（植物学专业论文）盐胁迫和碱胁迫对星星草体内柠檬酸代谢相关酶活性的影响.pdf

摘要 星星草 忍c c 力e af 即u 血0 删 是禾本科碱茅属多年生盐生草本植物 它适应 性强 具有很强的耐旱和耐盐碱能力 能在p h 9 一1 0 的碱斑上生长 因其具有高度耐盐 碱能力 而被用于治理盐碱化草地 成为生物治碱的首选草种 本文是在明确了积累柠 檬酸是星星草对碱胁迫特异生理响应的基础上 进一步探讨柠檬酸积累的生化基础 利用人工模拟方法 对星星草苗施加0 5 0 0 l i l m 几n a c l 进行盐胁迫处理 和 0 2 5 01 1 1 m ln a c 0 进行碱胁迫处理 选择与柠檬酸积累密切相关的四种酶 即柠檬酸合 成酶 c s e c4 1 3 7 异柠檬酸脱氢 n a d p i c d h e c l 1 1 4 2 磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶 p e p c a s e e c4 1 1 3 1 和苹果酸脱氢酶 m d h e c1 1 1 3 7 通过测定并比较盐 碱胁迫下这四种酶的活性变化 来分析碱胁迫下柠檬酸积累的生化机制 以期发现星星 草抗碱的关键生化反应及关键酶 结果表明 盐胁迫与碱胁迫对星星草茎叶或根中四种酶活性的影响明显不同 盐胁 迫下 茎叶中四种酶活性变化的特点基本相似 都是虽然呈现出一定波动但总的趋势是 活性基本不变 盐胁迫下根中的四种酶活性也无明显改变 只有在胁迫强度较高时i c d h 和p e p c a s e 的活性下降 碱胁迫下 茎叶中促进柠檬酸积累的两种酶c s 和p e p c a s e 的 活性 随着胁迫强度增大而上升 尤其是c s 活性上升得更为明显 而促进柠檬酸分解 的i c d h 活性则随胁迫强度增大而下降 m d h 的活性基本不变 在碱胁迫强度较低时 根中的c s 和p e p c a s e 活性同茎叶中一样也升高 但是当胁迫强度增高到一定程度时 因根部受害严重而至活性下降 随着碱胁迫强度增大 根中i c d h 活性开始略有上升而 后急剧下降 m d h 活性无明显改变 从盐 碱胁迫下四种酶活性变化的特点可以明显看 出 柠檬酸合成酶 异柠檬酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性调节是碱胁追下 星星草体内柠檬酸特异积累的生化基础 关键词 星星草 碱胁迫 柠檬酸 柠檬酸合成酶 异柠檬酸脱氢酶 a b s t r a c t 尸 c c i 矸e f 矗 f e n 妒o r di sat o p i c a la l k a l i t o l e r a i np l a mg r o w i n gi ns o n g n e np l t d nl o c a t e d i nt h en o n h e a s ta r e ao fc h i l l aw h e r em es o 订i se x c e s s i v ea l k a l i z a t i o n s o m er e s e a r c h e r s f o u n dj p c c m p f 抽 p 玎 f 肋 盯s p e c i a l l ya c c u n l u l a t e dc i 仃a t ei nt h es h o o t 眦d e ra l k a l i n e n a 2 c 0 3 仃e a t l l l e ma f t e rs e v e r a lh h c n c em ea l k a l i t 0 1 e r a n tp l a n tp c c f 门口盯蛔胞 驴 mw a s s e l e c t e da sm a t e r i a l a n dc i 们ca c i da c c u m u l a t i o na i l dm e t a b o l i s mu n d e ra l k a l i s t r e s si ni t w e r ei n v e s t 谵a t e d w 色a n a l v z e df o u re r 因r m e sa c t i v i 七i e sa s s o c i a t e d 谢t hc i t r a t em e t a b o l i s mo fp 把n f 加r s h o o ta n dr o o tu 1 1 d e rs a l t n a c l 0 5 0 0 m m ln 矿 a 1 1 da l k a l i n e n a 2 c 0 3 o 一5 0 0 m m ln a 十 r e s p e c t i v e l y c i t r a t es y n t h a s e c s e c4 1t 3 7 n a d p i s o c i t r a t ed e h y 出o g e n a s e n a d p i c d h e c l 1 1 4 2 p h o s p h o e n o l p y m v a t ec a r b o x y l a s e 口e p c a s e e c4 1 1 3 1 a 1 1 d m a l a t e d e h y d r o g e n a s e