（生物医学工程专业论文）近红外光谱技术用于茶碱浓度检测建模初步研究.pdf

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 和在线质量控制方面就会有很大的发展前景。论文应用b p 人工神经网络- 近红外 光谱分析技术对茶碱样本浓度进行了定量分析，该方法完全可以扩展到其它药物 中进行定量分析和质量控制。最终可望建立起药物近红外光谱谱图及分析库。 关键词：近红外光谱分析技术，药物分析，人工神经网络，逼近度 重庆大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t n e a ri n f i a r e ds p e c t r o s c o p yt e c h n o l o g yi saf a s t , e f f i c i e n ta n dn o n - i n t r u s i v ea n a l y s i s t e c h n o l o g y , w h i c hh a sb e e nw i d e l ya p p l i e di np h a r m a c e u t i c a la n a l y s i sf i e l d ，i tc 躲n o t o n l yb eu s e df o rm e d i c i n ei nv a r i o u sp h y s i c a ls t a t e , s , s u c h 器m a t e r i a l s c a p s u l ea n d l i q u i dp r e p a r a t i o n s ，b u ta l s of o rv a r i o u sk i n d so fm e d i c i n e s ，s u c h 够p r o t e i n , c h i n e s e h e r b a lm e d i c i n ea n da n t i b i o s i s f i r s t l y , t h i sp a p e ri n t r o d u c e dt h ec r e a t i o no f n e a ri n f r a r e ds p e e t m n , i t sf e a t u r e s 鹊 w e l la st h et h e o r e t i cp r i n c i p l e so ft h el l e f l l i n f r a r e ds p e c t r u mt e c h n o l o g y t h e n , t h e f e a t u r ea n dp r o c e d u r eo fn e a ri n f r a r e d s p e c t r u ma n a l y s i si so u t l i n e d , a n d t h e d e v e l o p m e n to f t h ei l e a l i n t i a r e ds p e c t r u mt e c h n o l o g yi ss u m m e du p f o l l o w i n go n , t h i s p a p e rb r o u g h tf o r w a r dt h ee x p e r i m e n ts c ：i e l l a r i of o rt h ep r e d i c t i n gm o d e lo ft h e t h e o p h y l l i n et h i c k n e s s ，w h i c he m p l o y st h ei r p r e s t i g e - 2 1f o u r i e rt r a n s f o r m a t i o ni n 丘a r e d s p e c t r a li n s t r u m e n tt oc o n d u c tf u l ls p e e t m ns c a no ft h em e d i c i n es a m p l e , t h e nt o g e n e r a t et h ea b s o r b e n c yg r a p h , w h i c hi st h eb a s ef o rb u i l d i n gt h et h i c k n e s sc o r r e c t i o n m o d e l t 1 1 i sr e s e a r c hu s e st h eb pa r t i f i e i a ln e u r a ln e t w o r k st ob u i l dt h ec o r r e c t i o nm o d e l i no r d e rt oa v o i dt h eo v e rf i t t i n gp r o b l e m , t h ev a l u eo fc l o s e n e s si si n t r o d u c et od e t e c t o v e i f i t t i n ga n dt h u