回补维生素-E对维生素-E缺乏不孕大鼠妊娠结局的影响.docx

回补维生素 E对维生素 E缺乏不孕大鼠妊娠结局的影响郎摘2, 贺斌2, 王丽丽2, 王介东2(1.北京协和医学院研究生院.北京 1oo73o;2.国家卫生计生委科学技术研究所.北京【摘要】 目的 研究在植入过程回补维生素 E对维生素 E缺乏不孕(VED)大鼠妊娠结局的影响。 方法 从出生后l1 d开始喂养维生素 E缺乏的食物,喂养6个月后建立 VED大鼠模型。在模型大鼠交配后5. 5 d、6. 5 d、7 5 d分别灌胃500 mg/kg的维生素 E回补,以非 VED大鼠为对照组,在回补 0 h、4 h、8 h、l2 h、l6 h、20 h和24 h观察维生素 E的浓度变化, 并于交配后l9. 5 d统计大鼠子宫的着床点个数、活胎个数和胎鼠体重变化。结果 VED大鼠在回补4 h后血浆中维生素E的浓度为l3 54土3 8l g/m1,达到正常水平;分别在交配后5. 5 d、6. 5 d、7 5 d回补维生素 E的 VED大鼠妊娠率分别为80%、60%、40%(对照组均为l00%),着床点个数分别为9. 3土l. l、8. 5土0. 5和8 4土l. 4(对照组为l2 7土0 5、l3 0土2 2 和l2. 7土l. 2),活胎个数分别为5. 0土2. 0、4. 0土2 3和2 0土2 4(对照组为l2 3土0. 5、l2 7土2 4和ll. 3土l. 7),均显著低于对照组(P0. 05),交配后6. 5 d和7 5 d回补组胎鼠体重显著低子对照组(分别为l. 74土0 55 g和l. 63土0 68g vs. 2 l6土0 l8 g和2 l9土0 2l g)(P0. 0l)。 结论 在植入过程回补维生素 E可部分挽救由子维生素 E缺乏所导致的不孕;随着回补时间的延后,回补维生素 E对妊娠结局挽救的效果明显下降。【关键词】 维生素E; 妊娠结局; 植入 Evans等在上世纪20年代发现缺乏维生素E可以导致大鼠不孕。维生素 E是一类妊娠过程不可或缺的营养元素,缺乏维生素 E会引起早产、流产、先兆子痫和胎儿子宫内生长受限。 维生素E在体内的减少是一个非常缓慢的过程,建立维生素 E缺乏的动物模型需要很长的时间。 研究维生素 E最常用的动物是大鼠。维生素 E缺乏导致不孕的雌性大鼠卵巢和排卵过程没有受到影响,但在妊娠过程中出现吸收胎;而雄性大鼠的精子发生过程异常,导致精子减少或无精。维生素 E的研究一直主要围绕生殖过程,但维生素 E在妊娠过程中的作用阶段及相关分子机制还不清楚,需要进一 步研究探讨。本研究以维生素 E缺乏的不孕大鼠为研究对象,探究植入过程中回补维生素 E对其妊娠结局的影响。 材料与方法一、材料 1.实验动物:SPF级 Wista幼鼠鼠龄为出生后10 d,共10窝,每窝10只;SPF级 Wista雄鼠910周龄,共20只,购自北京协和医学院实验动物中退出全屏心,光周期调控: 06: 00 18: 00光照, 18: 0006:00黑暗,恒温(21土1)、恒湿(55%土5%)条件下饲养,自由取食饮水。 2. 饲料配制及维生素 E检测:饲料委托京维通利华实验动物技术有限公司加工合成,经第三方检测机构北京谱尼测试科技有限公司测试,正常饲料中维生素 E含量是154 mg/kg,维生素 E缺乏饲料中维生素 E的含量0.5 mg/kg。 正常饲料配方(%):酪蛋白20,蛋氨酸 0.3,葡糖67 5,猪油5(Corn 0i1,tocophero1-stripped替代),纤维素3,矿物盐3. 5,碳酸钙 0 35，复合维生素0 35。 维生素 E缺乏饲料配方(%):酪蛋白20,蛋氨酸 0 3,葡葡糖67. 5,猪油5(Corn 0i1,tocopherolstripped替代),纤维素3,矿物盐3. 5,碳酸钙 0 35, 复合维生素(缺维生素 E)0 35。 (天然型)维生素 E软胶囊( 100 mg/粒,浙江医药股份有限公司新昌制药厂)。 维生素 E检测试剂盒(南京建成生物工程研究所) 二、方法 1. 建立维生素 E缺乏大鼠不孕模型:仔鼠出生后第 11 天开始给母鼠分别喂养正常饲料(对照组) 和维生素 E缺乏饲料(VED饲料组) ,并对仔鼠进行称重,每周称重一次;第21天离乳后,两组中的雌性仔鼠继续喂养相应的正常饲料和维生素 E缺乏饲料,观察生长过程中体重的变化;喂养21周后,两组雌鼠仔继续喂养相应的正常饲料和维生素E缺乏饲料，观察生长过程中体重的变化；喂养24周后，两组雌鼠和雄鼠进行第一轮交配,在16:00将雌鼠与正常的雄鼠进行第一轮交配。 