大豆渗入系的构建以及相关状的QTL定位.doc

大豆相关性状的QTL定位摘要： 大豆是世界上主要的栽培作物之一 。它的许多重要农艺性状和经济性状都是受多基因控制的数量性状，针对大豆重要农艺性状和分子标记的使用 ，阐述了常用大豆 QTL 定位的原理和方法， 介绍了大豆 QTL 国内外研究进展及 QTL 定位的存在问题和解决途径 并对其研究进行展望。关键词：大豆 ；QTL 定位； 原理 ；方法； 研究进展 ；存在问题；解决方法大豆，学名Glycine max (L.) Merrill，属于豆科大豆属。大豆作为重要的粮经作物，种植遍及全国占粮食耕地面积的 8% 、10%，占全国油料作物总面积的 60%，为人类提供主要的植物蛋白和油分。大豆蛋白质在豆科作物中的蛋白质含量最高，并含有较多的必需氨基酸，尤其是赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸的含量分别是玉米的9、25和6倍，是人类摄取必需氨基酸的主要来源（张忠臣 2004）。此外大豆含有丰富的不饱和脂肪酸，可以降低人体内的胆固醇含量，相比花生、油菜等油料作物来说，榨取工艺较简单，花费成本低，可以以低于其他相同质量的植物食用油的价格出售，给人们生活带来经济实惠（荆慧贤 2010）。然而中国大豆产业正陷于一种困境：一方面大豆种植面积不断萎缩，大豆产量和品质低劣；另一方面国外优质大豆迅速占领中国市场，大豆安全成为国家粮食安全。要想摆脱这种困境，必须以提高大豆产量和改良大豆品质作为我国大豆育种的长期目标。然而大豆育种的目标性状大多是数量性状，受多个基因控制，其表现很大程度上受环境的影响。应用传统的数量遗传学的方法，可以检测其整体遗传效应和环境效应，却无法分析单个基因的遗传效应，更无法对单个QTL进行遗传操作。近年来，随着植物基因组学的发展，特别是大豆数据库的建立，给大豆定位以及大豆育种提供了前所未有的机会。传统育种技术与现代分子生物技术的完美结合所产生的分子育种技术，正在也必将发挥更大的作用。通过分子育种技术和手段，发掘新的有利基因，改良品种和创造新的种质资源，将很好的解决大豆生产所面临的问题。1QTL分析数量性状由大量的、微小并可加的基因控制，这些基因的遗传行为符合孟德尔规律。归结起来具有一些特点：数量性状是可以度量的；数量性状呈连续性变异；数量性状容易受环境影响；控制数量性状的遗传基础是多基因系统（盛志廉 1999）。大豆的许多性状都是数量性状，如大豆的产量、品质、株高、成熟期、抗逆性、抗病性等。近年来随着现代分子遗传技术的发展，一些高效的DNA遗传标记将各种作物的遗传图谱研究推向实用化，从而将复杂的数量性状分解为多个数量性状分解为多个数量性状主基因座进行定位分析。通常将这些基因座称为数量性状基因座（quantitative trait locus,QTL）。1.1 QTL定位原理QTL 定位实质上就是分析分子标记与QTL之间的连锁关系。QTL定位的目的首先是确定一个数量性状受多少个QTL作用的控制，然后确定它们在染色体上的位置，并估计出它们对数量性状作用的效应大小及互作效应。实现QTL定位的基本步骤为：选择用于定位的合适遗传标记；选择在所研究数量性状上处于分离状态的纯系或高度近交系；进行系间杂交，获得分离世代的F2个体或者其他分离群体；检测各世代群体中个个体的数量性状值和标记基因型；分析标记基因型与数量性状之间是否存在连锁关系，确定QTLs连锁群，并估计QTL效应。进行QTL定位首先需要一个足以覆盖整个基因组的多态标记基因座的连锁图谱，其次要求数量性状在群体存在变异。（盛志廉1999）1.2 QTL作图群体的构建1.2.1QTL作图所用的分子标记体系构建标记连锁图是数量性状基因定位（ Q T L ) 、基因图位克隆以及分子标记辅助育种的基础，选择合适的多态性标记又是构建标记连锁图的基础。