so p t i m i z et h em o d e lp a r a m e t e r s t h i sp a p e rs t u d i e dt h ei n f l u e n c et o t h eb pn e t w o r l 【，w h e nc o n d u c t i n g1 - o r d e rd i f f e r e n t i a lp r e p r o c c s st ot h es p i n ：t i r o ld a t a , a n dt h er e p e t i t i o na n ds t a b i l i t yo ft h i sm e t h o d sw e r ev e r i f i e d t h et e s tr e s u l t ss h o wt h a t t h e1 - o r d e rd i f f e r e n t i a lp r e p r o e e s sc a l le f f i c i e n t l yr e d u c et h en o i s ei ns p e c t r u md a t a , i n c r e a s et h ea c c u r a c yo ft h i c k n e s sp r e d i c t i o no fa n yi l n k n o w ns a m p l e t h i sp a p e r c o m p a r e dt h em o d e l sb u i l db yc o n v e n t i o n a lm e t r o l o g ym e t h o d ss u c ha sm u l t i p l el i n e a r r e g r e s s i o na n a l y s i s ，p r i n c i p l ec o m p o n e n tr e g r e s s i o na n dp a r t i a l l e a s t s q u a r e r e g r e s s i o n , t om o d e l sb u i l db yb pn e t w o r k s , a n dd e m o n s t r a t et h es u p e r i o r i t yo fb p n e t w o r k si ns o l v i n gn o n - l i n e a rc l a s s i f i c a t i o n i nt h el a s t , t h i sp a p e rp o i n t e do u ts e v e r a l s h o r t c o m i n g so f t h i sl e s c a l c l a n dp o s s i b l ei m p r o v e m e n t s n e a r - i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y , p h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s , a r t i f i c i a l n e u r a l n e t w o r k , d e g r e eo f a p p r o x i m a t i o n 1 i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重麽盔堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 罗兰 签字日期：2 叼辎月夕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重废太堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重麽太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( v ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“4 ”) 学位论文作者签名：罗兰 签字日期：扣d 7 年石月穸日 导师签名： 巍剐二 签字日期：卸年，月幻日 重庆大学硕士学位论文l 绪论 1 绪论 1 1 研究的背景和意义 近红外光是指波长在7 8 0 n m 2 5 0 0 n m 范围内的电磁波，是人们认识最早的 非可见光谱区域。其光谱信息来源于分子内部振动的倍频与合频，并且主要反映 分子中c - h ，n h 与o h 基团的倍频与合频振动吸收l ”。由于近红外谱带宽，重 叠较严重，而且吸收信号弱，信息解析复杂，所以虽然该谱区发现较早，但分析 价值一直未能得到足够的重视。近年来，由于计算机技术与化学统计学软件的发 展，特别是化学计量学的深入研究和广泛应用，使其成为发展最快、最引人注目 的光谱技术之一。而且由于该技术具有方便快速，无需对样品进行预处理，适用 于在线分析等特点，在药物分析领域中正不断得到重视与应用【2 j ： 原料药的分析 近红外光谱法可用于原料药活性成分的分析。