在16:00将雌鼠和雄鼠放在交配笼里,次日8:00在交配笼下的托盘中看到阴栓,为交配成功,记为 0.5 d,其中,交配成功没有产下仔鼠的 VED饲料组雌鼠定义为维生素 E缺乏不孕大鼠(VED组)。 2.维生素 E回补实验:对照组和 VED组大鼠分别进行第二轮交配, 在16:00将雌鼠和正常雄鼠放入交配笼中,次日8:00见阴栓为交配成功,记为0 5 d,进行以下处理: (1)对照组和 VED不孕组孕鼠各随机留取15只,分别在5 5 d、6 5 d和7 5 d (5只/d)处死,收集子宫角,计数着床点数目; (2)余下的 VED不孕组孕鼠分别在5 5 d、6 5 d和7 5 d补充维生素 E(500 mg/kg,灌胃),每个时间点5只, 称为 VED-E组;对照组孕鼠同期以1 m1无菌玉米油灌胃,称为 C-C组,灌胃时记为 0小时(0 h),在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h尾静脉取血, EDTA抗凝保存;在19. 5 d处死孕鼠,收集孕鼠子宫角,计数子宫着床点(含吸收胎)和活胎数量,记录胎鼠体重。 3. 血浆中维生素 E的测定:静脉血抗凝混匀放置后,3 500 r/min离心10 min,放入一70保存。使用维生素 E检测试剂盒进行维生素 E浓度的测定, 采用分光光度法,以联苯菲 P要 啉为显色剂,在波长533 nm处测定吸光度,浓度以g/m1表示。三、统计学分析 实验结果来用 SPSS20.0软件进行分析。数据结果以平均值土 SD表示,采用单因素方差分析,计量资料使用 t检验,计数资料使用 x2检验;以 P0 05 )。 喂养24周后进行第一轮交配,观察大鼠的妊娠情况。对照组产仔数为10 62土1. 8只/窝;VED饲料组雌鼠见栓33只,仅有3只孕鼠产仔(窝仔数分别是3只、9只和10只,未纳入第2轮交配),余下的30只见栓雌鼠均未见有产仔,即为维生素 E缺乏不孕大鼠(VED组)。二、回补维生素 E对血浆维生素浓度的影响 CC组维生素 E浓度维持在11.7713 54g/m1; VED-E组在回补维生素 E4 h后,维生素 E浓度迅速由 0.09土0.18 g/m1升高至13.54土3.81 g/m1, 12 h时达到高峰,显著高于 C-C组(P0.05)。显示500 mg/kg的维生素 E回补剂量可以达到正常生理水平(表1、图1)。三、回补维生素 E对妊娠结局的影响 交配后5. 5 d、6. 5 d和7. 5 d时子宫着床点检査显示,对照组(C组)的着床点分别为12. 7土0.5、13.02.2、12.71.2，WED组的着床点个数分别为9.21.1、8.80.8、8.71.3，均显著低于对照组（P0.05）（图2），提示维生素E缺乏可影响胚胎着床。回补维生素E后19.5d时，在3个回补时间组（5.5d、6.5d和7.5d），C-C组的妊娠率均为100%，而VED-E组妊娠率分别为80%，60%和40%；C-C组的着床点分别为12.90.8，2,161.2、131.5，VED-E组着床点（含吸收胎）个数分别为9.31.1,8.50.5、8.41.4，仍显著低于C-C组（P0.05）（图3），但与未回补维生素E的VED组相比无统计学差异（P0.05）。提示在5.5-7.5d回补维生素E不能有效改善胚胎着床。VED-E组不同回补时间亚组的活胎数分别为5.02.0、4.02.3、2.02.4，显著低于C-C组（分别为12.30.5、12.72.4、11.31.7）（P0.05）（图4）。提示5.5-7.5d回补维生素E可部分挽救胚胎发育；6.5d和7.5d回补维生素E后的VED-E组胎鼠体重与C-C组相比明显减轻（1.740.55g、1.630.68g vs. 2.160.18g、2.190.21g）（P0.01），且6.5d和7.5d时回补维生素E的胎鼠体重显著下降（P0.01）（图5）。同时，VED-E组在不同时间回补维生素E的妊娠率、活胎数量的结果也提示，随着回补时间的延后，其补救效果逐渐减弱。 讨 论维生素E是一类脂溶性的营养元素，参与整个生殖过程，尤其是早期妊娠过程。维生素E和其它维生素不同,至今尚未发现维生素 E的受体,维生素 E如何进入细胞以及通过什么途径起作用无从下手研究。有研究发现维生素 E降低卵泡内的氧化压与维持胚胎正常生长、胎盘形成/建立以及胎盘血管新生过程密切相关,但其作用机制尚不清楚。