应用各种分子标记系统已建立了许多植物物种的遗传图谱，这些标记可以概括为三种：（1）基于酶切技术的分子标记：限制性酶切片段长度多态性（RFLP）（Botstein et al .1980）,酶切扩增多态性序列CADS（Lyarnichev et al .1993）。（2）基于PCR技术的分子标记：DNA随机扩增多态性（RAPD）（Willium et al.1990）微卫星（SSR）（Litt and Luty 1989）标签序列位点（STS）（Palazzolo et al .1991）特异序列扩增区（SCAR）(Williany et al.1991)。（3）基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记：扩增片段长度多态性（AFLP）（Vos et al.1995）(4)基于DNA芯片技术的分子标记技术单核苷酸多态性（SNP）(Lai et al.1998)。（康定明 2010）1.2.2 QTL作图所用的分离群体作图群体及亲本的选择是作图中最重要的决定因素,亲本间必须有足够多的D N A序列多态性, 如果缺少D N A多态性, 分离分析及连锁作图都是不可能的。根据分离群体的特点，一般把作图群体分为临时性作图群体和永久性作图群体。临时性作图群体主要有 F 2群体、回交群体( B C )。F 2群体可以利用两个亲本杂交得到的 F l代自交获得, 它易于配制( 自交不亲合材料除外) , 需要时间短。它所提供的遗传信息最为丰富, 可以估算加性效应及显性效应。张德水用栽培大豆 “长农4”与野生大豆 “ 新民 6 ” 的杂种 F 2群体, 以 R F L P标记为主, 构建我国第一套大豆分子遗传图谱。（张德永1997）。杨喆利用科新 3号与中黄2 0杂交得到的F 2构建了一张含l 2 2个 S S R标记、覆盖l 7 l 9 . 6 c M、由3 3个连锁群组成的大豆遗传图谱（杨喆2004）。虽然F2群体易获得但是由于F2植株存在分离，无法保存再次获得F2,因此无法重复试验，也很难进行多年多点研究，同时F2群体存在杂合基因型，对于显性标记无法区分显性纯合基因型和杂合基因型。对于自交不亲和的材料多采用回交的形式来配制BC群体, 就是对杂交 F l代用轮回亲本回交l 2次, 短时间即可建立一个回交系群体。这样的材料也有限, 只能使用一代, 重组交换的信息量比 F 2群体少。上述群体, 由于其个体自交所得到的后代将出现分离, 不能永久保存。另外, 由于这些群体很难甚至不可能保证部分 Q T L作图所需的不同地点及不同时间的试验。因此, 用其进行遗传作图和定位受到限制。它们的显著特点是暂时分离群体, 仅能使用一次, 遗传背景复杂, 容易造成定位偏差, 很难对单个 Q T L进行准确鉴定和定位。永久性作图群体包括加倍单倍体群体（DH）、重组自交系群体（RIL）、近等基因系群体（NIL）、导入系群体（Ils）和永久F2群体。R I L群体是将 将 F 2个体连续自交或同胞交配、 或群体内随机交配, 使得杂种的基因得以分离并进行重组, 直至家系内个体基因型纯合稳定、家系间基因型各异, 这些家系就构成了重组自交系群体。 R I L群体基因基本纯合, 群体结构稳定, 也是一个永久性分离群体, 是应用较多的作图群体之一。荆慧贤对137RIL的亲本冀豆12与冀黄13具有多态性的引物对其148个家系进行分析，构建了一张包括73个SSR标记，20个连锁群的遗传连锁图谱，覆盖基因组长度为49.9cM。另外对138RIL亲本冀豆12与冀nf58具有多态性的引物对其176个家系进行SSR分析，构建了一张包括了57个SSR标记，16个连锁群的遗传连锁图谱，覆盖基因组长度为514.7cM（荆慧贤2010）。D H群体是通过 F l诱导单倍体并加倍形成的群体, 群体内基因完全纯合, 群体内的差异构成了分离群体的遗传特性。