（微生物学专业论文）两株芘高效降解菌的分离、鉴定及相关降解特性的初步研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 下 独立进行研究所取得的成果 除文 外 本论文不包含任何其他个人或集体 研成果 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体 均已在文 中以明确方式标明 本声明的法律责任由本人承担 论文作者签名 蕴盥差 日 关于学位论文使用授权的声明 期 丝垒 至 本人完全了解山东大学有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权山东大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用 影印 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文 保密论文在解密后应遵守此规 论文作者签名 莲盥焘导师签名期 丝堕 山东大学硕士学位论文 目录 摘要 l a b s t r a c t 3 缩略词表 5 第一章绪论 7 1 1 多环芳烃概述 7 1 1 1p a h s 来源及分布 7 1 1 2p a h s 的理化性质 9 1 1 3p a h s 的毒性 1 0 1 1 4p a h s 的修复方法 1 l 1 2 微生物修复芘污染的研究进展 1 5 1 2 1 代谢芘的微生物 l5 1 2 2 芘代谢途径 16 1 3 微生物修复技术发展目标 1 9 第二章土壤中p a h s 提取及分析方法的建立 2 l 2 1 材料 2 l 2 1 1 主要仪器 2 l 2 1 2 主要试剂 二 2 1 2 2 实验方法 2 2 2 2 1 十六种p a h s 分析方法的建立 2 2 2 2 2 样品采集及土样前处理 2 3 2 2 3p a h s 提取 2 3 2 2 4 净化 2 4 2 3 结果与讨论 2 4 2 3 1 十六种p a h s 分析方法的建立 2 4 2 3 2 土壤样品中p a h s 定性及定量分析 2 5 2 3 3 三种提取方法比较 2 7 第三章芘高效降解菌株的筛选 分离和鉴定 2 9 3 1 材料与方法 3 0 山东大学硕士学位论文 3 1 1 实验材料 3 0 3 1 2 芘降解菌的驯化和筛选 3 3 3 1 3 芘降解菌的菌落形态观察 3 4 3 1 4 菌株的理化性质研究 3 5 3 1 5b i o l o g 微生物菌种鉴定 3 5 3 1 61 6 sr d n a 鉴定 3 6 3 1 7 脂肪酸分析 4 0 3 1 8 质粒的提取 4 l 3 1 9 菌株抗生素抗性的检测 4 3 3 2 结果与讨论 4 3 3 2 1 菌株的形态观察 4 3 3 2 2 菌株的理化性质测定 4 6 3 2 3b i o l o g 微生物菌种鉴定结果 4 7 3 2 41 6 sr d n a 序列分析 4 9 3 2 5 菌株脂肪酸分析 5 6 3 2 6 质粒的提取 5 7 3 2 7 菌株的抗生素抗性检测 5 8 3 3 本章小结 一5 9 四章两株芘高效降解菌的降解特性及其生长条件优化的研究 6 l 4 1 材料与试剂 6 1 4 1 1 实验材料 6 l 4 1 2 菌株的碳源利用情况 6 2 4 1 3 菌株生长条件的优化 6 3 4 1 4 培养基优化 6 4 4 i 5 两菌株生长曲线的测定及芘降解效率的研究 6 5 4 2 结果与讨论 6 6 4 2 1 两菌株碳源利用情况 6 6 4 2 2 菌株生长条件的优化 6 7 4 2 3 培养基优化 6 9 i i i 山东大学硕士学位论文 山东大学硕士学位论文 摘要 多环芳烃 p a h s 是一类广泛分布于环境中的含有两个或两个以上苯环的 有机污染物 极易在环境中积累并可通过食物链传递 其具有 三致效应 致癌 致畸和致突变性 对人类健康和生态环境具有很大危害性 p a h s 污染引起人 类广泛的关注 目前消除p a h s 污染方法种类繁多 但微生物修复技术被证明 是去除p a h s 污染环境的最佳方法 它不仅经济 高效 而且处理彻底 残留少 芘是具有四个苯环的p a h s 本身没有细胞毒性 但芘被摄入人体之后经过 代谢消化形成醌类物质具有强致癌性 一般小分子量的p a h s 可以较容易地被 环境中的微生物利用 而高分子量的p a h s 不容易被利用残留在环境中 由于 p a h s 的毒性随其所含的苯环数的增加而增强 高分子量的p a h s 的微生物降解 引起越来越多的学者的关注 芘常被用来作为研究高分子p a h s 降解的模式化 学物质 本实验采用三种方法对采集自济南炼油厂厂区内油污污染比较严重的土壤 样品中1 6 种p a h s 的种类和含量进行了测定 结果显示该样品中含有所有的1 6 种p a h s 其中芘的含量很高浓度大于4 0 0i x g k g 其含量在所测的所有p a h s 中 第三 利用此土壤样品分离筛选到了两株可以利用芘为唯一碳源和能源进行生长 的菌株3 b 和3 c 经过多相鉴定技术鉴定菌株3 b 为a l c a l i g e n e sf a e c a l i s8 sf a e c a l 话 菌株3 c 为b a c i l l u ss p 