维生素 E不能在人体中合成,主要通过外源性补充, 通过胆汁和胰液作用,维生素 E嵌合到微胶粒中,经非饱和的被动扩散方式被肠上皮细胞吸收。大多数乳糜微摘通过受体介导的内吞作用被肝脏吸收, 在肝细胞中维生素 E结合到一tocophero1 transfer protein(一TTP,一种维生素 E的转移蛋白)上,一TTP介导维生素 E转移到极低密度脂蛋白上,从而使维生素 E进入血液循环。不能被吸收的维生素 E通过胆汁排出体外或通过细胞色素 P450介导的一氧化途径形成一2-(2一搜乙基)美登基苯并二氢吡喃(一CEHC) ,一CEHC通过尿液排出体外。维生素 C一维生素 E循环通过氧化还原作用重新合成维生素 E,导致维生素 E在体内的消耗是一个非常缓慢的过程, 因此本研究从11天龄的仔鼠开始缺i 维生素 E,妊娠试验验证并建立了维生素 E缺乏大鼠的不孕模型,人类口服维生素 E会导致血浆中维生素 E浓度差异性地增加,而这种个体差异是由维生素 E的活性、代谢速率、脂质的成分和含量、循环的维生素 E 的状态和体内环境条件引起的。 本实验中回补维生素 E 后大鼠血浆中维生素 E的浓度显著性增加,标准差适中,没有发现维生素 E浓度的个体差异变化, 本研究一次性给予 VED组大鼠200 mg维生素 E,回补4 h即显著提高血浆维生素 E浓度,12 h达到高峰并开始回落,24 h时与对照组没有统计学差异, 表明外源性维生素 E能快速有效补充体内维生素E。给维生素 E缺乏大鼠回补200 mg维生素 E,换算到人体中是800 mg,即1 200 IU,而1 600 IU的维生素 E对于人体内正常氧化压是安全的。因此,我们回补的维生素 E对于大鼠来说是安全有效的。 维生素 E缺乏不孕模型大鼠（VED组）和模型大鼠回补的维生素 E（VED-E组）的着床点个数比对照组少（P0.05），这说明长期 维生素 E的缺乏影响大鼠的着床，可能是因为 维生素 E影响卵或子宫基层的运动，卵到子宫植入部位的运动不均衡导致着床点个数的减少。大鼠的植入时间实在交配后5.5d、6.5d和7.5d，此时子宫已经为植入做好了准备，因此VED组和VED-E组着床点个数上没有统计学差异。 维生素 E缺乏虽然影响大鼠的着床，但是VED组和VED-E组还是有大约9个的着床点，提示维生素 E对着床点的影响不是维生素 E缺乏导致大鼠不孕的主要原因。 本研究发现，回补维生素 E后VED-E组的妊娠率、活胎数有所恢复，但显著低于只灌注溶剂的正常对照组（C-C组），且随着回补时间的延后，其补救效果逐渐减弱，说明交配后5.5-7.5d回补维生素 E只能部分挽救不孕，提示维生素 E缺乏对胚胎生长发育过程具有重要影响。Evans等研究结果显示，断奶后开始持续缺乏维生素 E的成年不孕大鼠，在交配后5d或6d回补胚芽油（富含维生素 E）可以产下活的仔鼠，也支持这一结果。-TTP基因敲除小鼠补充-生育酚能够完全挽救妊娠结局，与本研究中回补维生素 E可部分挽救妊娠结局并不完全一致。有研究显示大鼠喂食维生素 E缺乏饲料12周，可导致肝脏-TTP蛋白表达显著降低，但高剂量维生素 E并不能促使-TTP蛋白表达增加，提示维生素 E对-TTP的调控机制可能是两者挽救结果差异的原因之一。有关维生素 E对-TTP的相互作用仍。给维生素 E缺乏大鼠回补200 mg维生素 E,换算到人体中是800 mg,即1 200 IU,而1 600 IU的维生素 E对于人体内正常氧化压是安全的。因此,我们回补的维生素 E对于大鼠来说是安全有效的。 维生素 E缺乏不孕模型大鼠（VED组）和模型大鼠回补的维生素 E（VED-E组）的着床点个数比对照组少（P0.05），这说明长期 维生素 E的缺乏影响大鼠的着床，可能是因为 维生素 E影响卵或子宫基层的运动，卵到子宫植入部位的运动不均衡导致着床点个数的减少。大鼠的植入时间实在交配后5.5d、6.5d和7.5d，此时子宫已经为植入做好了准备，因此VED组和VED-E组着床点个数上没有统计学差异。 维生素 E缺乏虽然影响大鼠的着床，但是VED组和VED-E组还是有大约9个的着床点，提示维生素 E对着床点的影响不是维生素 E缺乏导致大鼠不孕的主要原因。 本研究发现，回补维生素 E后VED-E组的妊娠率、活胎数有所恢复，但显著低于只灌注溶剂的正常对照组（C-C组），且随着回补时间的延后，其补救效果逐渐减弱，说明交配后5.5-7.5d回补维生素 E只能部分挽救不孕，提示维生素 E缺乏对胚胎生长发育过程具有重要影响。Evans等研究结果显示，断奶后开始持续缺乏维生素 E的成年不孕大鼠，在交