杨旭等应用AFLP、SRAP、RAPD、SSR及同工酶等5种标记构建的326个标记位点的白菜遗传图谱和81个DH株系群体，采用MapQTL5软件与MQM作图法对白菜的叶片数与单株重进行QTL定位及遗传效应的分析（杨旭）。近等基因系群体料是通过轮回亲本对非轮回亲本的连续回交并保留目标性状的差异, 因此近等基因系之间除了目标性状以外, 其它性状位点都相同。有人利用世界上粒重最大的水稻品种之一SLG-1(供体亲本)与小粒品种日本晴(Nipponbare, 轮回亲本)杂交, 在各回交世代选择粒重较大单株与日本晴回交, 构建水稻粒重和粒形的姊妹近等基因系(SNILs)。对获得的 73 株 BC4F1 单株进行粒重频率分布统计, 选择粒重频率分布在 4 个峰值处的代表性单株, 自交获得4 个 BC4F2 SNILs 群体（李自超 2010） 。I L s 群体是通过连续的回交和自交并结合标记辅助选择获得的与轮回亲本只有一个或极少数供体亲本等位基因差异的导入片段群体。张启发创造了一种“永久F2群体”，即首先单粒传法获得RIL（比如200株），然后给每一株（系）都单独编号（1200），作图时用特定的单株进行组合（比如：1-101，2-102，3-103，4-104等等），获得若干F1代，即相当于最初双亲的F2代。由于RIL单株基因纯和可以永久保存，则F2代也可以重现，所以称为“永久F2群体”（华金平）。近等基因系、回交导入系和染色体片段带换洗三个群体基本特征是整个染色体组的绝大部分区域完全相同，只在少数几个甚至一个区段（目标性状区段）彼此存在差异，因此，它能使基因组中只存在一个或少数几个QTL分离，消除背景干扰和消去主效QTL对微小QTL效应的掩盖作用，对QTL的精细定位有很大帮助。尽管这些群体构建时间长，工作量大，但它们对QTL分解和精确定位的独特优越性使其成为分离和克隆QTL的理想群体。1.2.3QTL定位的方法最早提出的几种作图方法,包括 Weller(1986)和 LuoKearsey(1989)所发展的单个标记与QTL 连锁的估计方法。但这类作图方法的效率将随着标记与QTL 之间实际距离的增加而下降。为了提高效率,每一染色体上就必须 定位更 多的 遗传标记。Jensen、Lander Botstein和Knapp(1989)发展了以连锁图上两个相邻分子标记为基础的作图方法可以同时利用两个共显性标记的分离信息 ,从而获得这两个标记之间的染色体片段上有关QTL 的最大连锁信息。其 中LanderBotstein 的区间作图法 倍受遗传育种学家的推崇。单标记分析法单标记分析法是最简单的分析标记与性状关联的方法 。它利用每个标记位点不同基因型间的性状均值差异， 以传统的单因素方差分析法测验被研究的数量性状在标记基因型间的差异显著性。 如果差异显著 ，说明控制该数量性状的 QTL 与标记有连锁。比如在1991 年Tanksley就通过单标记分析法对番茄杂交后代中受环境因素影响的数量性状进行了分析。区间作图法由于单标记分析法存在不能确切估计 QTL 的可能位置和容易出现假阳性等问题 。1989年 Lander 和Botstein首次提出了基于两个标记的区间作图方法。其主要贡献是建立了 QTL 定位的基本框架 ，使得能够在整个基因组上搜索 QTL 的位置 区间作图法是以一元回归模型和正态分布的极大似然函数为基础，借助于完整的分子标记连锁图谱来计算基因组的任一相邻标记之间是否存在 QTL 的似然函数比值的对数LOD值 。根据染色体上各点的 LOD 值可以描绘出一个 QTL 在该染色体上存在与否的似然图谱， 当 LOD 值超过某一给定的临界值时， 即表明存在一个 QTL，其置信区间为对应于峰两侧各下降 1 个 LOD 值的图谱区间。1992 年 Haley和 Martinez 等对Lander 和Botstein 提出的区间作图法作了一些改进 提出了区间作图的回归分析方法。 