并对两菌株的无机盐培养基生长条件做初步优化 菌株3 b 和3 c 的最适培养温度都是3 0 菌株3 b 生长的最适p h 值是7 0 菌株3 c 生长的最 适p h 值是9 0 两菌株都不含有质粒 其降解酶表达基因位于细菌基因组上 菌株3 b 对实验的7 种抗生素具有较强的抗性 菌株3 c 的抗性较弱 两菌株都 可以较好地利用1 3 种碳源来生长 两菌株生长的最适芘浓度都是1 5 0m g l 根 据优化后的生长条件培养基测定两菌株1 4 天内的生长曲线及其对芘的降解效 率 菌株3 b1 4 天对芘的降解效率达到4 2 4 4 菌株3 c 对芘的降解效率为 2 4 1 5 关键词 多环芳烃 p a h s 芘 提取方法 b a c i l l u ss u b t i l i s a l c a l i g e n e s f a e c a l i s s sf a e c a l i s 系统发育分析 山东大学硕士学位论文 2 t h ee n v i r o n m e n t a st h em o r eb e n z e n er i n g st h ep a h sh a v et h em o r et o x i ct h e ya r e m i c r o b i a ld e g r a d a t i o no fh i g l lm o l e c u l a rw e i g h tp a h sc a u s e dm o r ea n dm o r e a t t e n t i o no fs c h o l a r s p y r e n ei so f t e nu s e da sam o d e lc o m p o u n dt os t u d yt h e d e g r a d a t i o no fh i g hm o l e c u l a rp a h s t y p ea n dc o n t e n to f16k i n d so fp a h so ft h es o i ls a m p l e sc o l l e c t e df r o mj i n a n r e f i n e r yw a sd e t e r m i n e dw i t ht h r e ed i f f e r e n tm e t h o d s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e s a m p l ec o n t a i n e da l lt h e16p a h s t h ec o n t e n to fp y r e n ew a sm o r et h a n4 0 0p g 瓜g c a m ei nt h et h i r dp l a c ea m o n ga l lt h ep a h s t w os t r a i n sn a m e d3 ba n d3 cw h i c hc a n u s ep y r e n ea st h es o l ec a r b o ns o u r c ea n de n e r g ys o u r c ef o rt h eg r o w t hw e r ei s o l a t e d f r o mt h es a m p l e s i nt h i ss t u d y s t r a i n3 bw a si d e n t i f i e da sa l c a l i g e n e sf a e c a l i s 船f a e c a l i s 3 cf o r t h eb a c i l l u ss u b t i l iw i t hm u l t i p h a s ei d e n t i f i c a t i o nt e c h n o l o g y t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo fs t r a i n3 ba n d3 ci s3 0 c o p t i m u mg r o w t hp hv a l u ei s7 0f o rs t r a i n 3 ba n d9 0f o rs t r a i n3 c n e i t h e ro ft h et w os t r a i n sc o n t a i np l a s m i d w h i c hi n d i c a t e d t h a td e g r a d a t i o ng e n e sl o c a li nt h eg e n o m s t r a i n3 bh a sas t r o n gr e s i s t a n c et ot h e7 t e s t i n ga n t i b i o t i c s t w os t r a i n sc o u l dg r o ww e l lu s i n g13k i n d si n o r g a n i cc a r b o n s o u r c ea st h es o l ec a r b a o ns o u r c ea n de n e r g ys o u r c e p y r e n ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c y 3 山东大学硕士学位论文 a n dt h eg r o w t hc b i v eo ft h et w os t r a i n sw a sd e t e r m i n e dw i t ht h eo p t i m i z e dm e d i u m d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo fp y r e n eb ys t r a i n3 b i s4 2 4 4 a n d2 4 15 b ys t r a i n3 c k e yw o r d s p o l y c y c l i c a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s p a h s p y r e n e e x t r a c t i o n m e t h o d s b a c i l l u ss u b t i l i s a l c a l i g e n e s f a e c a l i ss s f a e c a l i s p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s 4 山东大学硕士学位论文 缩略词表 缩写英文名称中文名称 p a h s p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s多环芳烃 p o p sp e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s持久性有机污染物 u s e p au s e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n a g e n c y美国环保局 l bl u f i a b e r t a n i l u r i a b e r t a n i 培养基 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e s 乙二胺四乙酸 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 f i df l a m ei o n i z a t i o nd e t e c t i o nd e t e c t o r氢离子火焰检测器 a m p a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 p r o b p r o b a b i l i t y 可能性 s i m s i m i l a r i t y相似度 d i sd i s t a n c e 距离 g cg a sc h r o m a t o g r a p h y气相色谱 g c m sg a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y 气相色谱一质谱联用技术 n a t i o n a l c e n t e r f o r b i o t e c h n o l o g y 美国国家生物技术信息 i n f o r m a t i o n中心 5 山东大学硕士学位论文 6 山东大学硕十学位论文 1 1 多环芳烃概述 第一章绪论 多环芳烃 p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s p a h s 是一类由两个或两个以 上苯环组成的广泛存在于环境中的难降解有机污染物 p a h s 水溶性低 生物可 利用性差 在自然界可长期存在 b o l d r i ne t a l 1 9 9 3 t i e h m1 9 9 4 在一定范围内 多坏芳烃的遗传毒性和致癌性随着苯环数目的增加而增加 在4 5 个环时毒性最 高 近年来随着经济的发展 石油 煤 天然气等资源丌发利用的不断加快 环 境中的多环芳烃有不断增加的趋势 由于多环芳烃的潜在毒性 致癌性及致畸诱 变作用 并且p a l l s 极易在环境中累积并可通过食物链传递 对人类健康和生 态环境具有很大的危害性 美国环保局在2 0 世纪8 0 年代己将1 6 种不带分支的 p a h s 列入优先污染物名单中 k e i t ha n dt e l l i a r d 1 9 7 9 我国也把p a h s 列入 环境污染物的黑名单中 人类可以利用物理 化学 生物手段及它们的综合作用 对p a h s 污染物进行整治 p a l i s 可以历经氧化 光解 水解 挥发 生物积累 吸附 淋洗等物理化学反应过程而清除 但微生物的降解是p a h s 污染物脱毒 的最有效的亦是最终途径 以微生物降解和转化为基础 对p a h s 污染物进行 完全或部分降解的生物整治技术是解决多环芳烃p a h s 污染物问题的至关重要 的手段 1 1 1p a h s 来源及分布 p a h s 广泛存在于大气 土壤和水体中 石油中包含有复杂的p a h s 混合物 柴油含有3 0 4 0 的p a h s 杂酚油有8 5 9 0 的p a h s 并且包含1 5 0 2 0 0 