凝集素芯片使用说明.doc

材料目录1、 芯片凝集素点阵2、 凝集素芯片保存方法3、 凝集素芯片使用方法4、 所需试剂及其配置方法5、 凝集素亲和性表一芯片上各个凝集素点阵 AAL BPL DSL DBA ECL AAL BPL DSL DBA ECL EEL HHL Jacalin LTL MAL EEL HHL Jacalin LTL MAL MPL NPL WBA EBL STL MPL NPL WBA EBL STL SBA UEA WGA SWGA WFL SBA UEA WGA SWGA WFL 说明：1、是荧光位置标记位点，作为坐标2、每个凝集素重复两个点。二、凝集素芯片保存方法将凝集素芯片放在芯片盒内（注意不要互相接触），放入4冰箱冷藏，可保持3-6个月。三、凝集素芯片使用方法（一） 对细胞的检测细胞系细胞提取 取对数生长期的细胞,倾去培养液，加入0.25胶原酶（D-hanks），37 消化1 h，每隔10 min吹打一次。1500r/min离心5 min，收集沉淀。PBS洗涤2次，重悬备用（注：用胶原酶主要是怕损伤细胞膜糖链结构，如果没有，常规细胞培养的胰蛋白酶也可）如果对细胞进行荧光标记，在重悬后的细胞液中加入50-100ul的吖啶橙溶液，轻摇5min后PBS洗涤两次，重悬备用。体液细胞悬液的制备胸腔积液、腹水等1500r/min离心5min后，倾倒上清液。按1:3的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液去除红细胞，轻轻吹打混匀。1500 r/min离心5 min，收集沉淀。PBS洗涤2次，重悬后进行细胞计数（11041106）。取少许上述细胞悬液，孵育到凝集素芯片上（如需荧光标记，重复上面荧光标记步骤）。组织细胞提取取动物组织，用肝素D-hanks液清洗后剪碎，0.25胶原酶（D-hanks），37消化1h，每隔10min吹打一次。1500r/min离心5min，按1:3的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液去除红细胞，轻轻吹打混匀。1500 r/min离心5 min，收集沉淀。RPMI 1640洗涤2次，重悬备用。凝集素芯片孵育取出备用的凝集素芯片，于37湿盒内水化30 min，0.5酪蛋白溶液（PB，0.01 mol/L， PH=7.2）封闭5 min，PB缓冲液（0.01mol/L，pH=7.2）洗涤15 min，将细胞悬液滴加到芯片上，覆盖住凝集素芯片矩阵，常温或者37 孵育40 min，PBS缓冲液（pH 7.2）洗涤，3%戊二醛（PBS，pH 7.2）固定2 min（如不染色，固定一步可以省略）。凝集素芯片捕获细胞的检测荧光标记的检测激光扫描仪扫描整个芯片常规P巴氏染色（Papanicolaous stain），观察捕获细胞位点，显微镜下观察（注：PE染色后吖啶橙荧光消失）。对蛋白的检测芯片准备处理同前检测方法1、 蛋白直接荧光标记，扫描检测2、 蛋白捕获后，加荧光二抗孵育，扫描检测3、 蛋白孵育后，加其他标记的二抗检测。四、所需实际配置方法1、凝集素芯片封闭液0.5%酪蛋白溶解到PH=7.4的PB溶液里（0.01M），溶解过程需要煮沸加热，分装冻存。2、吖啶橙染色液0.05%吖啶橙PBS溶液。五 芯片所用凝集素亲和性 凝集素来源糖链特异性DSLDatura stramonium(GlcNAc)n, polyLacNAc and LacNAc (NA3, NA4)MPLMaclura pomifera Gal1-3GalNAc-Thr/Ser (T) and GalNAc-Thr/Ser (Tn)WBAPsophocarpus tetragonolobus-GalNAc and GalJacalinArtocarpus integrifolia Gal1-3GalNAc-Thr/Ser (T) and GalNAc-Thr/Ser (Tn)LTLLotus tetragonolobusFuc1-3GlcNAc, Sia-Lex and LexSBAGlycine maxTerminal GalNAc (especially GalNAc1-3Gal)BPLBauhinia purpurea alba Gal1-3GalNAc and NA3, NA4WFLWisteria floribunda Terminal GalNAc (e.g., GalNAc1-4GlcNAc)MALMaackia amurensis Sia 2-3GalAALAleuria aurantiaTerminal Fuc and Sia-LexEELEuonymus europaeus Gal1-3Fuc1-2Gal Gal1-3GalHHLHippeastrum hybrid non-substituted 1-6ManEBLSambucus nigraSia 2-6Gal/GalNAcSTLSolanum tuberosum (GlcNAc)n and polyLacNAcsWGATriticum unlgarisD-GlcNAcNPLNarcissus pseudonarcissusTerminal and internal ManECLErythrina cristagalliLac/LacNAcDBADolichos biflorusGalN