m d h e c 1 3 7 r e s u l t si n d i c a t e ds a l ta c t e do 蟛捌ca c j dm e t a b o l i s m n e g l i g i b l 弘e i t h e ri nt h es h o o to rm o to f 尸耙玎 咖r 盯 h i 曲s 订e s si m e n s i 够i n d u c e di c d h a 1 1 d p e p c a s ei nr o o tt o1 0 s ea c t i v i t i e s l a 1 k a l i n ei i l d u c e dc sa n dp e p c a s ea c t i v i t i e si nt h es h o o t o f 户陀船甜咖mi m p r o v e d e s p e c i a l l yc i t r a t es y i n h a s ea c t i v i t ye n l l a l l c e dd i s t i n c t l y i no p p o s i t e n a d p i c d ha c t i v i t yd e c l i n e d a st om d h i tw e r eu i l a 任b c t c do ra l t e r e dn e g l i g i b l 弘u n d e r l o wa l k a l i s t r e s si n t e n s i t i e s c sa 1 1 dp e p c a s ea c t i v i t i e si nt h er o o tw e r ea st 1 1 es a l l l ea si nt h e s h o o t w h e r e a sw h e ni tr e a c h e ds o n l ee x t e n t s t r e s si n d u c e dt h er o o tt 0d 锄a g et ol o w a c i t i v i t y a ss t r e s si m e n t s 时w e mo n a c i t i v i t yo fi c d hi nm er o o td r a s t i c l yd e c l i n e df o l l a w i n g s o m eu p g m d ea tt l eb e g i n n i n g m d hw a sn o ta f 免c t e d r e s u l t sd e m o n s 廿a t e da l k a l i n ei m p m v e dc sa n dp e p c a s ea c t i v i t i e sa n ds u p p r e s s e d i c d ha c t i v i t yi npf 已胛 棚d 阳s h o o tc o i n c i d e d l r i t hc i 廿a t ec o m e n tr o s ei n 户f 8 删扩如 ds h o o t i n d i c a t i n ga l k a l i n ei n d u c e dc i 们t ea c c m u i a d o ni nt t l es h o o ti sr e l e v m l tw i lc s p e p c a s e a c t i v i t i e si n c r e a s ea 1 1 di c d ha c t i v i t yd e c r e a s ei nt l l es h o o t a d j u s t m e m st oc s i c d ha n d p e p c a s ea c v i t i e sa r eb i o c h e m i c a lb a s i so fs d e c i a l l vc i t r a t ca c c u m u l a t i o nm t h es h o o to fp f p 玎 批 u i l d e ra l k a l i n e n a 2 c 0 3 t r e a t m e n t k e yw o r d s p 招 7 0 r 口 a l k a l i c s t r e s s c i t r a t e c i t r a t e s y n 廿1 a s e n a d p i s o c r a t e d e h y d r o g e n a s e i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得东北师范 大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 瑶啦f t 期 现盈 二 鲤l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留 使用学位论文的规 定 即 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本人授权东北师范大学可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印 