m a r k 等使用马氏距离分类技术， 通过近红外光谱对制药原料进行定性鉴别。s h a h 等则分别用马氏距离法和s i m c a 法这两种分类方法对制药原料的近红外光谱进行分类。另外，原料药的结晶状态、 粒径和密度在制剂生产和控制主要活性成分的过程中非常重要，可用近红外光谱 对原料药的不同物理性质进行检测。d r e a s s i 等利用近红外反射光谱，根据药物的 不同物理性质，对扑热息痛、布洛芬等几种原料药进行了成功的鉴别。 药物制剂中活性的含量测定 最早使用近红外光谱对片剂药物进行含量测定的是f d a 的s h e r k e n 。他用近 红外法测定一系列的甲丙氨酯标准溶液，建立了计算甲丙氨酯片含量的校正方程。 几年后，z a p p a l a 等继续考察了近红外对片剂和缓释胶囊中甲丙氨酯的含量分析， 对s h e r k e n 的方法作了改进。a l l e n 用近红外光谱法定量测定了片剂中的卡立普多、 非那西丁和咖啡因。为降低近红外分析的检测限，c o r t i 等尝试在分析前用氯仿进 行提取，测定了口服避孕药中的炔雌醇和炔诺酮。c h a s s , b * l r 使用近红外光谱分析了 西米替丁颗粒的含量，并用紫外光谱法作对照，结果基本一致。 药物制剂的鉴别和分类 c i u r c z a k 等用近红外光谱对含三种活性成分的药物制剂进行了分析，分别考察 了光谱的减除、光谱的再现和判别分析等数据处理方法在制剂的组成成分鉴别和 制剂样品分类中的应用。c 0 币等将马氏距离用于近红外光谱的分类，对l o 种抗生 素制剂进行定性区分，所有待测样品都得到了很好的分类。w u 等采用主成分分析 和偏最小二乘算法进行光谱的特征选择，从而实现对不同剂量的同种药物制剂的 区分。l o d d e r 等还将近红外光谱用于对片剂的直接测定，使用改进的载样装置分 重庆大学硕士学位论文l 绪论 析阿司匹林片剂，得到了较好的分类结果。 制药过程中的质量控制 s e k u l i c 等使用近红外光谱对粉末混合均匀性进行在线监测。混合物样品中含 1 0 苯甲酸钠、3 9 微晶纤维素、5 0 乳糖和1 滑石粉。首先用商品近红外光谱 仪收集样品的近红外光谱数据，然后用软件包对数据进行处理。结果表明，近红 外光谱技术作为一种对药物混合均匀性的实时的非侵入式分析方法是可行的、有 效的。 k i r s c h 等发现片剂样品近红外光谱的变化与包衣的厚度之间存在相关性。他们 对近红外光谱法在片剂的包衣过程监控中的应用作了进一步的考察。在用乙基纤 维素( e c ) 或羟丙基纤维素( h p m c ) 进行包衣的过程中，按一定的时间间隔取 样，测定片剂样品的近红外光谱。采用二阶导数变换和多元散射校正两种方法对 光谱进行处理，然后用主成分分析建立计算包衣厚度的校正模型。由于近红外光 谱法具有非破坏性，可以进一步测定样品的溶出度，考察包衣厚度与溶出度的相 关性，从而更好地控制包衣制剂的质量。 d r c a s s i 等对近红外反射分析在抗生素片剂生产控制中的应用进行了研究，采 用近红外光谱分析法结合化学计量学方法对抗菌素头孢呋肟酯片剂的生产进行全 过程监测。他们用对原始光谱数据的判别分析、对主成分分析得分的判别分析和 聚类分析三种方法分别对头孢呋肟酯的原料药、颗粒、片芯和片剂进行了鉴别， 结果较好；并用多元线性回归和偏最小二乘法对该化合物的含量和含水量进行定 量分析，也取得了满意的结果。 近年来，随着仪器、软件以及样品处理技术的发展，近红外光谱在药学领域 中的应用取得了很大进步。使用近红外光谱技术对药物制剂进行快速的非破坏性 分析已成为可能，制药工业企业也已开始发展近红外方法对药物生产过程的各个 环节进行监控。并且，近红外光谱技术已得到药品质量管理部门如美国f d a 和加 拿大卫生部的重视。由此可见，近红外光谱技术受到了越来越多的关注。随着近 红外光谱仪技术的不断提高和化学计量学的发展，近红外光谱技术在药学领域中 的应用将越来越广泛。 1 2 近红外光谱技术常用的建模方法 与常规分析技术不同，近红外光谱是一种间接分析技术，必须通过建立校正 模型来实现对未知样本的定性或定量分析。光谱技术与化学计量学结合形成了现 代近红外光谱学，它包括近红外光谱仪、化学计量学软件和应用模型三部份。现 代近红外光谱分析技术基于【3 】：被测量的数据( 如组成和各种物化性质) 和近红外光 谱都是取决于样本的组成和结构，因此，在被测量数据和近红外光谱之间有着一 2 重庆大学硕士学位论文l 绪论 定的联系或函数关系。使用先进的数学和统计方法对这些重要函数关系进行校正， 然后，根据被测样本的近红外光谱，通过这些函数关系，快速计算出被测量的各 种性质数据。以下是常用化学计量学方法的简要介绍【4 】： 1 2 1 多元线性回归 化学计量学中的校正方法是以多通道测量和多组分同时测定为主要特征的。 在定量分析中，多元线性回归分析是进行多组分分析的常用方法，选择合适的波 长和波长间隔，可用统计分析的方法验证结果。 多元线性回归表面上看似乎是只要知道混合物中某些组分的浓度或性质，就 可以建立复杂体系的校正模型。唯一的要求就是选择对应于被测组分的数据向量 ( 如在某些波长处的光谱吸收值向量) 。对于一些不太复杂的体系，不用考虑干扰组 分的影响，也能计算被测组分的组成与性质。 