回归分析法同 Lander和 Botstein 的极大似然作图法相比 ，两者的结果相似 ，但回归分析法的计算量大大减少。 因而由 Haley等提出的区间作图的回归分析法一度成为研究QTL 定位的标准方法而被广泛接受。 复合区间作图法针对区间作图法存在的问题 Zeng 等（1993）提出了把多元线性回归与区间作图结合起来的复合区间作图法。 此法仍然采用区间作图法中 QTL 似然图谱来显示 QTL 的可能位置及显著程度， 但此法结合了区间作图法和多元回归特点的一种 QTL 作图方法 ，其遗传假设是 数量性状受多基因的控制 。该方法拟合了其他遗传标记 ，即在对某一特定标记区间进行检测时 将与其他 QTL 连锁的标记也拟合在模型中以控制遗传背景效应。例如朱晓丽（2006）采用复合间作图法构建了大豆遗传图谱构建并对影响产量和品质QTL进行了定位。Lin（1995） 等在研究高粱开花期遗传时用到了此方法。 基于混合线性模型的复合区间作图法基于混合线性模型的复合区间作图法是把控制背景遗传变异的分子标记效应归为随机变量 使其不会影响对 QTL 位置和效应的无偏估计。 此方法用随机效应的预测方法获得基因型效应以及基因型与环境互作效应， 然后再用区间作图法进行遗传主效应及基因型与环境互作效应的 QTL 定位与分析 。该方法的遗传假定是数量性状受多基因控制，它将群体均值及 QTL 的各项遗传效应看作为固定效应， 而将环境 QTL 与环境 分子标记等看作为随机效应。朱军于 1998 年提出了基于混合线性模型的复合区间作图法。采用随机效应的无偏预测方法，既能预测基因型值和基因型环境互作效应值，同时能够运用复合区间作图法间接分析QTL的加性、显性遗传主效应及其与环境的互作效应，还能定位在特定发育阶段表达的QTL，还可以对多环境条件下的表型数据进行分析，预测包括上位性效应的遗传效应及其与环境的互作效应。其他QTL定位方法除去前面所提到的QTL定位方法，还主要有Bayesian作图法、双侧标记回归、多亲本作图法等。Bayesian作图法是基于 作图方法，其过程是先推测QTL个数，再依据Bayesi因子决定最可能的QTL个数。双侧标记回归法士应用回归方法，收索在全染色体组上任何两个标记之间是否存在QTL并确定其最可能的位置和效应。多亲本作图法是单区间作图法在多亲本杂交群体中QTL定位分析的推广，它克服了其他作图方法中仅限于利用在一个或几个性状上存在较大遗传差异两个亲本的缺点，充分利用了自然基因资源。2大豆QTL定位的研究进展到目前为止， 国内外已经有过许多关于大豆 QTL研究的报道，并建有专门的学术共享网站 （）。1990 年发表了大豆中第 1 篇 QTL 定位的报道 ，此后 ，相继出现了与众多数量性状相关的 QTL 定位的报道。已有关于大豆一些农艺性状的 QTL 定位研究的报道中定位的农艺性状包括生殖性状、籽粒性状 、种子组成 、营养特征、 形态特征、 抗病特性和营养效率等 。如开花期、生殖性状、籽粒大小、籽粒硬度、籽粒重量、种子蛋白含量、种子脂肪含量、株高、抗倒伏性、叶长、 叶宽等形态性状。（MANSUR L1993）（LEE S H 1996）(KEIM P 1990)（朱晓丽2006）（万昆2009）（吕祝章2006）（宋显军2001）（邢慧贤2010）（关荣霞2004）（吴小雷2001）（王智贤2008）（王英2008）。 研究发现大多数的QTL成簇出现 ，一般会出现一个效应较强的主基因 ，大多数主效 QTL 是单独发挥作用。 通过收集并统计国内外已经定位的 QTL 可以知道产量和品质等 4 个性状相关的 QTL 在各连锁群均有分布。在 C2 E 和 K 等 3 个连锁群检测到产量相关的主效 QTL ，表明在主效QTL区域附近存在较多的微效QTL。粒重相关的QTL在A1 、G 和 L 等 3 个连锁群分布最多 。在 C2 和 L 连锁群检测到2个主效QTL。