（微生物学专业论文）烟草（nicotiana+tabacum）中dreb转录因子的克隆及功能分析.pdf

m i c r o a r r a y 3 a t a b a a b i 迮 b h l h b z i p b s a c b f d m s o d r e d r e b e b e d t a e m s a e r f g s t i p t g j a p a g e p d i p e g r t p c r a c t i n s d e s t b i a s t g e n o m ew a l k i n g n m r d o m a i n s w a p p i n g 主要符号对照表 微阵列技术 3 氨基 1 2 4 一三唑 脱落酸 脱落酸应答元件 碱性螺旋 环 螺旋 锌指结构域 牛血清白蛋白 c r t 结合蛋白 二甲基亚砜 脱水应答元件 脱水应答元件结合因子 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 凝胶滞留 乙烯应答元件结合因子 谷胱甘肽一s 转移酶 异丙基 3 d 一硫代半乳糖苷 茉莉酮酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质二硫键异构酶 聚乙二醇 逆转录酶 多聚酶链式反应 肌动蛋白 合成缺陷型培养基 表达序列标签 局部序列比对检索工具 基因组步查 核磁共振技术 结构域交换 河南农业大学学位论文独创性声明 使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 文题目 烟草 n i c o t i a n at a b a c u m 中d r e b 转 录因子的克隆及功能分析 学位 级别 导师 姓名 硕士 学生 姓名 学位论文 是否保密 冯锋 i 喜翌l 微生物学 陈红歌 刘卫群 如需保密 解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果 除了文中 特别加以标注和致谢的地方外 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果 也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料 指导教师对此进行了审定 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明 并表示了谢意 特此声明 研究生签名 7 舛导师签名 7 专多嵋砍 日期 刀谚年 月眵日 日期 游歹月砂如 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存 使用学位论文的规定 即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本 并提供目录检索和阅览服务 可以采用影印 缩印或扫描等 复制手段保存 汇编学位论文 本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 本人完全了解 河南农业大学知识产权保护办法 的有关规定 在毕业离 开河南农业大学后 就在校期间从事的科研工作发表的所有论文 第一署名单 位为河南农业大学 试验材料 原始数据 申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有 否则 承担相应的法律责任 注 保密学位论文在解密后适用于本授权书 研究生签名 导师签名 柞7 z 歌 日期 腓f 月哆日 日期 哗f 月谚日 矬圜 醐力g v 6 月2 7 日 致谢 转眼间 三年充实难忘的硕士研究生生活即将结束 我也将迈入新的人生征途 三年来 两位导师陈红歌副教授和刘卫群教授对我生活上的关怀和学业上的指导使 我感激不尽 陈老师以严谨的治学态度 宽厚的处世方式言传身教 使我受益匪浅 我的研究论文是在刘卫群教授悉心指导下完成的 整个过程倾注了她大量的心血和 汗水 导师对科学的奉献精神及精益求精 一丝不苟的科研态度给我树立了很好的 榜样 并鞭策我不断前进 同时非常感谢刘老师为我提供的去清华大学学习这样一 个来之不易的机会 学习期间 恩师的理解 关怀和支持使我倍感温暖和亲切 三 年来 我的每一步成长和每一点进步都凝结着两位导师的辛勤汗水和殷切期望 在 此致以衷心的感谢和真挚的祝福 愿您们身体健康 万事如意 实验的主要部分是在清华大学生物科学与技术系分子酶学实验室完成的 感谢 周海梦教授提供了设施齐全技术优越的实验条件 感谢美国德克萨斯西南医学研究 中心的赵同金博士在具体试验操作中给予的耐心指导和关心 感谢实验室的陈钊 高岩嵩 陈哲 李杰等同学 和他们并肩战斗的日子是紧张充实而美好的 他们营 造的友爱互助的氛围常常使我感到宾至如归 感谢清华大学植物分子生物学实验室的刘玉乐教授 通过平时和他的交流讨论 我学到了很多前沿知识 增长了见识 在课题研究过程中 也得到了他的指导和帮 助 他那亦师亦友 平易近人的风范使我印象深刻 感受颇深 感谢河南农业大学生命科学学院的领导和微生物学导师组的所有老师在学习生 活方面给予的关怀 帮助和支持 在生科院的七年时光是我人生中永远难忘的美好 记忆 感谢工程楼1 2 0 4 室的各位兄弟姐妹在实验材料和工作生活等方面所给予的关 