a t o g r a p h ya n du s e dt oi m m u n i z ear a b b i t t h ep r e p a r e da n t i n o p ps e r u m r e c o g n i z e dr e c o m b i n a n tn o p pf r o me c o l ia sw e l la sn a t i v en o p p 丘o ms u p e r n a t a n t s i i i o fr h i z o b i u ms p n g r 2 3 4c u l t u r e si n d u c e db yf l a v o n o i d s t os t u d yt h ee f f e c t so f n o p pi ns y m b i o s i s n o p pm u t a n t so fn g r 2 3 4w e r ec o n s t r u c t e da n dn o d u l a t i o nt e s t s w i t hh o s tp l a n t sw e r ep e r f o r m e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm u t a t i o no fn o p pl e dt oa r e d u c t i o ni nn o d u l en u m b e ro nt e p h r o s i av o g e l i ia n dp h a s e o l u sv u l g a r i s c v y u d o u n o 1 ad o u b l em u t a n tw i t hd e l e t e dn o p la n dn o p pg e n e si n d u c e df e w e rn o d u l e so n t e p h r o s i av o g e l i i w h i l ee n h a n c e dn o d u l a t i o no np h a s e o l u sv u l g a r i s c v y u d o un o 1 w a so b s e r v e d f u r t h e r m o r e n g r q n o p p d d am u t a n tw i t ht w om u t a t e da m i n o a c i d s e 1 3 9 d e 1 4 1 d w a sc o n s t r u c t e di no r d e rt oi d e n t i f ya m i n oa c i d sr e q u i r e df o r n o p pf u n c t i o n p r e l i m i n a r yr e s u l t ss h o w e dt h a tm u t a t i o no ft h e s et w oa m i n oa c i d r e s i d u e si nn o p ps l i g h t l y a l b e i tn o ts i g n i f i c a n t l y r e d u c e dt h en o d u l en u m b e ro nt h e h o s t 尸v u l g a r i s c v y u d o un o 1 t oi n i t i a t ew o r k o np h o s p h o r y l a t i o ns i t e so f n o p p n o p pw i t ha nn t e r m i n a l6 x h i st a gs e q u e n c ew a sc l o n e di n t ot h ev e c t o rp y e s 2a n d e x p r e s s e di ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew 3 0 3 a w h i c hw a su s e da sae u k a r y o t i c e x p r e s s i o ns y s t e m r e c o m b i n a n th i s t a g g e dn o p pp r o t e i nw a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e d h o w e v e r t h ee x p r e s s i o nl e v e l sw e r el o w f u t u r ee x p e r i m e n t sa l er e q u i r e dt oo p t i m i z e t h ee x p r e s s i o nc o n d i t i o n si no r d e rt oo b t a i ns u f f i c i e n ta m o u n t so fp h o s p h o r y l a t e d n o p pp r o t e i n k e y w o r d s r h i z o b i u ms p s t r a i nn g r 2 3 4 s y m b i o s i s t y p et h r e es e c r e t i o ns y s t e m t 3 s s n o d u l a t i o n o u t e rp r o t e i n p n o p p p h o s p h o r y l a t i o r t t e p h r o s i av o g e l i i p h a s e o l u sv u l g a r i s c v y u d o un o 1 n o d u l a t i o