蛋白质含量相关的QTL在C1、E、G 和 I 连锁群分布最多。脂肪相关的QTL主要分布在 H 和 I 连锁群 ，其中在 I 连锁群检测到主效 QTL 与蛋白含量相关的主效QTL 位于同一区域。3 QTL定位应用及存在的问题QTL 定位的目标之一就是尽可能多地发掘有利的等位基因 ，以应用于分子标记辅助选择育种 培育出优质、 高产、高抗和适应性广泛的新品种 。因此 ，采用不同的定位群体鉴定出尽可能多的控制同一有利性状的基因，并进行表型效应估计和不同环境中的评价，将优良的基因聚合到一个品种是QTL定位的研究的目标。目前我国 QTL 定位存在的问题及解决途径如下（阮成江2003）（王永军2001） 目前用QTL定位的群体偏小 ，属于初步定位 ，定位的精确性和稳定性均不高。由于 QTL 易受环境的影响 而目前 QTL 研究采用的定位群体大部分是 F2 群体， 无法设计田间重复试验。目前用于分析 QTL 的上位效应和环境互作效应的统计方法和软件仍不够完善和精确。所构建的大豆遗传图谱的饱和度不高，对于QTL基因进行分离也有困难。要解决上述问题应该选择性状差异大的亲本进行定位，并且适当的增加样本容量；培育利用永久性群体，经过多年多点的QTL检测 获得稳定的QTL；开发新的统计方法和设计新的软件来进行QTL的精细定位；选择群体的时候应该选取遗传信息完成的 能世代繁衍的群体 增加图谱的饱和度为分析作物的产量、品质等有关的性状与环境相互关系提供理论依据。4 QTL研究展望30多年来，随着分子数量遗传学的快速发展，作物复杂数量性状的研究取得了令人瞩目的进展。定位、克隆技术体系的建立使作物复杂数量性状尤其是经济性状的遗传改良和分子操纵成为可能。虽然目前大豆QTL 定位主要只是初级定位，精细定位还需要进一步验证 。但随着大豆遗传连锁图谱的日益完善， 并结合分子标记技术的逐渐成熟 ，已可以把控制一个复杂性状的多个QTL分解开来，并且确定各QTL在染色体上的大体位置及其效应等。随着作物 QTL 定位研究的深入 ，特别是高密度遗传图谱的构建以及更为有效的统计分析方法的诞生以及 SNPs的出现，可以预期 QTL 定位研究将在 QTL精细定位 、分子标记辅助 QTL 选择以及 QTL克隆分离等方面将分阶段实现目标， 最终为分子标记辅助育种和图位克隆奠定基础。5 参考文献1 张忠臣，战秀玲等大豆QTL研究进展J大豆科学，2004,23(3)2 邢慧贤大豆品质及产量相关性状的QTL分析D河北师范大学20103 盛志廉数量遗传学M北京：科学出版社3453464 张忠臣，战秀玲等大豆QTL研究进展J大豆科学，2004,23(3)5 康定明，华金平植物基因组作图手册M北京：中国农业大学出版社21226 张德永,董伟等用栽培大豆与半野生大豆间的杂种F2群体构建基因组分子标记连锁框架图J科学通报，1997，42 (12 )1326-13307 杨喆， 关荣霞等大豆遗传图谱的构建和若干农艺性状的QTL定位分析J植物遗传资源学报，2004,5(4)：3093148 杨喆， 关荣霞等大豆遗传图谱的构建和若干农艺性状的QTL定位分析J植物遗传资源学报，2004,5(4)：3093149 杨旭，徐阳俊等应用DH群体进行白菜叶片数和单株重的QTL定位与分析J分子植物育种，2008年第6期10 李自超，姚国新 等利用 4个姊妹近等基因系群体定位水稻粒重和粒形 QTL J作物学报，2010,36(8)：1310131711 华金平汕优63“永久F_2”群体构建及其杂种优势的遗传研究D华中农业大学200312 杨喆，关荣霞等.大豆遗传图谱的构建和若干农艺性状的QTL定位分析J植物遗传资源学报，2004,5(4)：30931413 Weller.J.I.1986,Biometrics.42,627-641.14 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