众不同 的芳香烃化合物 环境中的p a h s 主要来源于不完全燃烧的石油 煤 木材 城 市垃圾等 另外石油化工产品生产过程 石油开发及石油运输中的溢漏 火山爆 发 机动车辆尾气排放等均产生p a h s 环境中p a h s 的归宿包括 蒸发 光氧 化 化学氧化 被土壤颗粒吸附 迁移和微生物降解等 s r w i l d e t 口 1 9 9 5 1 1 1 2 大气中的p a h s 环境中的多环芳烃大多是随烟气首先进入大气的 城市大气中的多环芳烃主 7 山东大学硕士学位论文 要来源于地表主干道上机动车尾气的排放和煤炭的燃烧 研究表明p a h s 的分 子量影响其在大气中的分布及其存在的状态 分子量大的p a h s 主要分布在大 气的下层以颗粒状为主 而分子量小的p a h s 则主要分布在大气的上层以气态 为主 当外界条件改变时这两种状态会相互转变 大气中的p a h s 浓度一般在 几到几百n g m 3 但其大小随地理位置 季节变化和气象条件的不同而变化很大 大气的流动性大 p a h s 易于吸附在颗粒上 随后通过各种沉降离开大气 1 1 1 3 水体中的多环芳烃 据估计 每年自各个污染源进入水环境的p a h s 总量约为2 3 0 0 0 0 n 屯 水体中 p a h s 的来源主要为石油泄漏 主要发生于海上油阳 油港和海上运输等过程 此外还有大气沉降 生活污水排放和土壤雨水径流等 进入水环境的p a h s 除 少量低分子量的p a h s 被蒸发去除外 5 0 的b a p 和高分子量的p a h s 逐渐沉 积在颗粒物质上 不同的p a h s 从水体中去除的方式不同 低分子量的p a h s 三个苯环以下的p a h s 主要靠蒸发 微生物降解和沉积作用去除 高分子 量的p a h s 四个苯环以上的p a h s 则较难被去除 少量被光氧化 大部分沉 积在颗粒物质上 曹曼 欧阳福承 1 9 9 1 1 1 1 4 土壤中的多环芳烃 土壤中的p a h s 污染的主要途径有污水灌溉 大气沉降 废物倾倒和工业漏 渗 董瑞斌 等 1 9 9 9 宋玉芳 等 1 9 9 7 m c v e e t yb d e ta 1 1 9 8 8 土壤中 的p a h s 污染也相当严重 主要富集在表土中 一般地 土壤中p a h s 含量随 深度的增加而降低 在深4 0c m 以下的土壤中p a h s 的含量及组成特征差异性不 大 土壤中p a h s 背景值为1 0 i t g k g 一2 0 i t g k g 城郊土壤中p a h s 的浓度高达 1 0 4 9 9 k g 1 0 6 i t g k g 董瑞斌 1 9 9 9 高环p a h s 主要以与土壤有机质胶体结合的 形式发生迁移 不易迁移到土壤剖面的深层 而低环p a h s 贝j j 主要以溶解态形式 发生迁移 易污染地下水 土壤中的p a h s 主要来源于工业渗漏 废物和大气 沉降 聂麦茜 张杰 2 0 0 1 土壤中的p a h s 主要通过挥发作用 非生物性损 失 沥虑 水解 沉淀等 和生物降解作用消失 金赞芳 2 0 0 1 土壤性质 有 机质含量 矿物组成 离子交换容量 比表面积 粒径分布 固体效应等 p a h s 理化特性 疏水性 挥发性 稳定性等 和扰动 淋溶等均是影响p a h s 在土壤中的 垂直分布与迁移的重要因素 这导致p a h s 在地下环境中的迁移十分复杂 增加 山东大学硕士学位论文 了防治和修复土壤污染的难度 1 1 1 5 植物中的多环芳烃 环境中的p a h s 经过食物链的积累和传递 在植物和藻类中含量较大 而 且多环芳烃p a h s 的分子量较大 苯环数也相应的较多 在中原油f 日附近田地 里种植的玉米根部和叶片所含的p a h s 的种类和含量不同 油田周围玉米根部 以2 4 环的p a h s 为主 含量为1 0 3 1 4n g g 6 3 7n g g 而玉米与叶子中以5 环 和6 环p a h s 为主 含量为1 2 1 4 3n g g 1 1 2 1 4 3n g g 匡少平 2 0 0 8 1 1 2p a h s 的理化性质 p a h s 是以苯环为基本结构的化合物 同分异构体很多 仅差两个氢原子的 同环化合物也很多 目前探明的p a h s 已有5 0 0 多种 p a h s 通常是无色 白色 或灰黄色 一般具有高熔点 高沸点和低蒸汽压的特性 e c l a r 1 9 6 4 p p a t n a i k 1 9 9 9 由于其具有苯环结构 所以在水中的溶解度较低 正辛醇 水的分配系数 较大 且随着苯环数目的增多其正辛醇 水分配系数也越大 因此 p a h s 很容易 被吸附在土壤或沉积物中 环境中小分子量的p a h s 主要以气态为主 大分子量 的p ahs 主要是以颗粒态为主 外界条件改变时 二者可以相互转化 毕新慧 等 2 0 0 4 时间越长 遗传毒性越高 致癌性增强 并能通过食物链在动 植物 体内逐级富集 对人体健康具有非常大的危害 图1 1 展示了美国环保署优先 控制的1 6 种p a h s 的分子结构式 9 山东大学硕士学位论文 咖 叩 i r a 菲恩荧蔻 佛 护幽 品 国心秽国 图1 11 6 种美国环保署优先控制多环芳烃的化学结构式 1 1 3p a h s 的毒性 p a h s 的毒性主要是从两方面发挥作用 