n s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew 3 0 3 a i v g e n e r a li n t r o d u c t i o n r h i z o b i a s o i l d w e l l i n g a a n d 1 3 p r o t e o b a c t e 最a i n d u c e t h ef o r m a t i o no f n i t r o g e n f i x i n gn o d u l e so nm a n yl e g u m i n o u sp l a n t si n c l u d i n gs o y b e a n s g l y c i n em a x c o m m o nb e a n s p h a s e o l u sv u l g a r i s p e a s p i s u ms a t i v u m a n da l f a l f a m e d i c a g o s a t i v a s o m er h i z o b i a s u c ha sr h i z o b i u ms p s t r a i nn g r 2 3 4 e v e nn o d u l a t et h e t r o p i c a ln o n l e g u m et r e ep a r a s p o n i aa n d e r s o n i i u l m a c e a e t h ee l mf a m i l y t r i n i c k a n dg a l b r a i t h 19 8 0 p u e p p k ea n db r o u g h t o n 19 9 9 d u r i n gn o d u l ed e v e l o p m e n t r h i z o b i aa r et r a n s f o r m e di n t ob a c t e r o i d s i nw h i c ht h en i t r o g e n a s ee n z y m er e d u c e s a t m o s p h e r i cn i t r o g e nt oa m m o n i a n i t r o g e ni st r a n s f e r r e dt ot h ep l a n ta sa m m o n i ao r i nt h ef o r mo fa m i n oa c i d s i nt u r n t h eh o s tp l a n tp r o v i d e se n e r g y o r g a n i ca c i d s a n d n u t r i e n t st ot h eb a c t e r o i d s e s t a b l i s h m e n to fs y m b i o s i sr e q u i r e ss i g n a le x c h a n g e b e t w e e nt h et w op a r t n e r s h o s tl e g u m e ss e c r e t ep h e n o l i cs u b s t a n c e s f l a v o n o i d s t h a t i n d u c et h es y n t h e s i so fb a c t e r i a ll i p o c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s c a l l e dn o df a c t o r s w h i c h a r ep e r c e i v e db yl y s mr e c e p t o rk i n a s e s n o df a c t o rr e c e p t o r s o ft h eh o s t l i m p e n s e ta 1 2 0 0 3 r a d u t o i ue ta 1 2 0 0 3 m a d s e ne ta 1 2 0 0 3 n o df a c t o rs i g n a l i n gi n d u c e s e x p r e s s i o no fs y m b i o t i ch o s tg e n e sr e q u i r e df o rn o d u l ef o r m a t i o n o n c et h eb a c t e r i a h a v ee n t e r e dt h er o o th a i r s a d d i o n a lr h i z o b i a ld e t e r m i n a n t sa r er e q u i r e dd e p e n d i n g o nag i v e ns t r a i n p l a n tc o m b i n a t i o n t h e s em o l e c u l e sd e t e r m i n i n gh o s t s p e c i f i c n o d u l a t i o ni n c l u d e s u r f a c ep o l y s a c c h a r i d e sa n dn o d u l a t i o no u t e rp r o t e i n s n o p s s e c r e t e db yr h i z o b i a lt y p et h r e es e c r e t i o ns y s t e m s t 3 s s b r o u g h t o ne ta 1 2 0 0 0 b a c t e r i a lt 3 s s sh a v eb e e ni n i t i a l l