心及帮助 感谢生命科学学院2 0 0 5 级全体硕士研究生同学和朋友 感谢同宿舍的兄 弟 三年中我们一起分享快乐 一起承受痛苦 在失望与希望中不断进步 从他们 身上我汲取了很多科研的智慧和人生经验 我将永远怀念那段一起走过的日子 祝 大家一帆风顺 前程似锦 由衷感谢我的舅舅一家人所给予的物质和精神上的支持与无私的帮助 从我上 学以来 他们就不断的支持我 鼓励我 是像我父母一样的亲人 没有他们的关爱 也就没有我的今天 在此致以最诚挚的敬意和无以言表的深深感谢 感谢我那大爱无言的父母 他们用最无私的爱养育了我 用自己微薄的力量 辛勤地劳动支持着我 父母宽厚博大的血脉亲情是我完成学业 不断进取的强大后 盾和动力源泉 衷心祝愿二老永远健康幸福 感谢我的妹妹在学习和生活上的支持 与照顾 希望她永远开心快乐 最后 向所有给予我关心 帮助和支持的亲人 老师 同学和朋友致以最衷心 的感谢 冯锋 2 0 0 8 年6 月于郑州 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 摘要 干旱 高盐 低温等逆境胁迫是影响植物生长发育和品质形成的主要环境因素 d r e b 是植物中特有的一类转录因子 在植物的逆境胁迫应答中发挥着非常重要的作用 本研究利 用生物化学和分子生物学的手段从普通烟草品种k 3 2 6 n i c o t i a n at o b a c c u m 中分离克隆到新 的d r e b 转录因子基因 对其功能进行了初步探讨 有助于进一步揭示d r e b 家族的调控 机制 为以后利用其改良烟草综合抗逆性提供了研究基础 本论文通过g e n o m ew a l k i n g 的方法 从烟草中克隆到四个d r e b l i k e 基因 分别命名 为n t d r e b i n t d r e b 2 n t d r e b 3 n t d r e b 4 序列分析发现它们具有典型的a p 2 e r e b p 家族结构特征 进化树分析结果表明四个基因均属于d r e b 亚族 n t d r e b i 与油菜 b n d r e b 2 同源性很高 n t d r e b 2 n t d r e b 3 和n t d r e b 4 与番茄l e c b f i 和烟草 n t a c r e i l l b 同源性较强 e r f a p 2 结构域比对发现 n t d r e b 4 在e r f a p 2 的第1 l 位氨基 酸残基处是a s n 而其它的转录因子在该位则是保守的a s p 和g l y 基因表达模式分析表明 四个基因都强烈的受冷胁迫诱导 同时n t d r e b 4 还受干旱 高盐和乙烯诱导 酵母单杂交结果显示 n t d r e b i 能够特异性结合d r e 元件并激活下游基因表达 n t d r e b 2 n t d r e b 3 只能结合d r e 元件不具有激活功能 而n t d r e b 4 却不能与d r e 元 件结合 将n t d r e b i 与b n d r e b 2 1 n t d r e b l a 与a t d r e b l a 的氨基酸序列进行比对发 现 处于转录调控区的第1 4 8 位氨基酸有所不同 采用定点突变方法进一步研究表明d r e b l a 类转录因子的第1 4 8 位氨基酸残基与其邻近氨基酸残基的相互作用对调控转录激活功能起 关键作用 利用构建的p d i 融合表达系统 通过n i n t a 提取并纯化了高度可溶的n t d r e b p d i 融合蛋白 进行凝胶滞留分析表明 n t d r e b 2 和n t d r e b 3 能够特异性的结合d r e 元件 而n t d r e b 4 既不能与d r e 元件结合也不能与g c cb o x 元件结合 由于n t d r e b 4 的 e r f a p 2 结构域的第l l 位氨基酸残基与其它转录因子有差别 因而通过定点突变和酵母单 杂交结果表明e r f a p 2 结构域中l o o p 上的第1 1 位的甘氨酸和天冬氨酸对于d r e b 结合d r e 元件及维持e r f a p 2 结构域的稳定构象是必需的 关键词 烟草 d r e b 酵母单杂交 凝胶滞留 关键氨基酸 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 1文献综述 1 1 植物在逆境胁迫下的基因表达 在周围环境的胁迫下 植物不仅会产生出各种生理和生化上的变化 还会在分子和细胞 水平上做出一系列的应答 例如在干旱 高盐和低温等处理过程中 植物中的大量基因会被 这种非生物胁迫所调控 l 2 使用m i c r o a r r a y 技术 发现了大量参与胁迫应答与逆境适应的 基因 2 3 这类基因可以分为两类 第一类主要参与了逆境的适应 如分子伴侣 l e a 蛋白 渗透溶质合成酶等 第二类主要参与了胁迫反应中的基因表达与信号传导 包括蛋白激酶 转录因子和磷脂代谢酶 分子生物学与基因组学已经发现在胁迫反应的基因表达中存在着多 种不同的转录调控系统 而且许多不同类型的顺式作用元件和反式作用因子已经被证明参与 了胁迫应答中的转录调控 受胁迫诱导的基因的启动子中含有相应的顺式作用元件 在多种 转录因子的参与下 其可以在逆境条件下调控该基因的表达 