（生物医学工程专业论文）植物与微生物细胞壁糖的荧光辅助糖电泳分析.pdf

华中科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t s a c c h a r i d e sa r em a j o rs t r u c t u r ea n df u c t i o n a l c o m p o s i t i o n s o fl i v i n g t h i n g s e s p e c i a l l yo l i g os a c c h a r i d e sa r em a j o rp a r t i c i p a t o r si nt h el i v i n gp r o c e s s s o m ea c t i v e o l i g o s a c c h a r i d e s a r ef r o mc e l lw a l l so f p l a n t s a n dm i c r o b e s t o i n v e s t i g a t e o l i g o s a c c h a r i d e s ，w ee x t r a c tc e l lw a l lp o l y s a c c h a r i d e sf r o mc e l lw a l lo fs a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ea n d d r yg r a z i n gb ya l k a l i n e h y d r o l y z i n g ，e x t r a c to l i g o x y l a n f r o m a l k a l i n e - h y d r o l y z e dg r a z i n gb yc r y s t a l i n g ，e x t r a c tw a t e r - s o l u b i l i t y e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e sb e t w e e nk e l pc e l l sb yw a t e r - d i s t i l l i n g ，e x t r a c tc e l lw a l lp o l y s a c c h a r i d e so f s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n dw a t e r - s o l u b i l i t ye x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d c sf r o mk e l p c e l l s h y d r o l y s a t eb ya c i d h y d r o l y z i n g t h e n w ea n a l y z et h e m b yt h ew a yo f f l u o r o p h o r e a s s i s t e dc a r b o h y d r a t ee l e c t r c l p h o r e s i s s u b s e q u e n t l nw ec o m p a r et h er e s u l t s w i t h e l e c t r o p h o r e t i cc h a no ft h eo l i g o s a c c h a r i d ea d m i x t u r ef r o ma c i d - h y d r o l y z e d w a t e r - s o l u b i l i t ys t a r c h f l u o r o p h o r e a s s i s t e dc a r h o h s , d r a t ee l e c t r o p h o r e s i s ( f a c e ) i s a s i m p l e a n d i n e x p e n s i v em e t h o df o rs e p a r a t i n gt h ec a r b o h y d r a t e s t h e ( 0 1 培o ) s a c c h a r i d e sw e r et a g g e d w i t ht h ec h a r g e df l u o r o p h o r e 8 - a m i n o n a p b t h a l e n e 一】，3 ，6 一t r i s u l o n a t e ( a n t s ) ，a n dt h e r e d u c t i v ea m i n a t i o nr e a c t i o n sw e r ee s s e n t i a l l yc o m p l e t ea f t e ra p p r o x i m a t e l y16 h ru n d e r t h eg i v e ne x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s s a c c h a r i d e a n t sa d d u c t sw e r et h e ns e p a r a t e df r o m o n ea n o t h e rb ye l e c t r o p h o r e s i so na3 2 c a c r 2 4 c b i sp o l y a c r y l a m i d eg e la ta l k a l i n e