多元线性回归的计算简单，但它也有许多缺点，出于对方程维数的要求，参 加回归的变量数( 即向量数) 不能超过校正集的样本数目。因此，多元线性回归方法 使用的变量数受到限制。如果光谱矩阵中光谱的强度在某些波长处成比例，这样 产生了多元线性回归中遇到的共线问题。共线问题可导致行列式值为零或接近于 零，因此，就无法求矩阵的逆。再者多元线性回归使用光谱矩阵建立模型，并没 有考虑光谱矩阵中信息是否与真实模型相关。如果使用的变量包含了噪音，就会 导致过拟合情况，影响模型的预测能力。 l 。2 2 主成分回归 在实际工作中遇到的光谱构成因素很多，如样本的成分、成分之间的相互作 用、光谱仪的影响( 检测器噪音，环境对基线的影响等) 和样本的预处理等。尽管有 许多因素对光谱都有贡献，但是，总会有一定数目的独立变量存在于光谱中。主 成分分析的目的就是将数据降维，以消除众多信息共存中相互重叠的信息部分。 方法是将原变量进行转换，使数目较少的新变量成为原变量的线性组合，而且， 新变量应最大限度的表征原变量的数据结构特性，并不丢失信息。 可以将光谱看作是不同因素各自产生的各种光谱的加合，各种光谱都是自己 的“纯光谱”乘上其相应的权重后再加合，就能重建样本的原始光谱图。在数学上， 这些“纯光谱”称之为特征向量，在化学计量学中称之为载荷向量或主成分，这些权 重则称为得分。载荷向量和得分向量的计算方法就是主成分分析。使用特征向量 参加回归运算就是主成分回归。 主成分回归有如下优点：可以使用整体测量数据( 原始全谱或部分谱数据) ，能 充分利用数据信息，使用更多的数据则能利用数据的平均效应，增加模型抗噪声 干扰的能力；通过主成分分析，可有效的滤除噪声，解决共线闷题；适用于复杂 分析体系，不需知道干扰组分的存在就可以预测被测组分。但这种方法也具有一 3 重庆大学硕士学位论文1 绪论 些缺点；计算速度比多元线性回归慢；模型优化需要主成分分析，对模型的理解 不如多元线性回归直观；并不能保证将参与回归的主成分一定与被测组分或性质 相关。 1 2 3 偏最小二乘回归 在主成分分析中，只对光谱矩阵作了分解，消除光谱矩阵中无用的信息；同 样，浓度矩阵中也包含了无用信息，也应作同样的处理，因此提出了偏最小二乘 法。偏最b - - 乘法是一种基于因子分析的多变量校正方法，它与主成分分析的区 别是：它不仅利用了吸光度矩阵中的信息，还利用了浓度矩阵中的信息。即偏最 小二乘法同时对吸光度矩阵和浓度组成矩阵进行主成分分解，并以它们的主因子 进行回归，进一步提高了方法的可靠性。 偏最小二乘法具有的优点包括：可以使用全谱或部分谱数据；数据矩阵分解 和回归交互结合为一步，雩导到的特征值向量直接与被测组分或性质相关，丽不是 与数据矩阵中变化最大的变量相关；如果选择的校正集具有代表性，偏最小二乘 模型更稳健；可以使用于复杂的分析体系。偏最b - - 乘法也有其缺点和局限性， 如计算速度相对较慢，模型建立过程复杂抽象，难于理解，模型质量很容易受到 奇异点的影响，且只能应用于线性领域。 1 3 论文研究的内容 应用近红外光谱技术需要有两个前提条件，首先是准确、稳定的获得与被测 样本组成或性质相关的光谱信息，即光谱中应尽可能携带足够多的样本信息。其 次是能够针对不同的待分析组分，建立稳定可靠的数学模型。该模型应该有较大 的预测范围，同时应该有较好的预测精度。在实际测量中，被测样本的光谱由于 被测样本自身或各种噪声因素的影响，使其与被测样本性质之阈的联系呈现出非 线性。常规的化学计量学方法如多元线性回归、主成分回归、偏最小二乘回归等 方法在处理非线性问题上有不足，而人工神经网络具有抗干扰、抗噪音及强大的 非线性处理能力，在近红外光谱分析中得到越来越广泛的应用。 茶碱对呼吸道平滑肌有直接松弛作用，是常用的支气管扩张药，分子式为 c t h $ n 4 0 2 ，分子量m w 1 8 0 2 。从其分子结构式可以看出茶碱分子中含有c - h 与 n h 基团，它在近红外谱区内的倍频与合频振动吸收可在光谱图上反映出来，即 吸光度曲线与茶碱含量之间具有一定的联系。可以利用一系列已知浓度的茶碱样 本的近红外光谱图，通过合适的方法建立起校正模型，预测未知浓度样本的茶碱 含量。 论文通过测量浓度在3 0 1 0 0 峙，r n l 范围内均匀分布的茶碱样本的近红外光谱。 建立校正模型用于预测未知样本中的茶碱浓度。论文使用b p 人工神经网络方法建 4 重庆大学硕士学位论文1 绪论 立校正模型，结合逼近度概念优化b p 网络构造数据；讨论了一阶导数预处理方法 对b p 网络模型效果的影响；比较了b p 人工神经网络方法与常规化学计量学方法 建模的效果。 重庆大学硕士学位论文2 近红外光谱分析原理 2 近红外光谱分析原理 2 1 近红外光谱的产生和光谱特性 近红终光谱分析是从近红外光谱中提取样本的信息，因此研究和掌握近红外 光谱技术首先必须研究和了解近红外光谱中包含的信息以及这些信息的特点，才 能正确理解和运用近红外光谱分析技术提取样本的信息、完成分析。 2 1 1 近红外光谱的信息源 分子在近红外谱区的吸收主要由分子内部振动状态的变化而产生。可以从经 典力学与量子学两种观点来理解与说明分子的振动状态。 经典力学的观点，分子的振动状态用基频、倍频与合频来描述。