因此可以说顺式作用元件在逆 境胁迫信号通路中起到了分子开关的关键作用 1 1 1 a b r e 介导的a b a 依赖的信号通路 植物应答非生物胁迫反应可分为依赖于脱落酸 a b a 合成和不依赖于a b a 合成的两 条信号通路 u a b a 是以异戊二烯为基本结构单位所组成的1 5 碳的倍半萜烯化合物 分 子式c 1 5 h 2 0 0 4 a b r e 是a b a 依赖的信号通路中主要的顺式作用元件 具有保守的 p y a c g t g g c 序列 4 然而仅仅含有一个a b r e 并不能有效地介导a b a 诱导的信号通路 只有两个a b r e 或a b r e 与一个含有a g c g t 的元件 如c e i c e 3 偶联才发挥功能p 8 j 使用酵母单杂交筛选克隆得到了a b r e 结合因子 a r e b a b f 其编码一个b z i p 转录 因子 能结合到a b r e 元件并激活了依赖于a b a 合成的基因表达 8 9 j 而a r e b a b f 蛋白 的激活同样需要a b a 介导的信号的参与 比如依赖于a b a 的磷酸化过程 最近发现 一 些s n p k 2 型的蛋白激酶是受a b a 激活的蛋白激酶 其可以介导气孔孔径的调节并在a b a 应答的上游过程中发挥功能 1 0 n 这些激酶可能磷酸化并激活了a r e b a b f 蛋白 1 2 j 组成型表达的a b f 3 或a b f 4 a r e b 2 转基因拟南芥造成了对a b a 的超敏化 降低了 蒸腾作用 并增加了干旱耐受 l3 1 a b f 2 a r e b l 还是蔗糖信号通路中的重要因子 其过量 表达不仅改进了植物的对干旱的耐受能力 并且加强了对热和氧化的耐受能力 l 4 1 1 1 2 依赖a b a 的信号通路中的其它顺式作用元件 在一些依赖于a b a 调控的胁迫诱导基因的启动子中并没有发现a b r e 元件 例如受干 旱诱导的r d 2 2 基因 它受a b a 的调控并伴随a b a 的合成 l 钉 然而其启动子区域并没有 a b r e 元件存在 r d 2 2 基因受干旱诱导表达的过程是通过其启动子区域中的m y c 和m y b 识别序列发挥作用的 1 6 一种类m y c 的b h l h 转录因子 a t m y c 2 和一种m y b 转录因 子 a t m y b 2 结合到这些顺式作用元件并共同激活了r d 2 2 基因的表达 这些转录因子是 在内源的a b a 聚集后被合成的 因此它们在胁迫应答的后期才发挥功能 m 最近发现 a t m y c 2 还在拟南芥中的茉莉酮酸 j a 调控的防御反应中发挥作用 因此认为a t m y c 2 2 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 可以结合不同的m y c 位点 从而在a b a 和j a 介导的信号通路的信号交叉中起作用 1 7 1 1 3 在非生物胁迫中的不依赖于a b a 的信号通路 r d 2 9 a c o r 加以及l t l 7 8 基因可以被干旱 低温和a b a 诱导表达 它们可以被依赖 于a b a 和不依赖于a b a 合成的信号通路同时调控 使用删除和碱基取代的方法发现了 r d 2 9 a 的启动子中存在着保守的t a c c g a c a t 序列 将其命名为脱水应答元件 d r e l8 其介导了r d 2 9 a 的不依赖于a b a 的干旱和低温诱导 与a b r e 不同的是 d r e 并不需要 其它辅助元件的参与即可发挥功能 并且在许多受干旱 低温诱导的基因的启动子区域均有 分布0 1 9 l 相似的顺式作用元件 如c r t l t r e 与d r e 一起组成了以a g c c g a c 为核 心序列的d r e c r t 顺式作用元件 其调控了受低温诱导的基因的表达 l 2 0 2 1 一些受干旱诱导的基因并不受低温和a b a 的诱导 这暗示在脱水应答反应中可能存在 着其它的不依赖于a b a 的信号通路 比如受干旱和黄化诱导的e r d l 基因 其启动子中存 在这两个离散的顺式作用元件 一个是类m y c 的c a t g t g 序列 另一个是1 4b p 的类r p ss i t e 1 序列 而这两个顺式作用元件对e r d l 基因的表达都是必需的口乃j 1 1 4 胁迫应答反应中不同顺式作用元件介导的信号交叉 许多受胁迫诱导的基因表达都是通过不同的信号通路来进行调控的 不同类型的顺式 作用元件之间的相互作用导致了不同通路之间的信号交叉 一个典型的例子就是r d 2 9 a 的 启动子含有四个d r e 元件和一个a b r e 元件 其中的一个d r e 元件作为a b r e 的偶联元 件而发挥作用 它们在a b a 诱导的基因表达过程中组成了a b a 应答复合体 2 4 这说明在 胁迫诱导的启动子中存在着d r e 与a b r e 元件的信号交叉 图1 1 总结了拟南芥在不同逆境胁迫下的基因表达与信号通路瞄j 各种介导逆境胁迫 信号通路的顺式作用元件总结在表1 1 中瞄j j e p e n d e n 五z 1 7 j 1 w a y 锰 甲 1 一 一一 一 彭r 耽r t 7 l 跫 醪 垂哆 s t r e s st o l