yi d e n t i f i e di na n i m a la n dp l a n tp a t h o g e n s b u t a l s oh a v eb e e nf o u n di na l li n c r e a s i n gn u m b e ro fr h i z o b i a i n c l u d i n gr h i z o b i u ms p v n g r 2 3 4 h e r e a f t e rn g r 2 3 4 f r e i b e r g e ta 1 19 9 7 v i p r e ye ta 1 19 9 8 m e s o r h i z o b i u ml o t im a f f 3 0 3 0 9 9 k a n e k oe ta 1 2 0 0 0 码b h u b b e re ta 1 2 0 0 4 o k a z a k ie ta 1 2 0 1 0 s f i n c h e ze ta 1 2 0 0 9 b r a d y r h i z o b i u mj a p o n i c u mu s d a l1 0 g 6 t t f e r te ta 1 2 0 01 k a n e k oe ta 1 2 0 0 2 a b b r a d y r h i z o b i u me l k a n i i o k a z a k i e ta 1 2 0 0 9 a sw e l la sr h i z o b i u mf r e 坊is t r a i n su s d a 2 5 7a n dh h l0 3 k r i s h n a ne ta 1 2 0 0 3 v i n a r d e l le ta 1 2 0 0 4 t 3s s sa r ed e v i c e st h a td e l i v e rt y p e3e f f e c t o rp r o t e i n s d i r e c t l yi n t oe u k a r y o t i cc e l l so rs e c r e t eh r pp r o t e i n si n t ot h ee x t r a c e l l u l a rm i l i e u p e r i n oe ta 1 1 9 9 9 r o s s i e re ta 1 1 9 9 9 t h ec o r es e c r e t i o ns y s t e mc o n s i s t so fa m i n i m a ls e to f10c o n s e r v e dg e n ep r o d u c t st h a t s p a nb o t h t h ei n n e r a n d o u t e r b a c t e r i a lm e m b r a n e h u e c k 19 9 8 ap i l u se s t a b l i s h e st h el i n kw i t hah o s tc e l l a n dap o r ei sf o r m e di nt h ep l a s m am e m b r a n eo ft h eh o s tc e l l h ee ta 1 2 0 0 4 e f f e c t o rp r o t e i n sw i t ha nn t e r m i n a ls e c r e t i o ns i g n a ls e q u e n c ea l et h e ns e c r e t e d t h r o u g ht h ep i l u sw i t h o u tp r i o rp r o t e o l y t i cc l e a v a g e g h o s h 2 0 0 4 m o s tt y p e3 e f f e c t o rp r o t e i n sa l ed i r e c t l yi n j e c t e di n t ot h e i rh o s tc e l l s b f r t n e ra n db o n a s 2 0 0 3 f o re x a m p l e t h eg e n e r ay e r s i n i as p c o m e l i s 2 0 0 2 r a l s t o n i as p c u n n a ce ta 1 2 0 0 4 p s e u d o m o n a ss p a n dx a n t h o m o n a ss p s e c r e t ea l la r r a yo fe f f e c t o r sv i at h e i r t 3 s si n t oe u k a r y o t i ch o s tc e l l s w h i t ee la 1 2 0 0 0 i np l a n t s r e c o g n i t i o no fs p e c i f i c t y p e3e f f e c t o r sm e d i a t e db yr e s i s t a n c e r p r o t e i n sm a yl e a dt oah y p e r s e n s i t i v e r e a c t i o n h r c e l ld e a t ha n da r r e s t e di n f e c t i o n b t i t t n e ra n db o n a s 2 0 0 3 m o u n t i n g e v i d e n c es u g g e s t st h a tr h i z o b i a lt y p e3e f f e c t o r sa l ea l s od e l i v e r e di n t ol e g u m eh o s t c e l