一方面是由于p a h s 的化学结构特 性 即其能稳定地吸收可见光 4 0 0 7 6 0n m 和紫外线 2 8 0 4 0 0n m 因而对紫外线 辐射的光化学效应特别敏感 细胞水平的研究表明 同时暴露在p a h s 和紫外线 的照射下 会加速损伤细胞组织的自由基的形成 即机体内的p a h s 在氧分子 的参与下 产生氧自由基 如经基自由基o h 超氧阴离子伪0 3 单线太氧1 0 2 等 其通过脂质过氧化作用破坏细胞膜 可能还会进一步损伤d n a 蛋白等生 物大分子和线粒体 核糖体等细胞器 孙红文 李书霞 1 9 9 8 另一方面是p a h s 进入生物体后 主要是高等生物 首先被其细胞色素p 4 5 0 依赖的混合氧化酶系 氧化或轻基化 然后一些内源性的分子如谷肤甘肤 葡萄糖醛酸等在第二阶段酶 的催化下被氧化后的p a h s 代谢产物结合形成低毒而且容易排放的产物 s t e g m a n j j e la 1 1 9 9 1 但是有些p a h s 经过细胞色素p 4 5 0 依赖的混合氧化酶系氧化或 经基化后转化成致癌物 芳香烃类致癌物的结构与活性相关的研究表明 p a h s 及其产物是通过蛋白质的酮一稀醇互变异构过程中其一种催化作用 从而导致蛋 l o 山东大学硕士学位论文 白的不可逆转变 进而使细胞癌变 此外 在p a h s 的代谢过程中伴随大量的 自由基的产生 由于自由基具有亲电性 极易与各种生物大分子结合 导致酶失 活 蛋白结构变异 d n a 断链等一系列的损伤 并进一步引起细胞组织器官的 病理变化 绝大多数p a h s 及其中间代谢产物具有致突变的特性 其机理主要有以下 三个方面 1 直接与靶细胞d n a 形成加合物 造成d n a 损伤和染色体畸变 2 在原癌基因 r a s 的易感位点产生突变或激活l a s 基因 诱导其过量表达并 最终导致细胞癌变 3 中间代谢物参与机体的氧化还原系统产生活性氧 导致 蛋白质和脂类等生物大分子的过氧化 造成生物膜的损伤 近年的毒理学研究表 明 绝大多数p a h s 衍生物是直接致突变物或潜在致癌物 其致突变性和致癌 性是母体的十至数千倍 某些代表性的p a h s 的具体作用机理如下表所示 表卜1 一些p a h s 的细胞毒性 a m e 艾姆斯实验 u d s 无序合成 s c e 姊妹染色单体交换 c a 染色体畸变 1 1 4p a h s 的修复方法 截止目前国内外已有大量的关于p a h s 污染修复技术的研究 已经取得了长 足的进展 p a h s 污染的修复主要分为 物理方法 能除去5 0 一6 0 化学方法 光氧化法和化学氧化法 和生物处理法 能除去3 0 4 0 杨发忠等 2 0 0 5 此外还有湿地治理法和堆肥处理法去除p a h s 污染 1 1 4 1 理化方法修复多环芳烃污染 山东大学硕士学位论文 常用的修复p a h s 污染的物理方法有 1 光解 p a h s 能被光解 与氧反 应而发生光解 生成苯醌 光解效应很弱 不能完成p a h s 的终极代谢 使其矿 化成水和二氧化碳 2 超声波降解p a h s 污染物 超声波降解p a h s 主要是利 用的空化作用 当空化发生时 液体中产生很高的剪切力 形成明显的生化学反 应 这种反应是由于高温热解和高活性自由基引起的 这也是引起污水中难降解 有机物分解的主要原因 3 絮凝和沉淀 p a h s 是地表水中的滞留性污染物 由于其水溶解度低而辛醇 水系分配系数高 因而易于从水相中分配到沉积物和 有机质中 故可采用吸附法来处理 p a h s 在大气 水及土壤与沉积物中的迁移 转化 实际上就是一个天然的吸附与解吸过程 除自然吸附外 人们还利用各种 吸附剂对环境中的p a h s 进行去除 常用的包括活性炭 黏土矿 如沸石 针 铁矿 高岭石 膨润土等 树皮 纤维 聚乙烯等 c a r n e o t r a s s e t a l 2 0 0 3 4 溶剂萃取 利用有机污染物易溶解到有机溶剂中的特性 采用一些溶剂将吸 附到土壤中的有机物萃取出来 实现污染土壤的快速清洁 5 非生物表面活性 剂清洗 非生物表面活性剂吐温8 0 t r i t o n 1 0 0 等可以使吸附在土壤颗粒中的 p a h s 解吸 使其溶解在表面活性剂中 实现土壤的快速清洁 1 1 4 2 植物修复多环芳烃污染 植物生物修复是一项利用太阳能动力的处理系统 具有处理费用低 减少场 地破坏等优点而受到重视 目前 美国和西欧发达国家对这方面的研究较多 孙 铁珩 等 1 9 9 9 植物对p a h s 污染修复的方式有四种 植物提取 植物降 解 植物稳定 植物挥发 刘世亮等 2 0 0 3 植物根际可产生和释放能改 变污染物生物利用性的物质到根际或影响微生物的种群结构 其分泌物也可作为 基质 这增加了总的微生物种类或支持某些特殊的种类 根际还可转移氧气使根 区的好氧转化作用能正常进行 菌根菌生长在根上 菌根菌与植物共生具有独特 的代谢途径和酶系 可以代谢自身细菌不能降解的有机物 s a l t e ta l 1 9 9 8 植 物根系释放分泌物是根际修复土壤多环芳烃污染的重要机制之一 有研究表明玉 米根系氨基酸分泌的总量随着芘胁迫的加强显著增多 反过来玉米根系分泌的氨 基酸可以有效地增强芘的降解 许超 等 2 0 0 9 到目前为止 国际上已有大量 