e r a n c e 翳蚤 图1 1 拟南芥在不同逆境胁迫下的基因表达与信号转导通路 f i g 1 1g e n e se x p r e s s i o na n ds i g n a lp a t h w a y so fa r a b i d o p s i st h a l i a n ai nr e s p o n s et od i f f e r e n te n v i r o n m e r a a l s t r e s s e s 3 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 图中 控制胁迫诱导基因表达的转录因子用椭圆表示 在胁迫应答的转录过程中的顺式作用元件用方块表 示 黑色圆圈代表应答信号通路中转录因子的修饰后激活 如磷酸化 早期表达的基因出现在图的上方 而晚期表达的基因出现在图的下方 实线表示主要的信号通路 而间隔线表示蛋白 蛋白之间的相互作用 表1 1逆境胁迫信号通路中的各种顺式作用元件 2 习 t a b 1 1d i f f e r e n tc i s e l e m e n t so f s i g n a lp a t h w a y si nr e s p o n s et oe n v i r o n m e n t a ls t i e s 5 e 1 2a p 2 e r e b p 类转录因子 1 2 1 e f u f a p 2 结构域的发现 早在1 9 9 4 年 j o f u k u 等使用t d n a 插入变异的方法从拟南芥中克隆到了a p e t a l a 2 基因 简称a p 2 它是一个与花发育相关的基因嘲 同时它也是a p 2 e r e b p 家族的第一 个成员 a p 2 蛋白的一个重要的特征是含有一个由6 8 个残基重复组成a p 2 结构域 之后 在许多植物基因中发现了与a p 2 结构域高度同源的结构 比如e r e b p a t e r f t i n y d r e b l a 等口 3 0 1 故将这一类蛋白称为a p 2 e r e b p 家族 其所含有的保守的d n a 结合结 4 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 构域称为e r f a p 2 结构域 3 1 3 2 它是一类植物转录因子中特有的结构域 而在动物 酵母 与真菌中并不存在 2 7 3 3 1 a p 2 e r e b p 类转录因子结构特征为均含有与顺式作用元件相结合的e r f a p 2 结构域 这类转录因子中包括一系列与植物发育和胁迫耐性相关的转录因子 在植物的生理反应中发 挥着重要的作用 其中一些参与了植物发育过程的调节 如花和种子的发育 2 6 胚珠和花 的生长 3 4 3 5 1 以及叶表皮细胞的形成 3 6 另一些则是植物应对各种生物及非生物胁迫反应中的 关键调控因子 1 9 3 7 对a p 2 e r e b p 类转录因子的分类 结构及功能的研究已成为植物分子 生物学 植物生物化学等研究领域的热点 1 2 2a p 2 e r e b p 转录因子的结构特征 a p 2 e r e b p 转录因子含有保守的e r f a p 2d n a 结合结构域 先前认为e r f a p 2 结构 域序列可以分为两个部分 即位于n 端的约2 0 个氨基酸残基组成的y r g 元件和位于c 端 的约4 0 个氨基酸残基组成的r a y d 元件 r a y d 元件内的序列被预测折叠形成两亲的 a h e l i x 其功能可能为d n a 结合区域或与其它蛋白相互作用的区域 2 7 1 但是最近通过n m r 解析出的拟南芥a t e r f l 的e r f a p 2 结构域 g c cb o x 三维结构却显示 该结构域由3 条反 平行的 3 s h e e t 和一个a h e l i x 组成 如图1 2 所示 而a h e l i x 与 3 s h e e t 位置大致相平行 这与已知的锌指d n a 结合结构域的拓扑结构是相一致的 而与锌指结构域不同的是 e r f a p 2 结构域的p s h e e t 中的精氨酸和色氨酸残基直接与d n a 大沟中的7 个连续碱基 a g c c g c c 相互接触 同时还与磷酸骨架相结合 3 s 因此 a p 2 e r e b p 转录因子是通 过三条1 3 s t r a n d 与d n a 元件相结合的 由于在e r f 结构域中与g c cb o x 直接相互作用的 氨基酸残基并不存在于a p 2 结构域中 因此推测a p 2 结构域可能以一种不同于e r f 结构域 的方式结合d n a 元件 j 游 3 图1 2e r f a p 2 结构域与g c cb o x 元件复合体的结构 3 8 f i g 1 2 t h ec o m p l e xs t r u c t u r eo f e r f a p 2d o m a i nw i t hg c cb o xe l e m e n t 另外 一般认为 a p 2 e r e b p 类转录因子的n 端含有富含碱性氨基酸 精氨酸和赖氨 5 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 