l s t r a n s l o c a t i o no fr h i z o b i a lt 3 s se f f e c t o r si n t op l a n th o s tc e l l sh a sb e e nr e c e n t l y d e m o n s t r a t e df o rn o p e1a n dn o p e 2o f 丑j a p o n u mu s d a l10 w e n z e le ta 1 v i 2 0 1 0 i nt h i st h e s i s n o p po fr h i z o b i u ms p s t r a i nn g r 2 3 4w a se x p r e s s e di nec o l ia n da r a b b i ta n t i s e r u mw a sr a i s e da g a i n s tp u r i f i e dn o p pp r o t e i n p a r t1 m u t a n t si n n g r 2 3 4w e r ec o n s t r u c t e dt os t u d yt h ee f f e c t so f n o p po ns y m b i o t i ci n t e r a c t i o n sw i t h l e g u m ep h n t s p a r t2 f i n a l l y n o p pw a se x p r e s s e di ny e a s ti no r d e rt od e t e r m i n e p h o s p h r y l m i o ns i t e so f n o p p p a r t3 v l l 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独立进 行研究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果 对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式标明 本人完 全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 金协妄 日期 2 p 声年莎月岁日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有 权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版 和纸质版 有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆 院系资料室被查阅 有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索 可以采用复印 缩印或其他方法保存学位论文 入 亡移 学位论文作者签名 釜1 k 导师签名 c 巳 屯八 日期 2 p 矽年6 月岁日 中文简缩版 习i 妥 i 商 根瘤菌 一种生活在土壤中的a a n dp p r o t e o 细菌 在很多豆科植物上 包括 大豆 g l y c i n em a x 菜豆 p h a s e o l u sv u l g a r i s 豌豆 p i s u ms a t i v u m 以及紫花 苜蓿 m e d i c a g os a t i v a 诱导固氮性根瘤的形成 一些根瘤菌 比如根瘤菌 n g r 2 3 4 甚至能在热带非豆科植物叶山黄麻 p a r a s p o n i aa n d e r s o n i o 上结瘤 t r i n i c ka n dg a l b r a i t h 1 9 8 0 p u e p p k ea n db r o u g h t o n 1 9 9 9 在根瘤发育过程中 根瘤菌变成了类菌体 在类菌体中固氮酶将大气中的氮气还原成氨 氮气以氨或 者氨基酸的形式转移到植物中 反过来 宿主植物为类菌体提供能量 有机酸 和营养 共生的建立需要两者之间的信号交换 宿主豆科植物分泌酚类物质 类 黄酮 而类黄酮能诱导细菌脂质几丁质寡聚糖的合成 这种物质叫做结瘤因子 n o df a c t o r 能够被宿主的l y s m 受体激酶感知 l i m p e n se ta 1 2 0 0 3 r a d u t o i ue t a 1 2 0 0 3 m a d s e ne ta 1 2 0 0 3 结瘤信号因子诱导根瘤形成必须的宿主共生基因 的表达 然而一旦根瘤菌进入了根毛 就需要额外的其它决定因子 这些决定因 子依赖于特定的细菌植物组合 这些决定宿主特异性结瘤的分子包括表面多糖和 通过i i i 型分泌系统 t 3 s s 分泌出去的结瘤胞外蛋白 n o p s b r o u g h t o ne ta 1 2 0 0 0 细菌的i i i 型分泌系统开始是在动物和植物的病原菌上鉴定的 但是后来也在 一些根瘤菌上找到 包括根瘤菌n g r 2 3 4 r h i z o b i u ms p n g r 2 3 4 f r e i b e r ge ta 1 1 9 9 7 v i m ye ta l 1 9 9 8 百脉根慢生根瘤菌 m e s o r h i z o b i u mz d 盯m a f f 3 0 3 0 9 9 k a n e k oe la 1 2 0 0 0 a b h u b b e re ta 1 2 0 0 4 o k a z a k ie ta 1 2 010 s 细c h e ze ta 1 4 8 2 0 0 9 日本慢生根瘤菌 b r a d y r h i z o b i u mj a p o n i c u mu s d a l1 0 g 6 t t f e r te ta 2 0 0 1 k a n e k oe ta 1 2 0 0 2 如b 大豆慢生根瘤菌 