p h t h i st e c h n i q u ed o e s n tr e q u i r es o p h i s t i c a t e di n s t r u m e n t a t i o na n dh i g h l yt r a i n e d p e r s o n n e l t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e ： 1 ，t h eo l i g o s a c e h a r i d ea d m i x t u r ef r o ma c i d - h y d r o l y z e dw a t e r - s o l u b i l i t ys t a r c hc a l l f o r mas e r i e so f b o n d si ne l e c t r o p h o r e t i cc h a na n dt h ef i r s ta n ds e c o n db o n d sa r em a t c h e d t og l u c o s ea n dm a l t o s e ，s e p a r a t e l y i ti n d i c a t e st h a te l e c t r o p h o r e t i cc h a r to ft h eh ，d m l y s a t e o fw a t e r - s o l u b i l i t ys t a r c hc a ns h o wt h e g r a d s d i s t r i b u t i o no fp o l y m e r z a t i o nd e g r e e t t 华中科技大学硕士学位论文 t h e r e f o r e ，t h eh y d r o l y s a t e o fw a t e r s o l u b i l i t ys t a r c h c a r lb e u s e da ss c a l eo f o l i g o s a c c h a r i d ep o l y m e r z m i o nd e g r e e ， 2 ，a c i d h y d r o l y s a t e so f 一t y p ep o l y s a c c h a r i d e sa r et h es a n l ew i t h s t a r c h ，f o r ma s e r i e so fb o n d si ne l e c t r o p h o r e t i cc h a r t k e l pp o l y s a c c h a f i d ea n dc e l l u l o s ea r ed - t y p e p o l y s a c c h a r i d e s t h e yc a ns t i l lb eh y d r o l y z e db ya c i du n d e rc e r t a i na c i dc o n c e n t r a t i o na n d t i m e b e s i d e s ，a l k a l i n e - h y d r o l y s i si sa n o t h e ri m p o r t a n tw a y o fe x t r a c t i n go l i g o s a c c h a r i d e ， f o re x a m p l e m a n n a nf r o mc e l lw a l lo fs a c c h a r o m y c e sa n d0 【一t y p eo l i g o s a c c h a r i d e sf o r m c e l lw a l io f p l a n ts t a w t h er e s u l t sa b o v es h o w st h a tf a c ei sav a l u a b l em e t h o df o rt h e0 1 i g o s a c c h a r i d e s s e p a r a t i o na n dd e t e c t i o nb yt h el i s ao fo l i g o s a c c h a r i d e ss c a l e ，i tw i l la d v a n c et h eq u i c k a n a l y s i so fh y d r o l y s a t ea n do l i g o s a c c h a r i d e k e y w o r d s ：f l u o r o p h o r e a s s i s t e dc a r b o h y 7 d r a t ee l e c t r o p h o r e s i s ( f a c e ) a c i d _ h y d r o l y s i s o l i g o s a c c h a r i d e t h ec e l lw a l lo fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e p o l y s a c c h a r i d eo f l a m i n a r i a j a p o n i c a a r e s c h o l i g o x y l a n 1 i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果南本人承担。 