或其它复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 始糙翥糍r 谧 日 期 们啦晦日 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 引言 盐土主要包括内陆盐碱土和滨海盐碱土等 这些土壤都含有过量的盐分 由于盐分 中各种离子的影响 从而对植物生长造成危害 轻者导致减产 重者可能颗位无收 土 壤盐碱化已成为一个世界性的问题 全世界盐碱地面 1 近1 0 亿h m 2 约占世界陆地面积的 7 6 我国各类盐碱地丽积约0 3 4 6 亿h 一是世界盐碱地大国之一 其中约有7 n o 万 是农田 每年造成的损失难以估计 因此充贫开发和利用盐碱土 对于增加粮食产量 具有重要意义 目前对盐碱土开发利片j 的途径之一 就是充分挖掘和利用植物的耐盐遗 传特性 盐碱土上植物牛长的障碍主要是由于盐分浓度过高引起的 由于淋漓作用较弱 大量水溶解盐分存于根层土壤中 如含有高浓度的 m 矿 s 氇 c l 一 c 如 等 它 们可通过不同的方式影响植物的生长 1 随着生态环境的不断恶化和人们不合理的开发利用 导致l 壤盐碱化的不断加深扩 大 盐土与碱土以及各类盐化 碱化土壤统称盐碱土 土壤中含有大量的易溶 牛盐分的 土壤 当土壤表层含盐量超过o 6 2 0 时即属盐土 氯化物的台盐下限为o 6 硫酸盐 沿途的积盐下限为2 0 9 6 氯化物一硫酸盐及巯酸赫一氧化物盐土的积盐下限为1 o 表层 含盐量一般不低于o j 土壤溶液中含有一定量的苏打 上壤胶体的交换性钠占交换性 阳离子总量2 0 以卜 p h 为9 或更高的土壤称碱土 这两个概念是目前被大多数人认可 的 在各类土壤学的教科书中盐十和碱土的概念也与其大致相同 由n a c o n a h c o 等碱性盐所造成的十壤碱化问题可能比由h a c l n a s 0 4 等中性盐 所造成的土壤盐化问题更加严重 在全球大约9 6 1 0 h m 的盐碱地中有2 3 的盐土 s a l l n e 和3 7 的苏打土 s o d i c 碱胁迫比盐胁迫具有更大的生态破坏力 在我国 东 北草原上的碱化草场面积约有4 6 7o o oh 一 其中碱斑面积2 6 0o o oh 一 占草地面积的 1 2 以上 少数碱化严重的地区碱斑而积已高达7 3 6 成为不毛之地 而且 如今仍 在己每年1 3 0o o oh m z 的速度进一步退化 可见碱化态势十分严峻 人工协助草地植被的恢复 种植耐盐碱的牧草已经成为生物治碱的十分有效的方法 之一 俄国1 5 0 年前开始营造农田防护林 主要目的是防止风蚀 抵御干旱 抑制土壤 流失 其中一部分营造在盐碱地上 2 0 世纪3 0 年代实行农庄集体化后 特别是二次大战 以后 随着国内局势的日趋稳定 科技工作者针对国内粮食严重不足的问题 从各方面探 讨方法 把对盐碱地的改良利用研究提到重要位置 4 0 年代以来 对植物耐盐性 盐碱地 造林树种选择 造林技术 选育耐盐榷物等问题进行了比较深入细致的研究 取得了一 定成果 2 0 世纪8 0 年代以来 吉林省农科院等单位先后采用丁星星草 野大麦 羊草 碱蓬 虎尾草 黄花草术樨 白花草木樨 沙打旺 扳碱草等多种牧草和野生植物进行了筛选 在我国 三北 地区进行了以碱茅属 崩c j 月p 埘植物治理和改良盐碱化 地的一系 在我国 三j e 地区进行了以碱茅属 肋c 砌p 捌植物治理和改良盐碱化土地的一系 列研究 得出碱茅对盐碱化土壤有较强的适应能力 可降低耕作层土壤全盐 减少因土壤 蒸发积盐和改善土壤物理性状三个作用 在东北与西北地区已建植了较大面积草地 1 星 星草 励c o 如e 妇 j 口d a 是禾本科碱茅属多年生草本植物 分布在我国北方及 世界很多地区的抗盐碱野生牧草 是生长在盐碱化草地上且有较好饲用价值的草种之 一 人工播种星星草是当前治理盐碱化草地行之有效的手段 种植用于改良碱化草地效 果良好 在黑龙江 吉林等地有一定面积的种植 1 碱茅属植物属于中度盐生植物 其抗盐性强弱 与土壤盐分类型和挠浓度有关 也 与植物的生育期及灌溉因素有关 现有的研究结果表明 碱茅属植物对盐碱的忍耐程度 顺序式硫酸盐 氯化物 碳酸盐 包括n a c o 3 种子的抗盐能力强于幼苗 成熟期也 大于幼苗期 灌水可降低盐分胁迫 星星草 砌c c 如日 妇 舢 j 口d a 为丛生多年生禾草 是松嫩平原盐碱化草地上 的优势植物之一 具有较强的耐盐碱能力 是盐碱化草地上饲用价值较好的草种之一 3 然而其分布幅度狭窄 星星草的生态分布幅度较窄 能在p h 值为9 8 1 0 5 电导率 o 6 0 9 4 i l s c m 的土壤上生长 表现出较强的适应盐碱生境的能力 随着土壤电导率的 增高星星草的优势度及生物量呈二项式分 3 同时总氮含量 脯氨酸含量及n a k c a m g 含量均呈现规律性变化 表明星星草对不同盐碱环境适应程度的差异 近年来经人工 种植用于改良碱化草地效果良好 但有关星星草在盐碱胁迫下的反应和抗性研究甚少 且这些研究多是以中性盐n a c l 作为胁迫的 对碱性盐涉及很少 而对星星草应 用最多的松嫩草地的盐碱土就是以n a c o 和n a h c o 为主要成分的 对于植物体来说 作为盐胁迫中性盐和碱性盐有显著的不同 不仅表现在作用机制 