b r a d y r h i z o b i u me l k a n i i o k a z a k i e la 1 2 0 0 9 以及快生型大豆根瘤菌 r h i z o b i u mf r e 疥is t r a i n su s d a 2 5 7a n d h h l 0 3 k r i s h n a ne ta 2 0 0 3 v i n a r d e l le ta 1 2 0 0 4 i i i 型分泌系统是一种把i i i 型效应因子直接注入到真核细胞中或者把h r p 蛋白分泌到胞外环境中的装置 p e r i n oe la 1 1 9 9 9 r o s s i e re la 1 1 9 9 9 核心分泌系统最少由1 0 种保守基因的产 物组成 这些产物横跨细菌的内膜和外膜 h u e c k 1 9 9 8 一种注射器样的结构 p i l u s 建立了细菌同宿主细胞之间的联系并且在宿主细胞的质膜上形成了一个 孔 h ee ta 1 2 0 0 4 带有n 端分泌信号的效应蛋白随后通过没有被先前的蛋白 酶裂解的菌毛分泌出来 g h o s h 2 0 0 4 大多数i i i 型效应蛋白被直接注入到它们 的宿主细胞中 b t i t t n e ra n db o n a s 2 0 0 3 例如 耶尔森氏菌属 y e r s i n i as p c o m e l i s 2 0 0 2 青枯菌属 r a l s t o n i as p c u n n a ee la 1 2 0 0 4 假单胞菌属 p s e u d o m o n a ss p 以及黄单胞杆菌属 x a n t h o m o n a ss p 通过它们的i i i 型分泌 系统 很多效应因子被分泌到真核宿主细胞中 w h i t ee ta 1 2 0 0 0 在植物中 通过抗性 r 蛋白介导的特定i i i 型效应因子的识别可能导致超敏反应 h r 细胞死亡和感染停止 b f i t t n e ra n db o n a s 2 0 0 3 更多的证据暗示根瘤菌i i i 型效 应因子是被直接注入到豆科宿主细胞中的 根瘤菌i i i 型效应因子在植物宿主细 胞中的定位近期已经在大豆慢生根瘤菌的n o p e l 和n o p e 2 蛋白上证明 w e n z e l e ta 1 2 0 1 0 本论文中 我们在大肠杆菌中表达了根瘤菌n g r 2 3 4 的n o p p 蛋白并且得到了 抗n o p p 蛋白的兔血清 第一部分 此外 我们还构建了根瘤菌n g r 2 3 4 的突 变体以研究n o p p 在根瘤菌n g r 2 3 4 同豆科植物共生中的作用 第二部分 最 4 9 后 我们在酵母中表达了n o p p 蛋白以研究它的磷酸化位点 第三部分 第一部分重组n o p p 蛋白在大肠杆菌中的表达以及抗 n o d p 兔血清的制备 卜1 摘要 n o p p 是分子量3 1 2k d 由根瘤菌n g r 2 3 4 的n o p p 基因编码的结瘤胞外蛋白 n o p p 是一个通过i i i 型分泌系统 t 3 s s 分泌的i i i 型效应因子 然而 对于它 的功能知之甚少 这里我们制备了n o p p 蛋白的检测工具一抗血清 n o p p 基因 被克隆到p e t 2 8 b 载体中并在大肠杆菌b l 2 1 d e 3 中表达 组氨酸 h i s 标记 的n o p p 重组蛋白通过带有镍离子的亲和层析柱被纯化 纯化了的组氨酸标记的 n o p p 蛋白被用来免疫兔子制各抗n o p p 的兔血清 蛋白免疫印记 w e s t e r nb l o t 分析显示n o p p 抗血清能够识别来自大肠杆菌的重组n o p p 蛋白 也能够识别来 自根瘤菌n g r 2 3 4 上清培养液中的天然n o p p 蛋白 制备好的抗血清将成为未来 研究n o p p 蛋白的有用工具 关键词 n o p p 根瘤菌n g r 2 3 4 i i i 型效应因子 p e t 2 8 b 大肠杆菌b l 2 1 d e 3 亲和层析 抗血清 1 2 引言 在大肠杆菌中表达细菌基因是一种获得重组蛋白的强有力的策略 目标基因能 够被克隆到p e t 质粒中并且在噬菌体t 7r n a 聚合酶强启动子的控制下 通过 在宿主细胞中提供t 7r n a 聚合酶来诱导表达 t 7 r n a 聚合酶非常活跃 在诱 导几小时后目标基因产物能够占据细胞总蛋白的5 0 以上 通过简单地降低诱导 剂的浓度便可降低表达水平 本研究中 我们使用了带有6 个组氨酸 h i s 标签的载体p e t 2 8 b 组氨酸标 记的融合蛋白可在完全变性的条件下被亲和纯化 这种完全变性条件尤其方便于 纯化以包涵体形式表达的蛋白 在本论文的第一部分 n o p p 基因被克隆到p e t 2 8 b 载体中并且在大肠杆菌 b l 2 1 d e 3 中表达 组氨酸 h i s 标记的n o p p 重组蛋白通过带有镍离子的亲 和层析柱被纯化 纯化了的n o p p 蛋白被用来免疫兔子制备抗血清 制备的抗血 清成为将来研究n o p p 蛋白的一个有用工具 1 3 材料和方法 1 n o p p 在大肠杆菌b l 2 1 d e 3 中的表达 将全长n o p p 基因 y 4 y p n c 0 0 0 9 1 4 克隆到原核表达载体p e t 2 8 b 上 构建了重组载体p e t 2 8 b n o p p 构建的重组载体进行d n a 序列测定确认 从大肠杆菌d h 5 a 细胞中提取质粒 p e t 2 8 b n o p p 和p e t 2 8 b 并分别转化进大肠杆菌b l 2 1 d e 3 细胞中 挑取带有 质粒p e t 2 8 b n o p p 和p e t 2 8 b 的大肠杆菌b l 2 1 d e 3 单克隆 在5 毫升含有5 0 微克 毫升卡那霉素的l b 培养基中3 7 c 过夜培养 然后分别加入到5 0 0 毫升含 有5 0 微克 毫升卡那霉素的新鲜l b 