按经典力学， 最简单的分子即两个质量分别为r a l ，m 2 的原子组成的双原子分子，可模拟为由弹 簧连在一起的两个小球组成的弹簧振子。由虎克定律知道，这种系统的振动属简 谐振动，因此称为谐振子。谐振子机械振动的频率为： = 0 2 ) 4 1 c ( 2 1 ) 式中：k 为力常数，其值决定于组成分子的两个原子间键能量的大小( 键的强度) ； 肛为双原子分子的折合质量。若组成分子的两个原子的质量分别为m l 、1 1 1 2 ，则 “= ( m i l + 所) _ 1 ( 2 2 ) 若k 以m d y n n m 为单位( 1 达因= 1 0 - 5 牛) ，i i 取原子量单位，则双原子分子机 械振动相应的波数频率为： o r 。= ( 1 2 xc ) 4 i c u = 4 1 3 4 k u ( 2 3 ) 分子的这种振动频率为振动的基频，分子也可以按基频的整数倍幻、3 0 频率发生 振动，这种频率称为分子振动的1 、2 级倍频。若分子中存在几种频率的振动， 则在一定条件下两种频率的振动可能发生耦合，形成频率相当于两种频率之和的 合频振动。 若分子是极性分子，则分子在机械振动的同时产生电磁场的振动( 即交交电 场) ，其波数频率o r 。与机械振动的波数频率相同。若用o r 表示分子电振动波数频率， 则 o r = o r = o r u = 4 1 3 4 k u ( 2 4 ) 具有电磁场振动的分子能与环境中相同频率的电磁波发生相互作用( 共振吸收 或发射) ，有机物中不同键伸缩振动的力量常数k 约为4 0 1 8 0 m d y n n m ，弯曲振 动的k 值更小。因此按式( 2 4 ) 计算的有机物基频吸收的波数范围约在中红外区， 即中红外谱区的频率范围与分子振动的基频频率相一致，而近红外谱区的频率范 围与分子振动的倍频、合频振动频率相一致。 6 重庆大学硕士学位论文 2 近红外光谱分析原理 由于分子振动的频率包括基频、各级倍频与各种合频，因此分子可能通过共 振吸收，对环境中频率与分子基频、倍频、合频相同的电磁波产生吸收( 分子内部 振动的振幅变化) ，这就是分子的基频吸收、各级倍频吸收与各级合频吸收。 理论和实践表明，在分子的各种能级中，电子能级间隔最大，一般约为1 2 0 e v 。电子能级间跃迁所吸收的电磁波位于可见光和紫外区，通常称为电子光谱。 振动能级的间隔要小一些，约o 0 5 e v 1 e v 。振动能级问跃迁所吸收的电磁波大都 处于中红外区，所以振动光谱又称为红外光谱【5 】。 按量子的观点，分子的振动状态用能级来描述，振动能级的变化是指分子在 不同振动能级之间的跃迁。由量子力学可得谐振子的能级公式为： e = h c o r ( v + l 2 )( 2 5 ) 式中振动量子数v - - - - - 0 ，l ，2 ，3 。e 为v 能级的能量值。谐振子在不同 能级间跃迁时的选择定则为a v = 1 ，即跃迁只能在相邻能级问发生。每次跃迁吸 收光子的能量e = h c o r 。 按p o l t z m a n n 方程可算得在室温下分子绝大部分处于振动基态= o ) 。由振动 基态到振动第一激发态( v = 1 ) 之间的跃迁称为基频跃迁。这种跃迁所产生对辐射的 吸收即为基频吸收，其吸收电磁波的频率可按经典力学公式( 2 4 ) 计算。 实际分子振动并不完全符合简谐振动，由分子化学键的位能曲线可知分子属 非线性谐振子。其振动量子数为v 的能级公式为下列近似表达式： e = h c o r ( y + 1 2 ) 一x ( v + 1 2 ) 2 + x ( v + 1 2 ) 3 】( 2 6 ) 当上式中只取2 项，则相邻的振动量子数分别为v 和一1 ) 】能级间的能量差 a e = i c 盯( 1 2 p 研( 2 7 ) 式中x 为非谐性常数，x 常为很小的正数，其值约o 0 1 。这说明v 越大时， 相邻能级的间距e 越小，因此倍频的实际频率比基频乘以倍频数的计算值略小。 非线性谐振予跃迁的选择定则是：e = 士l ，士2 即除了基频跃迁外也可能发 生从基态到第二或更高激发态( v - - - - 2 ，3 ) 之间的跃迁。这种跃迁称为二级倍频或 多级倍频跃迁，所产生的吸收谱带为二级倍频或多级倍频吸收，总称为倍频吸收。 分子在中红外谱区的吸收是由于振动状态的相邻振动能级之间的跃迁，即基 频吸收所形成的；而近红外谱区的吸收是由于分子振动的倍频( 振动状态在相邻一 个或几个能级间的跃迁) 或合频( 分子两种振动状态的能级同时发生跃迁) 吸收所造 成的，这是近红外光谱的信息源。 多原子分子的振动比较复杂，但可把它们看作是许多种简单的独立振动的线 性组合而成。因为各种振动不是严格简谐的，它们之间可能发生相互作用，如果 电磁波光子的能量恰好等于某两个基频跃迁所需能量的和，而这两种基频振动又 具有相同的对称性，这是该能量的1 个光子可能同时激发这两种基频跃迁。在光 7 重庆大学硕士学位论文2 近红外光谱分析原理 谱中出现的吸收峰的波数( 或频率) 等于这两种基频振动波数( 或频率) 之和，这种吸 收叫合频吸收。 分子振动的倍频与合频的特征决定了近红外光谱分析的信息范围与特征。对 一般分子，当单位取定后，式( 2 4 ) 中的k 与“分别在1 0 1 1 0 2 和l o o 1 0 1 的数量 级，因此分子振动的基频频率在1 0 3 ( e r a 1 1 数量级，即在中红外区：中红外光谱可 以取得分子振动基频的信息。