方面而且表现在植物生理响应方面 研究证明 中性盐胁迫和碱性盐是两种不同性质胁 迫 它们应该相应地称为盐胁迫和碱胁迫 盐胁迫对植物的伤害作用主要是渗透胁迫 离子毒害和离子失衡 植物对盐胁迫的生理适应过程也以渗透调节和抵制离子毒害为主 碱性盐胁迫则应是增加的高p h 值及与此有关的些营养元素如磷 铁锌 铜 锰等的有 效性下降 图1 在中碱性盐混合胁迫下 又发现缓冲量对胁变有极重要的决定性作用 如土壤溶液中高浓度的重碳酸盐是碱性土壤上造成植物缺铁的根本原因 高浓度碳酸盐 影响土壤中有效铁的浓度 植物对铁的吸收 运输和利用 土壤中无机态铁的溶解度受 h c 控制 h c 0 3 一值每升高一倍 铁的溶解度将降低1 0 0 0 倍 碱胁迫的其他效应 p h 值 土 壤溶液中0 h 一含量高 缺磷 缓冲量等效应 这都是直接对根的生理活动产生 定的影 响 此时 根维持正常生理活动就会利用分泌物来抵抗胁迫 如在缺磷时 肥田萝h 和印 度豇豆根系分泌大量的酒石酸 其分泌量可分别占根分泌有机酸总量的7 2 9 和 9 9 4 植物根系活动如分泌质子 有机酸如柠檬酸等过程都可提高土壤酸度 增加根 际土壤的有效性 近些年来 虽然在认识植物抗盐机制方面有了长足进展 但在碱性盐 胁迫方面 除了极少数研究以外很少有人涉及 因此为了明确盐 碱两种胁迫的异同 探讨植物抗盐 抗碱两种属性的关系 有必要对两种胁迫进行系统的对比研究 揭示植 物响应碱胁迫的生理和分子机制 这必然为作物抗逆性育种提供重要的参考依据 2 h 鞠0 h 一懑干生 a i n 和s 活他 p 和b c 8 翮m g 装 c u 和z n f 口和m n m o 嘲薹毒56 78 9 图1 土壤p h 对矿物养分的有效性影响 以带宽度表示 已有大量试验证明 在逆境胁迫下如 缺p 缺f e a l 毒 重金属等胁迫作用可诱 导植物根系分泌有机酸如 小麦在铝胁迫下大量分泌是节果酸 白羽扇豆在缺磷时 大量分泌柠檬酸 硬质小麦在重金属胁迫下大量分泌乙酸和琥珀酸 等等 而且有部 分研究已经进入到分子生物学领域 因此研究在碱胁迫条件下 耐碱植物星星草根系分 泌有机酸的种类 数量以及代谢机制和特征 为研究碱胁迫下的植物的生理响应特征以 及遗传育种等方面提供了极好的研究方向 一 有机酸积累和分泌 陆生植物生长的固定性决定了它们只有不断对环境变化做出响应 增强其抗逆性 才能维持其生存 已有大量实验证实 在矿质元素胁迫等逆境条件下 植物往往可以通 过生理上的一系列变化 增加体内物质代谢调节和分泌物的释放 从而直接或间接提高 植物养分吸收的有效性 增强其抗逆性 在植物体内的代谢调节物质和分泌物中 其种类和数量因植物类型 根际环境而异 但在低分子化合物中 有机酸是植物体内代谢调节和根系分泌的主要成分 它是具有一 至数个羧基的烃衍生物 由于有机酸的分子结构和荷电特性可对土壤成分及其存在状态 产生多种影响 所以对植物来说 它在抵御环境胁迫如铝毒 螯合a 1 磷饥饿 溶解无 机磷 缺铁 还原f e 和盐碱胁迫 调节细胞p h 值 中具有重要作用 另外 某些逆 境因子可诱导植物有机酸代谢调节 增强根系有机酸的分泌 这是植物对环境的适应性 反应 近来研究的植物对不同逆境胁迫引起有机酸代谢调节 积累和分泌的生理响应主 要有以下内容 一 铝毒害与有机酸的积累和分泌 铝是地表上第三大元素 对植物的毒性很强 当土壤溶液酸化后p h 值下降到一定 值时 铝离子就会从硅酸盐或氧化物中释放出来 溶解到土壤溶液中 铝对植物的毒害 主要是限制根的伸长和发育 造成植物吸水困难和营养缺乏 近年来越来越多的研究结果已经表明 诱导有机酸从根系合成和分泌是一些耐铝种 或品种抵御铝毒的主要生理机制 人们先后报告了铝胁迫下柠檬酸 苹果酸 草酸从根 系分泌的现象 d e l h a i z e 发现耐铝基因型小麦品种 e t 8 根系分泌的苹果酸的量是铝 敏感型 e s 8 的5 一1 0 倍 p e l l e 发现耐铝型玉米 幻a 伽j 曲品种分泌的柠檬酸是敏 感型的1 0 倍 m a 报道经铝处理的荞麦通过根系分泌草酸 增强耐铝能力 小麦 菜 豆 玉米 芋 荞麦 山扁豆 如s s 妇 o r a 等植物的一些品种多分泌一种有机酸 而油菜 肌s s o a 印e 占打如厶 和黑麦 曲阳乃c 盯 拈厶 的一些品种则能同时分 泌柠檬酸和苹果酸 有机酸解铝毒能力的大小主要取决于它与铝形成络合物的稳定程度 这与有机酸的 结构有关 最有效的有机酸应具有一对或一对以上的一0 h 或一c o o h 如柠檬酸 酒石酸 或具有两个直接相连的c 0 0 h 如草酸 二 缺铁与有机酸的积累和分泌 铁是植物生长发育所必需的营养矿质元素 但在高p h 土壤中铁的主要存在形式为 难溶于水的三价铁化合物 可溶性f e 2 的含量却很低 所以 在高p h 土壤或石灰性土壤 中许多植物常出现缺铁黄化现象 缺铁胁迫时 植物可采用不同的对策 两种机理 提 高对铁的吸收率 机理i 存在于双子叶及单子叶非禾本科植物 机理i i 存在于禾本科植 物 机理i 类的典型植物有大豆 鹰嘴豆 菜豆 蓖麻 甜菜等 缺铁可诱导这些植物 根系h 和组织大量积累有机酸 并诱导有机酸分泌量增加5 1 0 倍 铁对植物体内的多种生理过程有明显影响 缺铁时菜豆植株木质部中苹果酸和柠檬 酸的含量增加 并在根中累积 这些有机酸在根中累积可能也是一种缺铁的适应性反应 它可造成根际的酸化 有利于铁的还原 