酸 的核定位信号区域 在e 眦p 2 结构域之外 还含有转录调控区域 如富含丝氨酸 天冬氨酸和谷氨酸的激活区域 2 8 1 值得一提的是 在e r f a p 2 结构域之外 各类a p 2 e r e b p 转录因子的同源性很低 这应该与e r f a p 2 结构域在植物系统中的进化历程有着密切的关 系 另外 是否各类a p 2 e r e b p 转录因子的e r f a p 2 结构域以相同的方式结合d n a 元件 还需要更多x r a y 或n m r 结构的支持 1 2 3 e f u f a p 2 结构域的分类 在从拟南芥中克隆到a p 2 e r e b p 类转录因子之后 又相继从烟草 水稻 大麦 玉米 油菜等多种植物中克隆到了含有e r f a p 2 结构域的转录因子 这说明a p 2 e r e b p 类转录因 子在单 双子叶植物系统中均有分布 随着a p 2 e r e b p 家族成员数量的增加 有必要对其 进行系统的分类研究 表1 2 含有e r f a p 2 结构域的拟南芥基因分类 3 9 1 t a b 1 2t h ec l a s s i f i c a t i o no fg e n e sc o n t a i ne r f a p 2d o m a i ni na r a b i d o p s i st h a l i a n a 6 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 对拟南芥基因组中编码e r f a p 2 结构域的转录因子的1 4 4 个基因进行序列比对发现 可以按照d n a 结合结构域的相似性将它们划分为5 类 即a p 2 亚家族 r a v 亚家族 d r e b 亚家族 e r f 亚家族和a l 0 7 9 3 4 9 基副3 9 1 如表1 2 和图1 3 所示 e r fs u b f a m i l y a p e t a l a 2s u b f a m l 啊 图1 3a p 2 e r e b p 类转录因子的系统分类图i 1 f i g 1 3s y s t e mc l a s s i f i c a t i o no f a p 2 e r e b p 仃a 1 1 s c r i p t o nf a c t o r s a p 2 亚族的转录因子含有两个e r f a p 2 结构域 它们主要参与植物的花及其它相关发 育调控 这类转录因子包括a p e t a l a 2 2 6 1 a i n t e g u m e n l a a n t 3 4 3 5 并 ig l o s s y1 5 3 6 1 p a v 亚族的转录因子包括凡w l 和r a v 2 其含有两个d n a 结合区 即一个e r f a p 2 结构域和一个b 3 结构域 4 0 1 其中b 3d n a 结合结构域在v p l a b l 3 同源蛋白中是保守的 4 1 1 2 0 0 4 年解析出的b 3d n a 结合结构域的结构表明 其由7 条d 折叠桶和2 个短的0 h e l i x 组 成 这与核酸内切酶e c o ri i 的d n a 结合结构域非常相似 4 2 4 3 1 d r e b 亚族的转录因子仅含一个e r f a p 2 结构域 主要负责植物对低温 干旱及高盐 的分子应答 i 1 9 4 4 4 5 能够识别d r e c r t 元件 其核心序列为a g c c g a c t 2 8 4 6 4 8 其中第 3 4 6 位的c g 和c 对于与d r e b 蛋白的结合非常重要 代表基因为d r e b i a c b f 3 和 d r e b 2 a 1 2 8 4 射 e r f 亚族的转录因子同样只含有一个e r f a p 2 结构域 包括很多乙烯应答元件结合因 7 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 子 e r f 3 3 3 7 其主要负责植物对激素 乙烯 病原的分子应答 还与植物的抗逆调控 有关 4 9 1 能够特异性的识别以a g c c g c c 为核心序列的g c cb o x 元件1 2 9 5 0 其中第2 5 7 位的g g 和c 对于与e r f 蛋白的结合非常重要 对于只含有一个e r f a p 2 结构域的d r e b 与e r f 亚族 其e r f a p 2 结构域中均含有 一个保守的w l g 序列 根据序列的同源性比对 分别将d r e b 与e r f 亚族分为a 1 一a 6 亚 组和b i b 6 亚组 表1 2 其中 所有d r e b 亚族 a i a 6 在e r f a p 2 结构域的1 4 位氨 基酸均为v a l 残基 而e r f 亚族 b 1 b 6 中的绝大部分该位置为a l a 残基 1 4 1 9 位氨基 酸为a a e i r d a 1 亚组的d r e b i c b f 的1 4 1 9 位氨基酸为v c s e v l r e a 2 亚组的d r e b 2 的1 4 1 9 位氨基酸为v a e i r e 这两类因子可以结合d r e c r t 元件 其中c b f l d r e b i b 和d r e b 2 a 又可以结合g c cb o x 