植物降解多环芳烃的报道 能促进p a h s 降解的植物有4 0 多种 如杨树 柳树 松树 冰草 黑麦草苜蓿和鹦鹉毛等 g a b o rl a uh e ta 1 2 0 0 1 苜蓿草可以提 1 2 山东大学硕士学位论文 高多环芳烃总量的平均降解率2 4 7 孙铁珩 等 1 9 9 9 室内盆栽试验表明 相对于无植物修复对照 黑麦草在两个月内对浓度为3 3 1 3 7 8 3 7m g k g 的菲和 浓度为4 2 2 3 6 5 3 8m g k g 的芘的降解效率分别为8 3 2 4 9 1 9 8 黑麦草的根部 和芽部都可以摄取菲和芘 但是芽部的含量少于根部的含量 x us h e n g y o u e ta 1 2 0 0 5 据报道 黑麦草可从土壤中吸收大量的苯并 a 芘 并对水体中苯并 a 芘的积累量也比周围水体高数千倍 t a m n f y g u o c l e ta 1 2 0 0 2 在进行植物 修复时 关键要选择高效修复植物 选取修复植物时 第一要考虑的是植物对污 染物较强的同化能力 另一方面 所选择的植物应具有易存活 生长快 适应性 强 根系发达等特点 植物的根是植物与污染物最密切接触的部分 根系的发育 状况在很大程度上决定了根圈的降解效率 据报道 较高的根枝比 根中碳的释 放等因素与根圈土壤微生物数量显著相关 并影响污染土壤修复的有效性 从以 往研究看 单子叶植物的纤维状根系统比双子叶植物粗大的根系统覆盖的表面积 更大 因而降解效率更高 k i p o p o u l o u a m e la 1 1 9 9 9 植物修复是颇具潜力的土壤有机污染治理技术 与其他修复措施相比 植物 修复有其独到的优点 在修复土壤的同时也净化 绿化了周围的环境 对环境扰 动少 对土壤来说属于原位处理 修复过程也是土壤有机质含量和土壤肥力增加 的过程 被植物修复净化后的土壤适合于多种农作物的生长 植物固化技术使地 表长期稳定 控制风蚀水蚀 减少水土流失 有利于生态环境改善和野生生物的 繁衍 h a w t h o r n e s b e ta 1 2 0 0 0 植物修复也有其局限性 植物对污染物的耐受能力或积累性不同 某种植物 仅能修复某些污染物 而土壤中的有机污染物成分复杂 这往往会影响植物修复 的效率 植物修复周期长 过程缓慢 必须满足植物生长所必须的环境条件 对 土壤肥力 含水量 质地 盐度 酸碱度及气候条件等要求较高 植物修复效果 易受自然因素如病虫害 洪涝等的影响 植物收获部分的不当处置也会在一定程 度上产生二次污染 s a l i c i s f 1 9 9 9 1 1 4 4 微生物修复多环芳烃污染 微生物修复指的是利用微生物的氧化 还原 分离以及转移和变换元素的能 力来去除和解毒土壤 底泥沉积物和地下水中的污染物 从而使污染的土壤部分 或完全恢复到原始状态 细菌 真菌和藻类中都有大量可以去除污染物的物种 增加微生物对p a h s 等有机毒物的承受能力和降解能力 其优点在于 固定化创 造的微环境有利于屏蔽土著菌 噬菌体和毒性物质对菌体的侵害 保证高效外源 茵的稳定存在与高活性 可有效解决引进的菌难以同土著微生物竞争的问题 a n g o v e mj e ta 1 2 0 0 2 目前常用的固定化技术有包埋 吸附固定 p v a 胶囊 技术等 微生物固定化技术已成为土壤修复领域的热点研究方向之一 p a h s 污染土壤微生物修复的另一个关键技术是生物表面活性剂的应用 生 物表面活性剂能够显著降低表面张力 促进p a h s 组分的解吸附并在土壤孔隙中 流动 可以显著提高高分子量p a h s 组分的生物可利用性 提高生物降解效率 因此 采用生物表面活性剂增溶的强化生物修复技术越来越多地应用于p a h s 1 4 芘 p y r e n e 是具有四个苯环的稠环芳烯 是检测多环芳烃污染的指示物 芘 已经被列入具有致癌性的多环芳烃之列 巩宗强 等 2 0 0 1 其代谢物醌 q u i n o n e 比芘毒性更大 具有致突变性 r a v e l e tc e ta 1 2 0 0 0 芘属于难降解的p a h s 很难被一般微生物所降解 但在被p a h s 长期污染的环境中由于长期的驯化作 用也存在一些芘降解菌 目前国内外有大量的学者做了关于芘降解代谢的研究 分离纯化到一些可以高效降解芘的菌株 并对于芘的代谢途径和机理有了一定的 了解 降解芘的微生物主要集中在m y c o b a c t e r i u m p s e u d o m o n a s r h o d o c o c c u s 这三个属 如表1 2 所示 目前国内外研究芘降解的重点是细菌和真菌 对于 植物和藻类的研究相对少一些 s i d n e ym n c e ta 1 研究了s e l e n a s t r u m c a p r i c o r n u t u m 羊角月牙藻 对菲 芘和荧葸代谢情况 s e l e n a s t r u mc a p r i c o r n u t u m 羊角月牙藻 对三种多环芳烃利用的顺序是 芘 荧葸 菲 但是其降解速率 是 荧葸 芘 菲 而且芘完全降解所需要的时间也较长一些 究其原因可能是 芘的苯环结构比较稳定较难被利用 并且通过活细胞和死细胞的对比发现死细胞 对菲也有一个吸收过程 但是菲没有被降解 只是一个单纯的物理吸附过程 s i d n e