最近的研究发现 蓖麻受缺铁胁迫时 木质部 中柠檬酸和苹果酸的浓度降低 韧皮部计液中的有机酸浓度明显增加 表明缺铁时更多 的柠檬酸由地上部向根中运输 有利于在根中累积 这一观点得到o f f l a n d 等试验结果 的支持 缺磷时油菜根系的有机酸分泌量增加 所增加的有机酸主要来自地上部分 在广泛研究了不同植物对缺铁的反应之后 发现了高效基因型双子叶和非禾本科单 子叶植物在缺铁胁迫下的共同特点是根系向外分泌h 数量增加 有机酸含量也增加 根 系细胞原生质膜对f e 的还原能力显著提高 因而 这是筛选铁高效基因型植物的几项 较好的生理生化指标 三 缺磷与有机酸的积累 由于磷的难溶性以及土壤对其的高吸附特性 磷是限制植物生长的主要因子之一 1 土壤溶液中的磷酸盐浓度很低 根据土壤性质的不同 其变幅一般在o 卜3 啪o l l 范围内 由于根系对磷的耗渴作用 使根际磷的浓度更低 因此 许多磷高效植物在长 期进化过程中形成了一系列活化根际土壤磷的机理 4 现已证明 某些双子叶植物 特别是非菌根植物 如白羽扇豆 甘蓝型油菜在磷缺 乏时 具有向根际大量分泌有机酸的能力 有机酸根可与铁 铝 钙等金属离子络 合造成含磷化合物中磷的释放 不同植物缺磷胁迫时根系分泌主要有机酸的成分不同 甘蓝型油菜在磷缺乏时 有机酸分泌量增加4 倍 主要成分是苹果酸 苜蓿在缺磷胁 迫条件下分泌柠檬酸 苹果酸和丁二酸 其中柠檬酸的分泌量是正常供磷时的2 倍 生 长于我国南方酸性土壤上的肥田萝b 和印度豇豆 缺磷时根系分泌酒石酸 苹果酸和r 二酸 其中酒石酸的分泌量较对照高近1 0 倍 是根系分泌有机酸的主要成分 生长在 酸性土壤上的木豆缺磷时根系能主动分泌大量的番石榴酸和苄基酒石酸 番石榴酸的分 泌量与植株体内含磷量呈负相关 是该植物适应缺磷的一种特异性分泌物 尽管目前对缺磷引起根际p h 改变的原因尚有争论 但可以肯定 在石灰性土壤上 根际p h 的降低能显著增加磷的溶解度 提高磷的生物有效性 植物根系在缺磷条件下 能分泌大量的有机物质 其中苹果酸 柠檬酸 草酸 琥珀酸 a 一酮戊二酸 番石榴酸 和酒石酸通常是根系分泌有机酸的主要成分 四 碱胁迫与植物有机酸的分泌 自从石德成等 提出碱胁迫的概念以来 有关碱胁迫对植物的生理作用曰益受到人 们的重视 近年来的研究表明 在碱胁迫条件下 耐碱植物星星草体内出现有机酸特异 性积累的现象 柠檬酸积累量随碱胁迫强度增大而增大 低胁迫强度下积累量上升缓 慢 当胁迫强度大于l o o 删 乙n a 2 c 啦时 积累量明显上升 实验证明 碱胁迫下积累的 主要是柠檬酸 其它有机酸无明显变化 由此提出了柠檬酸是星星草对碱胁迫特有的生 理反应这一观点 除上述胁迫以外 其它的胁迫作用 如k 缺乏时 富钾植物籽粒苋根系能主动大量 分泌草酸以释放含钾矿物中的钾 z n 和c a 2 缺乏 缺氧 c o 浓度提高等也可促进 根系有机酸分泌 这可能是由于膜伤害所造成的被动渗漏 二 有机酸代谢 一 铝毒与有机酸代谢 目前已提出二种有机酸解除铝毒的机制 认为有一些抗铝植物一方面通过根系分泌 有机酸进行体外解毒 同时也可通过体内积累有机酸进行体内解毒 p i 矗e r o s 等 1 以膜片钳技术研究抗铝玉米的杂交种 s l p1 8 1 7 l c a t e t oc o l o m b i a 9 6 7 1 分泌有机酸的时间和空间特征结果表明 根皮层和中柱的细胞上存在铝诱导阴离 子通道 他们的结果还显示在完整的根中也有铝诱导的柠檬酸积累现象 即除了铝诱导 的柠檬酸迅速释放之外 根中柠檬酸浓度有一个逐渐增加的趋势 也就是说 除了体外 解毒之外 可能还有体内解毒 l i 等 比较两种抗铝植物问有机酸分泌的差异的结果印证了植物有机酸分泌有两 种类型的说法 他们研究黑麦 k i n g 和小麦 a t l a s6 6 在铝胁迫下有机酸分泌和 代谢差异结果表明 a 1 3 促进小麦根迅速释放苹果酸 而黑麦在a 1 3 刺激下6 h 后开始 分泌苹果酸 l o h 后才有柠檬酸释放 从与苹果酸和柠檬酸代谢有关的4 个主要酶来看 即节果酸脱氢酶 珈a l a t ed e h y d r o g e n a s e h n a d p 异柠檬酸脱氢酶 n a d p i s o c i t r a t e d e h y d r o g e n a s e i c d h 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 p h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s e p e p c a s e 和柠檬酸合成酶 c i t r a t es y n t h a s e c s 无论是小麦还是黑麦 i c d h m d i i p e p c a s e 的活性都没有发生改变 而c s 活性在铝处理后的黑麦中显著增高 而小麦中没 有变化 另外 在低温下小麦分泌苹果酸不受抑制 黑麦则受抑制 说明黑麦根尖细胞 膜结合阴离子通道是温度敏感型的 两种作物的阴离子通道和涉及有机酸合成的酶在铝 胁迫下性质和表现不同说明种间耐铝植物铝诱导有机酸分泌过程不同 山扁豆也是一种耐铝能力较强的植物 它在铝处理下可特异分泌大量的柠檬酸 y a n g 等 检测山扁豆根尖中参与柠檬酸代谢与积累的几种酶活性的结果表明 