分子振动的倍频与合频的频率比基频频率高一到几 个数量级，即达到近红外区；近红外光谱可以取得分子振动倍频与合频的信息。 理论上近红外谱区分子振动倍频与合频的信息量可能比中红外谱区基频的信息量 更高，这是因为同一种分子在近红外光谱的谱峰数目比在中红外光谱的谱蜂数目 多。但对应分子振动倍频与合频的跃迁几率比基频跃迁几率小：大体上分子振动 的倍频每提高一个级次，跃迁几率减少一个数量级，因此实际有分析意义的分子 近红外光谱的谱峰受到一定限制。总体上近红外光谱能用于分析的信息量接近中 红外光谱。 因为近红外区从4 0 0 0 e r a 1 到1 2 5 0 0 c m 一，基团的基频在2 0 0 0 c m 4 以下谱区的以 及倍频与合频的频率因为小于4 0 0 0 c r a l ，不属于近红外区，这些基团只有高级次 的倍频与合频才能进入近红外区，但强度很弱，因此近红外谱区所包含的信息主 要是某些基频在2 0 0 0 c m 1 以上的基团的信息。因为含氢的基团吸收强度较高，在 近红外分析中具有实际意义的主要是以含h 的基团为主( 包括o h 、n - h 、c h 等) 的一些特征基团。 因为对应分子振动倍频与合频跃迁的能量间距比相邻能级的能量间距更为离 散，所以分子近红外光谱的谱峰宽度比中红外光谱的谱峰宽，加上分子近红外光 谱的谱峰数目比中红外光谱的谱峰多，因此即使是单纯物质的近红外光谱，其谱 峰也常有重叠，复杂物质的近红外光谱，其谱峰重叠更为严重。 2 1 2 近红外光谱的化学信息基础及特征 有机物在近红外谱区的吸收主要是含氢基团的各级倍频与合频吸收【州。c h 基 的各级倍频在近红外谱区的分布见表2 1 ( n - h 及o h 键则相应向短波方向移动) 。 表2 1 中列出了各级倍频区的波长范围( r i m ) 、相对吸收强度( 以基频吸收为“l ”) 以 及作溶液分析时建议使用的光程。 8 重庆大学硕士学位论文2 近红外光谱分析原理 表2 1c - h 各级基团倍频在近红外区的分布 t a b l e2 1d i s t r i b u t i o no f c - hc h e m i c a lb o n di nn e a r - i n f i a r c dr e g i o n 频率波长范围n m 相对吸收强度 建议光程 基频 2 9 0 0 3 2 0 0l0 1 4 砌 合频 2 2 0 0 2 4 5 0o o lo 1 2 c i i l 一级倍频 1 6 0 0 1 8 0 0o 0 1o 1 2 c m 二级倍频 1 1 5 0 1 2 5 00 o o lo 5 5 c m 三级倍频 8 5 0 9 4 00 0 0 0 15 1 0 c m 四级倍频 7 0 0 7 8 0o 0 0 0 51 0 2 0 c m 主要基团合频与倍频吸收带的近似位置见表2 2 ： 表2 2 主要基团与各级倍频吸收带的近似位置 t a b l e2 2 a b s o r p t i o nl o c a t i o no f m a i nc h e m i c a lb o n d 单位 c n l in m 基团 c - hn ho - h h 2 0 c - hn ho h h 2 0 合频 4 2 5 04 6 5 05 0 0 05 1 5 52 3 5 02 1 5 02 0 0 01 9 4 0 二倍频 5 8 0 06 6 7 07 0 0 06 9 4 01 7 2 01 5 0 01 4 3 01 4 4 0 三倍频 6 5 0 09 5 2 01 0 5 0 01 0 4 2 01 1 8 01 0 5 09 5 09 6 0 四倍频 1 11 0 01 2 5 0 01 3 5 0 01 3 3 0 09 0 08 0 07 4 07 5 0 五倍频 1 3 3 0 07 5 0 以1 3 0 0 r i m 为界，把近红外谱区分为两区：即短波近红外区( s w - 近红外) 与一 般的近红外区( 近红外) ，s w - 近红外主要是高倍频吸收带，后者主要是一级倍频吸 收带。因为倍频每增加一个级次，吸收强度大约降低一个数量级，因此s w - j 丘红 外可用于长光程的透射分析，近红外区主要用于漫反射分析区。 近红外谱区常用于分析含c h 、n - h 、o h 键的有机物，所以分析时所用的溶 剂分子中不宜带上述基团。因此，近红外区分析选用溶剂比紫外区困难得多。在 本区内透明的溶液，只有c c l 4 和c s ，。 因为不含c - h 、n h 、o - h 的化合物在近红外区无吸收，干扰该谱区分析的杂 质相对少些，有利于复杂物的分析。近红外曲谱吸收带的强度较弱，一方面影响 了这一谱区分析的检测限，另一方面又便于对某些高聚物和含水样本的分析。 分子中原子问振动的合频与各级倍频大多在近红外谱区，因此本谱区包含的 9 重庆大学硕士学位论文2 近红外光谱分析原理 信息极为丰富，大体与中红外谱区相近。在近红外光谱分析中具有实际意义的主 要以含h 的基团为主( 包括o h 、n - h 、c - h 等) ，也有其它一些基团如( c = o 等) 的 信息，但强度较弱。这些基团是有机物中的一些重要基团。近红外分析技术可以 分析测定与这些基团有关的成分及物理、化学性质。 