ym n c e ta 1 2 0 0 5 表1 2 代谢芘的菌株 菌株属菌株属 k r 2 b b l p y p y l 8 m f l a v e s c e n s m y c o b a c t e r i u m m y c o b a c t e r i u m m y c o b a c t e r i u m m y c o b a c t e r i u m m y c o b a c t e r i u m u w l s f l t n a l s p y r n a l p h 6 l a k l r h o d o c o c c u s r h o d o c o c c u s r h o d o c o c c u s p s e u d o m o n a s p s e u d o m o n a s 1 5 山东大学硕士学位论文 r j g i i1 3 5 m y c o b a c t e r i u m k 1 2p s e u d o m o n a s m y c o b a c t e r i u m b 2 4p s e u d o m o n a s p y r1 m y c o b a c t e r i u m x p w 2 p s e u d o m o n a s m y c o b a c t e r i u m b c e r e u ss t r a i np 21b a c i l l u s s y a n o i k u y a es t r a i n s a n t m u 3 c o r y n e f o r ms p h i n g o m o m a s r l k m s m y c o b a c t e r i u m 1 2 2 芘代谢途径 芘的代谢途径有两种 一种是通过双加氧酶的途径完成的 一种是通过单加 氧酶途径完成的 有的菌株能矿化芘 有的只能将其降解成某种中间代谢产物 一般细菌可以把芘代谢到4 5 二酮芘 分枝杆菌可以继续降解4 5 二酮芘 h e i t k a m pm a 等首次描述了细菌矿化芘 通过液相色谱 核磁共振 质谱分析等 技术鉴定了分枝杆菌在代谢芘的过程中形成的七种代谢物 三个环氧化物 顺式 4 5 二羟基芘 反式4 5 二羟基芘和芘醇 和四个环裂解物 4 h y d r o x y p e r i n a p h t h e n o n e 4 p h e n a n t h r o i ca c i d 邻苯二甲酸和苯乙烯酸 这些代 谢物里同时含有顺式和反式4 5 二羟基芘 表明存在多种起始双加氧酶进攻芘的 方式 h e i t k a m pm a 1 9 8 8 y a n n al i a n g 等研究了分枝杆菌k m s 代谢芘的中间 产物 并通过二维电泳技术技术分析了菌株m y c o b a c t e r i u ms pk m s 在代谢芘的 过程中相关降解酶 确证了分枝杆菌降解芘的相关中问产物和降解酶 进一步完 善了分枝杆菌代谢芘的途径 y a n n al i a n g e t a l 2 0 0 6 如图1 2 所示 1 6 山东大学硕士学位论文 圆熹 p y 耐吣 c i s 4 5 p y 袱l c d i h y d m d i 1 1 14 l imonooxpyrene 4寥 5 一 4 5 d i h y d r o x y p y r c n c p y r c n c 4 5 d i o n c l p y l c n c 4 5 一o x i d e t r a n s 4 5 p y r e n c d i h y d r o d i o l 胀x u 锄一 观 等掣 l iq u i n o n e io x i d a s e i 1 6 p h e n a n t h r c n e 4 5 d i c a r b o x y l i ca c i d 3 4 d i h y d r o x y b c 毗 i ca c i d p h t h a l i ca c i d 图1 1m y c o b a c t e r i u ms p s t r a i nk m s 降解芘的途径 m y c o b a c t e r i u mv a n b a a l e n i ip y r 1 是第一株被发现具有降解芘能力的菌株 s e o n g j a ek i m 等利用代谢组学 基因组学和蛋白组学技术研究了该菌株对芘的 代谢途径 并构建了一个完整全面的m y c o b a c t e r i u mv a n b a a l e n i ip y r 1 对芘的代 谢途径 基因组序列分析结果鉴定了之前推断的与芘降解有关的基因序列 通过 凝胶电泳技术和液质联用技术研究分析了该分支杆菌对芘代谢途径中相关的酶 实验数据鉴定了2 7 种构建完整芘代谢途径所必需的酶 研究结果表明 m y c o b a c t e r i u mv a n b a a l e n i ip y r 1 是通过o p h t h a l a t e 和1 3 k e t o a d i p a t e 途径代谢 芘的 肽段技术结果表明在芘代谢途径中有1 8 种相关酶上调了2 倍多 而且在 利用芘生长的细胞中环羟基化氧化酶的末端亚基 