元件 3 9 5 1 a 3 亚组的a b l 4 a 4 亚组的硎y a 5 亚组 的r a p 2 1 r a p 2 9 r a p 2 1 0 以及a 6 亚组的r a p 2 4 的d n a 结合特异性还不清楚 最近 发现 拟南芥中的一个类n n y 蛋白 t i n y 2 既可以结合d r e 元件又可以结合g c cb o x 元件 5 2 而玉米中的a b l 4 可以结合a b a 和糖应答基因启动子中的以c a c c g 为核心序列 的c e 1 元件 b i b 3 亚组的e r f 蛋白可以结合g c cb o x 元件 这包括e r f l a t e b p a t e r f 1 至a t e r f 5 而关于b 4 b 6 的e r f 的d n a 结合特异性还不太清楚 其中属于b 5 类的烟草中的t s i l 既可以结合g c cb o x 又可以微弱结合d r e 元件 5 4 1 绝大部分d r e b 与e r f 基因内部无内含子存在 在拟南芥中仅发现b 6 亚组中有4 个 e r f 基因内部存在内含子 这为揭示e r f a p 2 结构域的进化提供了一些线索 1 2 4e r f a p 2 结构域的起源与进化 传统认为a p 2 结构域是一类植物中特异存在的结构域 在动物 真菌等其它生物类型 中并不存在 而其它d n a 结合结构域 如b h l h m a d s h o m e o 和锌指结构域 在植物 与动物的基因组中均有分布p 因此就产生了a p 2 结构域是如何产生与进化的这一问题 最近的研究表明 在t e t r a h y m e n at h e r m o p h i l a 四膜虫的纤毛中 发现了一类编码一个双功能 蛋白的基因家族 该蛋白中含有一个位置特异的核酸内切酶和一个a p 2 结构域 5 6 1 之后搜 索非植物的核酸序列发现在c y a n o b a c t e r i u me r y t h r a e u m 蓝藻和e n t e r b a c t e r i ap h a g er b 4 9 b a c t e r i o p h a g e f e l i x o l 病毒中同样存在着a p 2 同源蛋白 而且蓝藻的a p 2 结构域更偏向结合 p o l y g p o l y c 元件 这与大部分植物系统中的a p 2 结构域结合富含g c 的d n a 元件是 相一致的 5 7 由此推测 在纤毛虫或细菌中的h n h a p 2 基因发生了横向迁移而进入了植物 系统 这与绝大部分a p 2 e r e b p 基因中不含内含子这一事实是相一致的 而这一横向迁移 过程可能发生在古蓝藻内共生成为叶绿体的进化过程中 其后 具有危害的核酸内切酶基因 被宿主细胞清除 而a p 2 结构域则完成了从原核生物到现代植物系统的转变p 习 然而 现 有的非植物系统的a p 2 蛋白还为数很少 这方面的研究工作也很有限 如何从蛋白水平研 究a p 2 结构域的进化过程将会成为将来研究的一个热点 8 烟草 n i c o t i a n aw b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 1 3d r e b 类转录因子及d r e 介导的信号通路 1 3 1d r e 元件及d r e b 转录因子 拟南芥中的r d 2 9 a 基因可以被干旱 低温 高盐和外源的a b a 诱导 但是干旱诱导 的r d 2 9 a 的表达呈现出两相的动力学过程 经分析发现 r d 2 9 a 的快速表达不受外源a b a 诱导 对r d 2 9 a 的启动子区域进行分析发现 其含有两个2 0b p 的重复序列 每个重复序 列中均含有9b p 的t a c c g a c a t 片段 将其称为d r e 元件 脱水应答元件 核心序列为 c c g a c l l 8 1 在拟南芥中受低温诱导的c o r l 5 a 基因的启动子序列中 发现也有与d r e 元件 极为相似的序列 1 g g c c g a c 将其称为c r t c r e p e a t 元件 z 们 最近 通过m i c r o a r r a y 的分析确定了d r e b l a 下游的3 8 个基因 分析这些基因的启动子发现 从一5 l 到 4 5 0 处存 在保守的a g c c g a c n t 的d r e 序列垆引 在发现d r e 元件之后 s t o c k i n g e r 等首先使用酵母单杂交的方法克隆到了一个与 d r e c r t 结合的蛋白 将其命名为c b f l c r t 结合因子1 它含有保守的e r f a p 2 结构 域 4 8 1 同时 l i uq 等独立的利用酵母单杂交的方法分别从低温诱导和干旱诱导处理的拟南 芥中克隆到了3 个与d r e 元件结合并能在低温诱导下激活其下游连接的g u s 报道基因表达 的转录因子 分别命名为d r e b i a c b f 3 d r e b l b c b f l 和d r e b i c c b f 2 同 时克隆得到了两个与d r e 元件结合 并能在干旱 高盐胁迫下激活其下游连接的g u s 报道 基因表达的转录因子 将其命名为d r e b 2 a 和d r e b 2 b d