精确近红外谱带的归属很困难，因为每个近红外谱带可能是若干不同基频的 倍频和合频谱带的组合，没有锐峰和基线分离的谱峰，大量的是重叠谱峰和肩掣”。 近红外光谱包含了键强度、化学组分、电负性和氢键的信息。对于固体样本，很 多其它信息，如散射、漫反射、特殊反射、表面光泽、折光指数和反射光的偏振 等都被加载到样本近红外光谱上。这些都使近红外光谱的解析复杂化。 物体对光的散射随着波长的减短而增大，近红外适用于作漫反射和散射光谱 分析。适用于近红外光谱区的光学材料多，用可透过近红外光的普通玻璃和石英 材料作光学材料，不仅降低了材料费用，也有利于光学器件的维护，还可使用光 纤传输，使得近红外光谱测量更容易。近红外谱区丰富的结构与组成信息，加上 近红外谱区信号的特征，这是近红外分析应用广泛的基础。 2 2 近红外光谱技术的理论基础 2 2 1 近红外透射光谱技术 光是一种电磁波，具有波粒二相性。光的波动性和粒子性由公式表示：砌= c ， e = h u 。当一束光照射某物质( 或其溶液) 时，若该物质分子( 或离子) 与光子发生有 效q 碰撞”，则光子的能量就转移到分子( 或离子) 上。物质分子( 或离子) f a 处于稳定 的基态( 能量最低) 激发至不稳定的激发态( 能量较高) ，此过程称为光的吸收。激发 态分子的寿命极短，约在1 0 4 s 后通过热或荧光的形式放出能量。由于分子的能量 是量子化的，因此分子吸收能量同样具有量子化特征。即当用不同波长的光照射 物质分子时，分子只选择吸收与其能级间隔相应波长的光子能量，其它波长的光 只被简单的透过，这就是分子对光的选择性吸收特性【s 】。 透射光谱是指将待测样本置于光源与光探测器之间，光通过样本后携带了样 本内部结构和组成的信息，透射到探测器上。对于液体样本，通常采用透射分析 方法，对真溶液体系，仪器所测定的吸光度与光程及样本的浓度之间符合朗伯一 比耳定律 9 1 。 当一束平行单色光照射到均匀、菲散射的介质( 固体、液体或气体) 时，假设 是溶液，入射光的一部分被器皿的表面反射，一部分被溶液吸收，剩余部分通过 溶液。假定入射光的强度为l ，吸收光强度为k ，透射光的强度为，。，反射光强 度为，则 i o = i t i t + l ，q 渤 1 0 重庆大学硕士学位论文 2 近红外光谱分析原理 由于实际测定时，均是采用同样材料的比色皿，反射光的强度基本上是不变 的，其影响可以相互抵消，故上式可简化为 lo = l 嚷+ i rq 当入射光强度l 一定，若龟越大，则越小，溶液对光的吸收程度就越大。 实验证明，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度、液层的厚度以及入射光的波长和 强度等因素有关。若入射光的波长和强度都保持不变，溶液对光的吸收程度则与 溶液的浓度、液层的厚度有关。朗伯和比尔分别于1 7 6 0 年和1 8 5 2 年阐明了光的 吸收与溶液浓度以及液层吸收定量关系，两者合起来即朗伯一比尔定掣1 0 1 。 当一束光( 光强度l ) 照射试样溶液时，光子与溶液中吸光质点( 分子或离子) q 薤 撞”而被吸收，因此透过溶液的光强度( ，。) 减弱。吸光度描述溶液对光的吸收程度， 用符号a 表示；透光度描述入射光透过溶液的程度，用符号t 表示。光的吸收定 律是描述物质吸收光的定量关系。a ；质量吸光系数，单位l ，g - m 1 ，b ：液层厚 度( 光程长度，单位c m ，c ：溶液的摩尔浓度，单位t o o l l 1 或g - l 1 ，：摩尔吸光 系数，单位l t o o l - 1 e r a l 。公式如下： 础鲁 ( 2 1 0 ) r ：孕 ( 2 ，1 1 ) i i a = d 配 ( 2 1 2 ) a = a b c ( 2 1 3 ) 当波长和吸收光程一定时，透光度与浓度呈指数关系，吸光度与浓度呈线性 关系。朗伯比尔定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。此定量广泛的 应用于紫外光、可见光、红外光区的吸收测量；此定律不仅适用于溶液，也适应 于其它均匀的、非散射性的吸光物质( 包括气体和固体) 。对于多组分吸收体系，若 体系中各组分间无相互作用，则各组分的吸光度满足加和性。 吸收曲线定量的描述了物质对光的选择性吸收特性。在同样条件下依次将各 种波长的单色光透过某物质溶液，并分别测定每个波长下溶液对光的吸收程度( 吸 光度a ) 。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标得到的a 丸曲线，称为该溶液的吸收 曲线，又称吸收光谱川。 同一种物质对不同波长光的吸收度不同，吸光度最大处对应的波长称为最大吸 收波长五一 不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，五。不变。而对于不同物质，它 们的吸收曲线形状和五一则不同。所以吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为 物质定性分析的依据之一 重庆大学硕士学位论文 2 近红外光谱分析原理 不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度a 有差异，在五。