l o 一5 0 0 1 几的a l c l 酸性溶液显著刺激c s 活性 从时间上来说 铝处理后3 h c s 活性即增加 1 2 h 后增加6 7 达到最大值 而柠檬酸的释放是在铝处理6 h 后 这暗示柠檬酸释放是 由c s 活性增加引起的 相反 与柠檬酸分解有关的乌头酸酶 a c o n i t a s e a c 0 活性在 锚处理后总是处于抑制状态 其活性非但不增高反而降低 这一现象表明 a c o 可能也 与铝刺激的有机酸分泌有关 c s 活性的增加与a c o 活性降低都促进植物根尖柠檬酸积 累 李德华等 3 1 认为铝胁迫下玉米根尖分泌苹果酸的能力与细胞内苹果酸脱氢酶活性 提高相关 植物体内存在两种形式的苹果酸脱氢酶 n a d p m d h 和n a d m d h 二者在细胞 内执行不同的功能 他们用玉米的耐铝自交系 z 1 和敏感自交系 z 2 两种材料 测 定其根系n a d m d h 和n a d p 州d h 活性 结果显示 铝胁迫下耐铝自交系z l 根系n a d p m d h 活性显著增加3 2 而敏感自交系 z 2 则下降5 4 二者根系中的n a d 一 i d h 活性均 呈下降趋势 这说明 铝处理下的玉米根尖进行的苹果酸合成 可能是经p e p o a a 一苹果 酸途径 明风等 采用抑制差减杂交技术分析正常与铝处理的普通野生稻 帅 u 7 p 口舯口 植株中基因表达差异性的结果表明 在铝胁迫下 叶片内发生一系列的 适应性反应 一些酶类 苹果酸脱氢酶与酸性磷酸酶等 参与其中 最近 z h a o 等 研究了大麦耐铝能力和柠檬酸输出的相关性 他们通过耐铝型大麦 品种 s i g u r d k o r n 和铝敏感型大麦品种 k e a r n e y 的实验 发现铝对两种品系根尖 中c s 活性没有影响 s i g u r d k o r n 的柠檬酸分泌不随铝胁迫强度增加而增加 铝诱导 的根柠檬酸分泌受低温和阴离子通道抑制剂的影响 另一方面 随着处理液中铝浓度增 加根尖柠檬酸含量增加 k e a r n e y 的根尖中柠檬酸含量和分泌不受铝影响 大麦根尖 巾的阴离子通道无剂量效应 它属于一种阈值型阴离子通道 这与小麦等植物根尖中铝 激活的阴离子通道在性质上是不同的 二 缺磷与有机酸代谢 对于缺p 引起的根际有机酸的释放机制 目前国内外科学家普遍关注白羽扇豆排根 的形成和有机物质的分泌以及与植物适应性之间的关系 特别是对磷胁迫下排根的形成 和有机酸分泌的机制以及调节机理研究是深入理解植物对养分胁迫适应性的关键 对于 低磷引起排根释放有机酸的研究表明 缺磷的根组织中羧酸的合成与地上部有所不同 主要表现为胞内一些酶的表达活性增加 如蔗糖合成酶 磷酸葡萄糖异构酶 果糖激酶 6 和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 p e p c a s e 等 而这些酶与根中羧酸的代谢 特别是有机 酸的生物合成是有关的 c 同位素标记实验表明 通过根系p e p c a s e 非光合固定的 c 0 z 为根簇羧酸的分泌提供大于3 0 的碳源 这样 p e p c a s e 固定的c o 可以补偿由于羧 酸分泌造成的碳损失 约占光合净固定的2 5 7 3 总之 缺磷白羽扇豆成熟根簇中柠 檬酸积累的增加是由于缺磷导致代谢紊乱 大量柠檬酸和质子向根际的释放 这是一种 防止胞质过度酸化以及柠檬酸过度积累超过液泡存储能力的解毒机制 白羽扇豆的成熟根簇中柠檬酸的大量增加 也与根中乌头酸酶活性的降低有关 乌 头酸酶参与三羧酸循环和胞质中柠檬酸的转变 在缺磷条件下 乌头酸酶活性降低 导 致柠檬酸的代谢速率降低 增加根组织中柠檬酸的积累 在缺磷条件下 油菜根系分泌有机酸的量也增加 油菜地上部柠檬酸和p e p c a s e 的活 性明显增加 而且韧皮部中柠檬酸 糖的比率也显著提高 c 0 2 标记试验表明 柠檬酸在 叶片中大量合成 并通过韧皮部转移到根系 在特定的区域累积 然而 缺磷油菜的根尖 分生区主要分泌苹果酸和少量的柠檬酸 由此可以推测苹果酸可能在根系中重新合成 p e p c a s e 在缺磷时活性增加与有机酸如苹果酸和柠檬酸的大量合成与释放相关 这样导 致了根际周围区域的酸化 促进环境中矿物质p i 的溶解和吸收 磷缺乏时 绿藻p e p c a s e 活性增加 磷缺乏时绿藻p e p c a s e 活性增加的原因 据认 为是由于磷缺乏引起对丙酮酸和无机磷 p i 的需要增加 而并非是为了补充三羧酸循 环 t c a 循环 的中间产物 p e p c a s e 羧化反应形成草酰乙酸并释放出p i 这提供了一 条绕过丙酮酸激酶的途径 而丙酮酸激酶酶促反应需p i 和a d p 缺磷时根系可通过 阿p c a s e 将p e p 羧化形成草酰乙酸 随后在苹果酸脱氢酶下形成苹果酸 由于p e p 苹 果酸 柠檬酸积累均会抑制糖酵解过程 为了维持糖酵解过程进行 苹果酸必须被利用 包括苹果酸和柠檬酸分泌 因此 p e p c a s e 活性增加可能是植物适应低磷胁迫的一种主 动生理反应 三 缺铁与有机酸代谢 植物缺铁会引起一系列的生理反应 与有机酸积累和分泌有关的生理响应也很复 杂 如c s l c d h p e p c a s e n a d m d h 的活性升高 促进果糖磷酸激酶活性和细胞 