r e b l 类基因受冷诱导表达 但 它们不受a b a 的诱导 d r e b 2 类基因受干早或高盐诱导表达 同样不受a b a 的诱导 2 引 将d r e b i a 和d r e b 2 a 转基因到拟南芥当中 d r e b l a 的组成型超表达提高了植株对干旱 高盐和低温的耐受性 2 8 刮1 而d r e b 2 a 的组成型超表达却只能引起下游基因的微弱表达 而且没有出现明显的抗逆性状1 2 引 这些结果暗示 d r e b 2 类的转录因子功能的发挥可能还 受到翻译后修饰的调控l l 引 之后又发现了拟南芥中的一个与c b f d r e b l 高度同源的蛋白 将其命名为c b f 4 同已经报道的c b f i 3 不同的是 c b f 4 基因不受低温的诱导 而受干旱的诱导 同时 c b f 4 还受外源a b a 的诱导 转基因拟南芥中c b f 4 的过量表达导致了下游与低温和高盐胁迫相 关的基因的活化l 6 z j 1 3 2 受d r e b i c b f 调控的下游基因 d r e 介导的信号传导途径的核心是激活启动子区域中含有的d r e 元件的基因的表达 受d r e b 调控的下游基因的表达在植物抗逆应答中发挥了重要的作用 其可以保护植物免 受低温 干旱和高盐等胁迫的伤害 6 3 利用全长的e d n am i c r o a r r a y 和a f f y m e t r i x 基因芯 片分析d r e b i c b f 过量表达的转基因拟南芥 发现了一系列被低温和c b f 诱导的基因 5 9 6 4 6 8 将其称为c b f 调节子 目前已发现1 0 0 多个可以被c b f 调控的基因 它们中的大 部分可以被低温和c b f 诱导表达 而一些基因则被其抑制表达 这可能是通过c b f 下游其 它调节基因的参与造成的 c b f 调节子编码很多种不同功能的蛋白 包括转录因子 信号 9 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 转导因子 生物合成蛋白 抗冻蛋白以及其它胁迫相关蛋白 还包括许多未知功能的蛋白 5 8 6 3 6 4 6 6 1 其中一些蛋白在植物耐受低温的过程中发挥作用 如抗冻蛋白c o r l 5 a 调控脯 氨酸水平的p 5 c s 2 酶等 但是 其它c b f 调控蛋白的具体作用方式目前还了解的很少 6 9 1 3 3d r e b l c b f 基因表达的上游调控 使用c b f 3 启动子一荧光素酶基因报告系统转基因到拟南芥当中 在化学诱变下 从 该转基因库中筛选到了一个突变株i c e l 其在冷诱导的情况下不能激活荧光素酶的表达 i c e i 的突变阻断了c b f 3 基因的表达 同时也减少了c b f s 的许多下游基因的表达量 这导致了 植株在冷胁迫下应答能力的减退 使用p o s i t i o n a lc l o n i n g 发现该突变是一个由g 到a 的 单核苷酸变异 i c e l 编码一个类似m y c 的碱性螺旋 环 螺旋 b h l h 蛋白 它可以特异 性的结合到c b f 3 启动子中的m y c 元件 并可以在冷诱导下激活c b f 3 的表达 i c e i 是核 内组成型表达的 它的过量表达增加了c b f 的表达 进而改进了转基因植物抗低温的能力 i c e i 的负显性等位基因i c e i 导致了c b f 3 对冷诱导表达的几乎全部丧失 然而i c e l 突变体 仅仅在冷诱导的早期微弱影响c b f l 和c b f 2 的表达 在冷诱导6h 后c b f 2 的表达量却增 加了 这暗示i c e l 可能在c b f 2 的表达中不起重要的调控作用 7 0 b h l h 蛋白保守的识别 序列是c a n n t g l 7 通过分析发现 在很多受冷诱导表达的基因的启动子中含有该元件 7 0 1 i c e i 在所有组织中是组成型表达的 被冷诱导后的表达量仅有很少的升高 并且组成 型表达i c e i 的转基因植株并没有在常温下导致c b f 3 的高量表达 这说明i c e l 蛋白的冷 诱导修饰 如磷酸化 或转录辅因子可能对于i c e l 活化c b f 的表达起重要的作用 53 加 转 录因子激活基因表达的能力可能通过胞质中或核中的蛋白磷酸化和去磷酸化来进行调控 4 4 而i c e l 突变株的变异发生在潜在的丝氨酸磷酸化残基附近 这可能影响了i c e l 的磷酸 和去磷酸化 1 3 4d r e b l c b f 基因表达的自身调控 最近发现 当使用t d n a 插入导致的c b f 2 基因发生变异时 c b f l 和c b f 3 能够在低 温的诱导中产生更强烈的表达嗍 这说明c b f 2 d r e b l c 在c b f l d r e b i b 和c b f 3 d r e b i a 的表达中具有负反馈调控的功能 在拟南芥适应胁迫的过程中起重要作用 同时 c b f 2 的 表达水平可能还受到c b f 3 的调控m 在油菜中 克隆得到了两类d r e b i c b f 基因 其中 g r o u pi 是转录激活因子 g r o u pi i 是转录失活因子 并且发现g r o u pi 与g r o u pi i 协同作用 以开启和关闭d r