培养基中3 7 c 扩大培养 当o d 6 0 0 达到约0 6 时 加入1m m 终浓度 的i p t g 并在2 7 下诱导生长8 小时 最后 菌液在 4 0 0 0g 条件下离心2 0 分钟以收集菌体 这些菌体将用来纯化n o p p 蛋白 2 重组蛋白的纯化 重组蛋白的纯化 参照n o v a g e n 公司产品说明书 利用 镍柱亲和层析的方法纯化带有6 个组氨酸标签的蛋白 3 n o p p 抗体的制备 在大肠杆菌b l 2 1 d e 3 细胞中表达全长的n o p p 蛋白 用经过镍柱纯化并进一步割胶纯化的蛋白作为抗原 免疫新西兰兔子制备多克隆 抗体 免疫步骤如下 d a y1 将1 0 0 微克抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后 在兔子背部分4 6 点皮内 注射 d a y2 9 用含抗原1 0 0 微克的弗氏不完全佐剂进行加强免疫 d a y4 5 加强免疫 d a y6 9 耳静脉取血 血液先于3 7 c 放置3 0 分钟 然后置于4 c 过夜 8 0 0 0 转 离心5 分钟 收集血清 4 蛋白免疫印记 w e s t e r nb 1 0 0 为了检测n o p p 蛋白样品通过s d s p a g e 分离后 转移到硝酸纤维素膜上 一抗 抗n o p p 血清 温育l 小时 二抗 h r p 标记的羊抗兔抗体 温育1 小时 洗膜后最后用d a b 试剂盒显色 1 4 结果 1 重组h i s n o p p 蛋白的纯化 携带有p e t 2 8 b n o p p 质粒的大肠杆菌b l 2 1 d e 3 被用来提取h i s n o p p 重组蛋 白 图1 显示纯化得到了相当多的h i s n o p p 蛋白 k db ie 2e 3e 4m e 5 e 6e 7 e 8 9 8 6 6 2 4 5 3 l 一 2 0 1 4 一 酗1 火肠杆苗b l 2 1 d e 3 中h i s n o p p 蚩白的纯化 f 嘻ip u d f i c a t i o no f n o p pf r o m2 0 0 m jc u l t u r eo f ec o i lb l 2 1 d e 3 c a n y n gp e t 2 8 h n o p p e l 髓 e 3 e 4 e 5 e 6 e 7a n d e 8 f e p r 匹e 1 3 t 0 5 m l f t a e d o n so fp r o t e i n se l u t e d f r o m t h e n i n t a b e a d s 州mb u f f e re s e ei 3 9 a n ds e p a r a t e db ys d s p a g e1 0 山f r o me a c hf r a c i i o nw e r e l e a d e d o f f r o t h e 酬m m o l e c u l a r w e i g h t i l l a f k e f 2 制备的n o p p 抗血清能够识别来自大肠轩菌的h i s n o p p 重组蛋白 纯化了的6 个组氨酸标记的n o p p 蛋白用来免疫兔子 制备的n o p p 抗血清能特 异地识别来自大肠杆菌b l 2 1 d e 3 的h i s n o p p 重组蛋白 图2 2mk d 幽2 韶备的n o p p 抗血清同h i s n o p p 重组蛋白识别的蛋白免疫分析 f 嘻2w c s t m nb l o ta n a l y s i so f h i s n o p p w i t h t h e 删a n t i n o p ps e r u m l a n e l p c o t e i m f l o r a 五c o i b l 2 1 d e 3 c o m 酊m 曙t h ee m p t y w 咖p e t 2 9 b n e g a t i v ec o r 灯0 1 l a n g2 s o t e i m p u r i f i e d e c o i l b l 2 1 d e 3 c o n t a i n l n g p e t 2 8 b n o p p l a n e m m o l e c u l a rw e i g h m a r k e r s 3 制备的n o p v 抗血清能够识别来自根瘤菌n g r 2 3 4 的天然n o p p 蛋白 经过类黄酮诱导之后 根瘤菌n g r 2 3 4 的n o p p 蛋白通过i n 型分泌系统被分 泌出来并且能在上清中被检测到 a u s m 髓s 吖越 2 0 0 4 s k o r p i le t 9 1 2 0 0 5 为了 检测制各的抗血清是否能识别经类黄酮诱导的根痼苗n g r 2 3 4 分泌出的天然 n o d p 蛋白 我们提取了根瘤菌n o r 2 3 4 和一种i i i 型分泌系统缺失的突变苗 n g r d r h e n 阴性对照 的分泌蛋白进行蛋白免疫检测 实验结果显示制备的 n o p p 抗血清能够识别根瘤菌n g r 2 3 4 分泌的天然n o p p 蛋白 图3 2m k d 一9 8 6 62 2 0 图3n o p p 抗血清同根瘤苗n g r 2 3 4 分泌的大然n o p p 蛋白识别的免疫检测 f i g 3i m m u n o d e t e c l i o no fn o p ps 一 t e db yr h 自o m 蜊s pn g r 2 3 4w i t ht h ep r e p a r e d a n t i n o p ps e t l i r al a n e1 s e c r e t e dp r o t e i mf r o mt h ac u l t u r es u p e r n a t a n t c o r 瞒p 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