色素c 的表达等等 由此可知 缺铁引起的柠檬酸增加是与柠檬酸合成和分解代谢有关 的酶的综合表现 有机酸对缺铁植物的作用有两个方面 一是体内增加f e 3 的流动性 协助运输铁元素 二是分泌的有机酸促进根际f e 3 的还原 双子叶植物吸收的f e 2 常 在细胞质被氧化为f e 并与柠檬酸或苹果酸结合 由多个柠檬酸分子与铁离子螯合的 铁柠檬酸复合体呈离子态 由共质体进入质外体 依靠蒸腾作用产生的质流经木质部向 地上部运输 植物缺铁时 根系会分泌核黄素 柠檬酸等有机物 有人认为这些物质有利于铁的 还原 但r o m h e l d 等在研究花生时 发现缺铁时植物根系分泌的有机物的还原力很小 并且认为铁还原是根系本身的作用而不是根系分泌物的作用 目前有关缺铁植物根系有 机酸代谢的研究很不够深入 对根系分泌物的作用也不是很清晰 对有机酸代谢的研究 是令后研究的方向 三 柠檬酸在逆境胁迫中的作用 柠檬酸在植物体中是一种基本代谢产物 在能量和物质代谢中占据了非常重要的位 置 近年来 人们发现柠檬酸在植物适应逆境中起到了其它物质无法代替的关键作用 早在1 9 8 6 年 人们就在干旱的棉花中发现柠檬酸的积累 后来在盐胁迫下苜蓿的根 中发现了柠檬酸的增加 当植物遭受到铝胁迫时 通过在细胞中积累有机酸即能够减 低铝的毒性又能够通过根尖中有机酸的渗出阻止铝的吸收 同时这也表明柠檬酸比其它 有机酸如琥珀酸和苹果酸更为有效 另外 柠檬酸和植物对缺铁和磷的反应之间紧密 相关 柠檬酸积累是星星草对碱胁迫的特定的生理响应 它对盐胁追和碱胁迫的响应有着 显著的不同 在碱胁迫下植物积累的柠檬酸与脯氨酸和甜菜碱无论是积累部位还是作用 机制都不同 在碱胁迫下柠檬酸积累现象应该得到足够的重视 从而我们选用星星草 作为耐碱植物并研究其在碱胁迫下柠檬酸代谢变化现蒙 一 材料与方法 一 材料处理 一 材料 从吉林省西部草原获得星星草种子 该品种具有较强的抗旱及抗盐性 用直径2 0 c m 的塑料花盆盛筛沈过的细砂 以砂培法培养星星草 助c c 砌e 妇f 朗 j 仃d a 幼苗 室外培养 每天每盆用2 5 0 m lh o a g l a n d 营养液透灌两次 其余时间用称重法确定每盆 失水量 并以蒸馏水补充 及时间苗 每盆定苗2 5 株 整个实验于4 月中旬至5 月下 旬在室外进行 处理期间人工遮雨 苗龄8 周时选取长势均匀的星星草幼苗3 3 盆 随机分为l l 组 其中一组为对照组 其余1 0 组 每组3 盆为3 次重复 分别标为a a b a 一a 5 组浓度分别用 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 m m 几的n a c l 盐胁迫 b 一b 5 组用5 0 9 0 1 3 0 1 7 0 2 1 0m m l 的n a c o 进行碱胁迫 胁追处理于下午4 5 时进行 每盆用5 0 0 m 1 含有相对浓度盐的营 养液为处理液 分3 次透灌 使植株完全处于胁迫状态 每天处理一次 从次日起每天 早晚两次用称量法确定失水量 并以蒸馏水补充 二 取样 十处理后的3 6 h 取样 洗净材料 取地上和根各6 9 剪碎后分装成1 9 密封并贮 存于一7 5 冰箱中 用于测酶活 即苹果酸脱氢酶 n a d p 一异柠檬酸脱氢酶 磷酸烯醇式 闯酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶和鲜干重 剩余材料1 0 5 下烘1 5 m i n 于8 0 下烘干至 恒重 剪碎研磨 密封并置于干燥器中 用于其他指标 k n a c l 二价阳离子 s o 2 n o 一 有机酸含量等 的测定 二 仪器与试剂 r c 一5 c 超速冷冻离心机 a m e r i c a 7 5 4 紫外分光光度计 6 4 2 0 火焰分光光度计 磷酸烯醇式丙酮酸钾盐 p e p k 5 5 一二硫代双 2 一硝基苯甲酸 d t n b 美国 明i 生产 还原性辅酶i n a d h 辅酶i i n a d p 美国g e n v i e w 生产 水合异柠檬酸三 钠 d l i s o c i t r i ca c i dt r i s o d i u ms a l th y d r a d e 草酰乙酸 o x a l a c e t i ca c i d 比 利时a c r o s 苹果酸脱氢酶 m a l a t ed e h y d r o g e n a s e 美国a m r e c o 原装 乙酰辅酶 a a c e t l ye n z y m ea 美国r o c h e 原装 9 三 测定方法 一 酶活性测定m 1 酶的提取液 1 0 株的根尖 1 o c m 或l g 叶片置于4 冰浴中的研钵中1 4 材 提取液5 0 i i l m l h e p e s n a o h 缓冲液p h 7 5 包括5 i i l m 几m g c l 5 l i m l e d t a n a lo v v 甘油和o 1 v v t r i t o n x 一1 0 0 2 w v p v p 一1 0 1 5 0 0 0 9 下5 m i n 去沉淀 上清 为酶提取液 c s 的酶活测定 1 0 0 r l m l t r i s h c l 缓冲液 p h 8 0 5 f f i m 几m g c l 5 m m 几d t