e 介导的信号通路 7 3 1 因此 d r e b i c b f 的转录自身调控在d r e 介导的 信号传导途径中发挥着重要的作用 提供了一种新的植物转录因子的调控模式 1 3 5i c e i c b f 信号通路的负调控 在低温驯化的过程中 基因的表达被激活后 还需要通过负反馈的作用机制以精确的维 持胞内合适的蛋白水平 在拟南芥中 编码c 2 h 2 锌指结构转录因子的a z f 2 和s t z 基因可 以被c b f 激活表达 而a z f 2 和s t z 作为转录抑制因子可以特异性的结合到r d 2 9 a 启动子 中的e p 2 序列 从而抑制了c o r 基因的表达r 7 4 粕 另外 c b f 诱导了z a t l 2 锌指结构转 l o 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 录因子的表达 而后者又负反馈的抑制了c 盯基因的表达陋 拟南芥中的另一突变株l o s 2 在冷诱导时 影响了含有d r e 元件的基因的表达 7 5 1 使用 p o s i t i o n a lc l o n i n g 分离得到了l o s 2 基因 l o s 2 编码一个双功能的烯醇酶 它可以结合到 s t z 的启动子中的m y c 序列上并抑制该基因的表达 因此认为 l o s 2 可能通过抑制这些 锌指结构转录因子的表达而调控冷诱导的基因的表达 如图1 4 所示 c o l ds t r e s s l l h s 2 f r y l ii p 3 proteho lyssi翌sof i c e i 影弋 1 r l 了一 c o rg e n e s g e n ee x p r e s s i o na n dc o l da c c l i m a t i o n 图i 4i c e i c b f 信号通路模型 5 3 f i g 1 4 t h em o d e lo fi c e1 一c b fs i g n a lp a t h w a y 1 3 6 i c e l c b f 信号通路的转录后调控 转录后调控在基因表达的过程中发挥着重要的作用 其包括r n a 的剪接 核质转运 r n a 稳定性 翻译 翻译后处理以及蛋白酶解等方式 使用p r d 2 9 a l u c 转基因的方法筛选 得到了一个参与r n a 输出过程的蛋白 l o s 4 l o s 4 是一个d e a d 框r n a 解旋酶 在 低温驯化过程中 它可能使r n a 的5 非翻译区的二级结构解旋 或是直接控制了c b f 的 转录稳定性 从而正调控了a 泸基因的表达 7 7 7 引 另外 拟南芥的s f r 6 突变体影响了c b f 的转录激活活性或c o r 基因的转录后调控 从而影响了c o r 基因的表达例 另外 一些 小的r n a 如m i r n a 和s i r n a 可能在基因的转录后调控过程中也发挥着非常重要的作用 s o l d k e b i c b f 的上游是组成型表达的 b h l h 转录因子i c e l 其可能通过翻译后修饰 的方式发挥作用 h o s i 编码一个环指结构的泛蛋白连接酶 e 3l i g a s e 其可能参与了i c e l 烟草 n i c o t i a n at o b a c c u m 中d r e b 转录因子的克隆及功能分析 的蛋白降解 从而负调控了d r e b l c b f 的表达 s l s 2 将在低温胁迫下的i c e l c b f 信号通路的工作模型总结如图1 5 所示 低温胁迫诱导了 钙信号的开启 其激活了i c e l 蛋白并诱导了c b f 以及其它基因的表达 c b f 基因之间存 在着自身调控机制以控制合适的表达水平 c 2 h 2 锌指转录抑制因子a z f 2 等可以被c b f 正 调控 而被l o s 2 负调控 这些锌指转录因子反过来抑制了c b f 以及其下游的c o r 基因的 表达 5 3 1 3 7d r e b 转录因子的d n a 结合活性分析 先前解出的a t e r f l 的e r f a p 2 结构域的n m r 结构表明 其1 3 折叠中的a r g 和t r p 残基直接参与了与d n a 元件的结合 5 0 1 这两个残基在d r e b 家族中也很保守 所以它们在 d r e b 家族中可能也参与顺式作用元件的结合 对d r e b 家族和e r e b p 家族的d n a 结合 结构域进行序列比对发现 d r e b 家族的e r f a p 2 结构域中的1 4 和1 9 位的氨基酸残基分 别是v a l 和g l u 而e r e b p 中对应位置上的氨基酸是a l a 和a s p 3 9 1 将d r e b i a 和d r e b 2 a 中的v a l l 4 和g l u l 9 分别突变成a l a 和a s p 后发现丧失了与d r e 元件结合的能力 其中v a l l 4 残基的作用尤为明显 3 9 8 3 另外 将e r f 中第1 4 位的a l a 残基突变为v a l 则赋予了其结合 d r e 的能力 5 这说明e r f a p 2 结构域的第1 4 位残基对元件结合的特异性起非常重要的 作用 k a n a y a 等在体外纯化了c b