处吸光度a 的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。因为在五。处吸光度随浓度变化 的幅度最大，所以测定最灵敏。 2 2 2 近红外反射光谱技术 现代近红外光谱分析的各种技术中，漫反射分析测定占有特别重要的地位。 这是因为漫反射光谱分析在近红外谱区比中红外谱区更为有利。漫反射光谱分析 不需要对样本做化学处理，可以直接测定粉末状、纤维状等不规则样本，漫反射 光谱分析技术也比较简单。 反射光谱技术是指将待测样本和光探测器置于同一侧，探测器所探测到的是 被样本以各种方式返回来的光。光的反射有两种，一种是镜面反射，另一种是漫 反射。所谓镜面反射，就是光线照射到光滑物体表面上被有规则的反射回来的现 象，它未与样本内部相互作用，没有携带入射光与样本相互作用的信息。所谓漫 反射，就是光线照射到粗糙物体表面被无规则的反射的现象。当光线照射到有一 定厚度颗粒物质组成的样本层时，一部分被吸收，一部分被样本内部各层反射、 吸收、折射、最后反射出来。反射出来的光反映了样本内部特性，携带了样本的 信息。在近红外光谱分析中，对固体、半固体一般采用漫反射方式测量其光谱。 采用漫反射近红外光谱分析技术进行定量分析的理论依据是k u b e l k a - - m u n k 函数 7 1 。 首先引出几个浸反射光谱参数。k 为漫反射体的吸光系数，其含义与透射光 谱的吸光系数相当，主要取决于样本的化学组成；s 为散射系数，表示由于样本对 光的散射，反映光在样本中经过单位光程后光的衰减程度：r 为漫反射率，反映出 射光与入射光的比率。绝对漫反射率： 砖= 1 + 含一【( 争2 + 2 ( 舍) 】1 2 ( 2 1 4 ) 戍学本厚度无穷大时的绝对漫反射率 在漫反射分析中，只有在一定的浓度范围内吸光系数k 才与样本的组分浓度 成线性关系，而r 一相对漫反射率) 与样本中的组分浓度则不成线性关系。与组分 浓度成线性关系的漫反射函数有两种，即反射吸光度a 和k - m 函数。反射吸光度 a 的定义与透射光谱吸光度相似。 爿= 1 西1 = - l 0 9 0 + i k o gg o 一【2 + 2 ( 和 ( 2 1 5 )爿= 1 i + i 一【) 2 + 2 ( 却恐 ( 2 漫反射体的反射吸光度与k s 的关系为一对数曲线，在一定的k s 范围内，a 与k s 间可以直线关系代替曲线关系。a = a + b k $ 。由于k 与c 在一定浓度范 围内有线性关系，当散射系数s 不变时，漫反射吸光度a 与样本浓度的关系可表 示为彳= 口+ k 。显然，漫反射吸光度与浓度的关系式同透射光谱中比尔定律吸光 1 2 重庆大学硕士学位论文2 近红外光谱分析原理 度与浓度的关系式有明显的差别。其一，漫反射定量式中的浓度范围比较窄，而 且有斜率；而透射光谱比尔定律的斜率为零，且浓度范围较宽。其二，关系式的 成立必须以散射系数s 相同为前提。k - m 函数 7 1 ； f 伍。) ；( 1 - r m ) 2 ：一k( 2 1 6 ) 、7 2s 当样本的散射系数s 为一常数时，k - m 函数与吸收系数k 成正比，即与样本 浓度成正比，k - m 函数与浓度的关系可表示为：f ( 疋) = - “x = b c ，式中系数b 除 j 与摩尔吸光系数及光程有关外，还与样本的散射系数有关，样本的粒径大小及分 布和形状等多种因素均影响样本对光的散射。影响漫反射分析的主要因素包括样 本基体、粒径、装样条件等。 2 3 近红外光谱技术的特点和分析流程 近红外光谱是指波长在7 8 0 2 5 2 6 m m 范围内的电磁波。近红外光谱在测定农 副产品的品质( 水分、蛋白、油脂含量等) 石油、纺织、制药及临床方面得到广泛 应用。近红外光谱分析方法由两个要素组成，一是准确、稳定的测定样本的吸收 或漫反射光谱谱图的硬件技术( 即光谱仪器) ，这一硬件技术的主要要求是必须保持 长时间的稳定性；另一个是利用多元校正方法计算测定结果的软件技术。在特定 波长范围内，样本的吸收光谱由光谱仪检测器测出，数字化后存入计算机。在未 知样本分析前，必须有一组样本作为一个校正集，对校正集的每一个样本测量其 光谱和对应的组成或性质，与单波长测定建立校正曲线一样，事先必须用多元校 正方法将测量的光谱与性质或组成数据关联，建立校正模型。 近红外光谱技术的特点： 很多物质在近红外区域的吸收系数小，使分析过程变得简单。 作为分子振动能级跃迁产生的吸收光谱，近红外区域的倍频或合频吸收系数 小，一般较红外基频吸收低l 3 个数量级，故样本无需用溶剂稀释即可以直接测 定，便于生产过程的实时测定。所用样本池的光程不像中红外区常在l m m 以下， 近红外区域根据所使用的谱带和测量物含量的高低，光程可以是l 1 0 0 m m ，长样 本池使清洗过程变得非常方便。 适用于漫反射技术，用于固体样本直接测定。 近红外区内光散射效应大，且穿透深度大，使得近红外光谱技术可以用漫反 射技术对样本直接测定。固体样本可以是任何形状，如水果、谷物或固体药丸都 可以直接测定，便于检查各部位或每一颗粒的质量。在短波近红外区域( 7 0 0 1 1 0 0 n m ) ，对固体的穿透深度可达几厘米，而被吸收的光强很小。大部分固体样本 的在线检测都使用漫反射技术。