n b 0 1 5 i i l m 几乙酰辅酶a 4 i i l m l 草酰乙酸 反应由加入草酰乙酸启动 4 1 2 n m 下检测辅酶 a 吸光值的增加 吸光值为1 3 2 0 0 时间为6 m i n i c d h 酶活测定 在终体积为3 m 1 的反应介质中 t r i s h c l1 0 0 f f l m 几 p h 8 o o 3 m m l d t t 5 1 i m lm g c l 1 5 m m 几n a d p 7 5 i i l m 几d l 一异柠檬酸三钠和酶 反应加入异柠檬酸 启动 n a d p 的消光系数为6 2 0 0 反应6 m i n 3 4 0 n m 下检测a 的增加值 n a d m d h 酶活测定 3 m 1 反应液 1 0 0 l t i m 几t r i s h c l p h 8 o o 5 m m i e d t a n a o 2 州 ln a d h 7 0 m m lk c l l f l m l0 a a 加2 0 1 粗酶液 0 a a 启动反应 混匀后 立即计时 每隔3 0 s 测定一次吸光度 共测3 m i n p e p c a s e 酶活测定 3 m 1 反应液 1 0 0 i i l m lt r i s h c l p h 8 o 5 0 j 1 1 m ln a h c o 0 2 i i l m l n a d h 2 um d h 5 f f i m lm g c l 4 i f l m lp e p 粗酶液启动反应 室温测定 混匀后立即计 时 每隔3 0 s 测定一次吸光度 共测4 m i n 二 无机离子测定 样品液的提取 1 0 0 i n g 干样1o i i l l 无离子水消煮2 h 后定容至1 0 m 1 k n a 的火焰光度法 取3 m l 提取液稀释1 0 倍 进样后待读数稳定后记数据 c l 一 二价阳离子 s o 的滴定法 c l 一用a 酬o 滴定法 1 3 m l 提取液稀释1 0 倍后加o 5 m lk c r 0 4 o 0 1 m o l 几a g n o 滴 定溶液从黄色变为橙色 二价阳离子 s 0 2 用氨缓滴定法 3 m l 提取液稀释1 0 倍后 加3 l 氨缓冲液 5 0 m g 铬黑t 5 i i l m l e d t a n a 滴定到酒红色至兰色 记录的数据为二价 阳离子的滴定量 然后加2 m 1 0 0 2 m 0 1 几的b a c l 用5 i i l m l e d t a n a 滴定至兰色为酒红色 记录滴定s o 2 的滴定量 n o 的水杨酸比色法 标准曲线的制作 5 0 0 m g 几n o 一n 标准溶液 精确称取烘至恒重的l n o o 7 2 2 l g 溶于蒸馏水中 定容 至2 0 0 m 1 吸取5 0 0 m g l n 0 一n 标准溶液1 2 3 4 6 8 1 0 1 2 m 1 分别放人5 0 m l 容量瓶中 用无离予水定容至刻度 使之成1 0 2 0 3 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0m g 儿 的系列标准浴液 样品液的测定 1 0 吸取样品液0 1 m 1 分别于3 支刻度试管中 然后加入5 水杨酸一硫酸溶液 称取 5 9 水杨酸溶于1 0 0 m 1 比重为1 8 4 的浓硫酸中 搅拌溶解后 贮于棕色瓶中 置冰箱保 存1 周有效 o 4 m l 混匀后置室温下2 0 m i n 再慢慢加入9 5 m 1 8 n a 0 h 待冷却至室 温后 以空白作参比 在4 1 0 n m 波长下测其光密度 在标准曲线上查得用回归方程计算 含量 再用以下公式计算其含量 三 有机酸测定 有机酸的测定采用氨缓滴定法 1 总有机酸提取 称取鲜样卜2 9 或干样0 3 0 5 9 加少许石英砂和l m l2 m 0 1 lh n o 5 m l7 0 乙醇研磨成匀浆 倒入1 5 m l 离心管中 用 5 m l7 0 乙醇冲洗研钵并到入离心管 浸泡1 5 2 0 m i n 其间不时搅拌 然后3 0 0 0 r p m 离 心1 0 m i n 上清液到入5 0 m l 的塑料离心管中 残渣加5 m l7 0 乙醇搅拌浸提5 m i n 后离 心 再用9 5 乙醇5 m 1 洗提一次 合并上清夜 为中和h n 0 3 加一滴酚酞到上清液中 边搅拌边滴加2 m 0 1 l 的n a o h 当溶液变成玫瑰色后继续加1 m l2 m 0 1 l n a o h 然后加 o 3 m l 冰醋酸和1 m l2 0 的醋酸铅 混匀 静置3 0 m i n 然后3 0 0 0 r p m 离心1 0m i n 保 留沉淀 用5 m 1 7 0 乙醇冲洗烧瓶然后到入离心管搅拌洗涤沉淀 离心 如此重复两次 向沉淀中加入1 0 m l1 n a 2 c 0 3 溶液 搅拌5 m j n 离心 上清液倒出用作柠檬酸测定液 向沉淀加l o m l o 1 m o l 几h c l 搅拌 到入三角烧瓶中 用蒸馏水洗涤离心管 定量滴定 加3 m l 氨缓冲液 5 m l o 0 5 m o l 几e d t a n a 溶液 5 0 m g 铬黑e t l o o 指示剂 用o 0 l m o l l m g s o 滴定到溶液由蓝绿色变为酒红色为止 另用o 0 l m 0 1 几m