氢醇脱氢酶和环裂解双加氧酶 有三个拷贝 综合所有结果s e o n g j a ek i m 等构建了一个菌株m y c o b a c t e r i u m v a n b a a l e n i ip y r 1 代谢芘的更清楚更全面的代谢途径 s e o n g j a ek i m e ta 1 2 0 0 6 如图1 2 所示 1 7 观 瓣 q 锄耋 i 山东大学硕士学位论文 1 8 p 2 l p 2 2 p 2 3 p 2 4 p 2 5 对 盯 l 2 5 o o h t 融啷 p 4 p 5 p l o 1 ls 4 上s i1 刚驳三 1 ls 1 2 甲静t 1 7 厂 7 哪 1 0 0 c 一 上s 1 8 1 8 i 1 0kr0c 1 ls 1 9 p 2 0 o 毒 2 1 囊 曲w u o o a 翻竹 龋 图1 2m y c o b a c t e r i u mv a n b a a l e n i ip y r i 降解芘的途径 p 1 p 2 5 芘代谢相关产物 s i 2 1 芘代谢相关酶 i 搿邮 c善 h 1p 曙瞎 鼯 山东大学硕士学位论文 1 3 微生物修复技术发展目标 生物修复技术是一种生态友好的代谢消除污染物的方式 在节省能源 时间 和少用化学试剂的基础上将化合物转化成低毒或无毒的形式 目前 微生物降解 污染物的主要目标是 陈双雅 等 2 0 0 2 1 高效降解菌株的筛选和培育 2 研究各种微生物降解污染物的酶促反应机理和途径 3 探知有机污染物降解的酶 系 及相关基因 簇 4 研究影响微生物降解污染物的环境因子和其它生物因子 5 利用生物技术手段构建高效的遗传工程菌株并应用于环境污染物的治理 1 9 山东大学硕士学位论文 第二章土壤中p a h s 提取及分析方法的建立 为确定选择采集土壤中样品中p a h s 污染水平 实验利用索氏提取技术 超声辅助提取技术及超临界c 0 2 提取技术的比对提取结果 结合g c f i d 及 g c m s 技术测定了济南炼油厂厂区内不同采样点土壤中1 6 种p a h s 的种类及 含量 并对其污染状况进行了评价 确定用济南市炼油厂厂区内p a h s 污染土 壤作为菌种筛选的备选样品 2 1 材料 2 1 1 主要仪器 g c 6 8 9 0 型气相色谱仪 配有火焰离子化检测器 f i d 美国安捷伦公 司 g c m s q p2 0 1 0 型气相色谱 质谱联用仪 日本岛津公司 s p e e ds f e 型超临界流体萃取仪 美国a p p l i e ds e p a r a t i o n s 公司 k q 2 5 0 b 型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 r e 5 2 a 型旋转蒸发仪r 系列 上海申生科技有限公司 索氏提取装置 电子恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司 s h b i l i a 型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司 2 1 2 主要试剂 16 种p a h s 混合标样1m g m l a c c us t a n d a r di n c 12 5m a r k e ts t r e e t n e w h a v e n c t0 6 5 1 3 u s a 硅胶 青岛海洋化工厂 2 0 0 目 用三氯甲烷索氏提取1 6 小时 烘箱中1 4 5 0 c 活化1 6 小时 置于干燥器中保存备用 无水硫酸钠 莱阳市康德生化有限公司 4 0 0 0 c 烘4h 于干燥器中保存 高纯液体c 0 2 纯度大于9 9 9 9 北京大兴气体厂 二氯甲烷 天津市大茂化学试剂厂 正己烷 天津市凯通化学试剂有限公 司 丙酮 莱阳市康德生化有限公司 中性氧化铝 天津市化学试剂三厂 2 l 山东大学硕士学位论文 以上试剂除特殊说明均为分析纯试剂 实验所用全部玻璃器皿均用去污粉清洗 用重铬酸钾洗液浸泡 再分别用自 来水和去离子水洗净 最后用乙醇淋洗烘干 使用前用溶剂润洗 2 2 实验方法 2 2 1 十六种p a h s 分析方法的建立 标准溶液配制 取p a h s 混标储备液 1 0 0m g 1 用j 下己烷依次逐级稀释 配成5 0 0 2 0 0 1 0 0 0 5 0 o 2 0 0 1 0m g m l 的标准系列溶液 采用g c f i d 进行定量分析 结合g c m s 技术进行定性分析 g c f i d 及g c m s 分析条 件如下 1 g c f i d 色谱柱h p 5 弹性石英毛细管色谱柱 3 0r e x 0 2 5m mi d o 2 5 岬 柱流量 1 0m l m i n 柱温8 0 0 c 保持lm i n 以1 5 0 c m i n 升到2 5 5 0 c 保留1m i n 再以 l o c m i n 升到2 6 5 c 保留lm i n 最后以2 5 0 c r a i n 升到2 9 5 0 c 保留1m i r a 检测 器温度 3 0 0 0 c 无分流进样模式 温度2 5 0 0 c 进样量 1p l 2 g c m s 色谱条件 进样口温度2 9 0 0 c 接口温度2 9 0 c 色谱柱h p 5 3 0