学位论文作者繇他坂著 日期：弘年l f 月f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被套阅和 借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编术学位论文。 保密口，在 本论文属于 不保密i 。 ( 请在以上方框内打“”) 年解密后适用本授权书。 学位论文作者签名醛口噶v 蔷 指导教师签名 剀复历 日期：1 一 年月 f 日日期：仉巧年月7 日 华中科技大学硕士学位论文 1 绪论 1 1 植物与微生物细胞壁糖的结构与功能 细胞壁是一个古老而又崭新的研究领域，1 6 6 5 年胡克( r o b e r th o o k 】用他自制的 复式显微镜观察软木切片时，所看到的“细胞”实际上就是植物的细胞壁因为细胞壁 在细胞死亡后仍保持其固有的状态，所以过去人们一i 目认为它是代谢上无活性的物 质而予以忽视。本世纪分子生物学的兴起，有力地促进了细胞生物学研究的发展，已 证明高等植物细胞壁作为植物细胞区别于动物细胞的重要特征之一，除了具有机械支 持、物质运输、防御反应等传统功能外，在细胞的生命活动中起着举足轻重的作用。 它能作为信使分子，参与对植物细胞生长的调控，参与细胞之间的识别，参与植物体的 抗病过程，甚至能决定细胞分化的命运。对细胞壁的研究已成为植物细胞生物学研 究热点之一。因而吸引了越来越多的科学工作者从事这方面的研究”1 3 。 细胞壁是植物和微生物进行正常生命活动时不可缺少的重要部分。 1 1 1 植物细胞壁糖 1 1 植物细胞壁多糖的结构和化学组成 植物细胞壁存在于细胞的最外方，是植物细胞区别于动物细胞的显著特钲之 。 细胞壁是具有一定硬度和弹性的固体结构，起着保护和支持细胞的作用，并在很大 程度上决定了细胞的形态和功能。细胞壁限制细胞内部原生质体由于液泡活动而膨 胀所产生的压力，从而使细胞保持一定的形状；细胞壁保护原生质体免受外界彳i 利 因素的影响。细胞壁和植物组织的吸收、蒸腾、运输和分泌等生理活动有很大关系。 对于多细胞植物，细胞壁对各个器官也有支持作用，特别是那些特化为机械组织的 细胞的细胞壁。 植物细胞壁分为3 层，即胞问层( 中层) 、初生壁和次生壁。胞i i 自j 层把相邻细胞 粘在一起形成组织。初生壁在胞向层两侧，所有植物细胞都有。次生壁在初生壁的 罩面，义分为外( s 1 ) 、中( s 2 ) 、内( s 3 ) 3 层，在内层里面，有时还可出现一层具 瘤层。细胞壁发生的步骤有：在由高尔基体所产生的小泡中形成前体( 壁的结构 单位) ，随着膜流的方向，逐步推进到细胞表面，经外排作用，放出前体。放出的 华中科技大学硕士学位论文 前体结合到一定的网状物上= 。在稠密的细胞壁上出现化学变化，转换、变松和生 长等现象，建成了细胞壁。细胞壁的化学组成；胞间层基本上是由果胶质组成( 果 胶质的分解和破坏便引起细胞的分离) 。初生壁是由水、半纤维素、果胶质、纤维 素、蛋白质和脂类组成。次生壁的主要成分也是半纤维素和纤维素，果胶质很少。 这些化学组成在生长与发育过程中是不断改变韵。 图1 1 植物细胞壁 植物细胞壁组分中纤维系是细胞内的结构多糖，即细胞壁的强度主要山纤维素 决定。这与纤维素的结构有关，纤维素是葡萄糖通过b ( 1 4 ) 糖苷键连接成的多糖， 两个葡萄糖彼此绕键轴旋转1 8 0 度，因此纤维素的亚基是二糖单位纤维二糖。纤 维素的葡聚糖链内和链问形成了大量氢键。这使得微纤维儿乎成为晶状聚合体。半 纤维素和果胶多糖是基质多糖。半纤维素是有高度分支的多糖，其骨架缟构为5 0 个 单一类型的单糖通过6 ( 1 4 ) 键连接形成的多糖。半纤维素以氢键与纤维索微纤维 相连。半纤维素的分支结构则结合到基质的其他成分，例如果胶质上。果胶多糖是 含有大量负电荷的多糖，其主要化学成分为鼠李半乳糖醛酸聚糖 ( h a m n o g a l a c t u r o n a n ) 、同型半乳糖醛酸聚糖( h o m o g a l a c t u r o n a n ) 、阿拉伯聚糖 i 丛生! 垒塑2 垫兰塾銎赵( g 型型鲣2 釜：墨壁垒塑兰丝差塑曼王缱盒：堕亘盛塑基塑 2 华中科技大学硕士学位论文 高度水化性质的多糖，因而常被喻为细胞的粘接剂，在细胞间层中含量特别丰富。 基质多糖使纤维素交联，增加了细胞壁的机械强度。基质多糖自身的网状交联促进 相邻的细胞成为整体，基质多糖还调控细胞的生长速度、参与植物的物质运输、抵 御病菌危害及逆境影响及参与细胞问的信息传递等。 表1 1高等植物细胞初生壁的化学分子结构“l 1 8 盘：塑丛耋坌塑 纤维紊 骨( 1 4 ) o 葡萄搪 所有高等植物 举纤维索术葡聚糖 混台键葡聚耱 术聚穗( 包括阿拉伯术臻糖和 4 - 0 一甲基葡萄糖醛酸木稚鸯幻 果腔物质半乳辕醛酸聚特 鼠拳半巍蒋醛酸聚糖 主要在双子叶植物 革于叶禾本科槌物 所宥离等植翱 半巍聚黪和阿拉伯半l 聚锫 礞白质 结构强白( 伸展索) ( 寓含羟a 葑氮主婴在双予叶植物 彀的箍强自) 所翁高等植物 各种酶类 所肴高等植物 鉴塞 对细胞壁糖的研究导致了动态细胞壁的研究深入。 已知植物细胞壁是很刚性的结构。入们用钢筋混凝土来形容这种结构，其中的纤 维素如同钢筋，果胶质和半纤维素则如同混凝土。和动物的细胞间质一样，植物细 胞壁将细胞连接成组织。控制着细胞的生长与分裂，也控制着器官的形状。由于植 物细胞壁的主要功能是抵抗细胞的渗透膨压，所以细胞壁的构造就是针对侧向压力 的。细胞壁的纤维素束在果胶质和半纤维索基质中排列成层，完令覆盖于细胞膜表 面。这样的结构显然限制了细胞的侧向扩展。那么植物是如何侧向生长和发育的毗? 研究植物生长时发现，植物的根茎顶部的分生组织的细胞壁始终处在巨大的变化当 中。顷端分牛组织是细跑分裂和延伸的位置。幼年缎胞被薄薄的初生细胞肇连接存 一起，因此比较容易松弛和拉伸，这就使得细胞能够延伸。细胞获得延伸后，细胞 壁则重新加厚，通常认为加厚主要借助次生壁的形成。在基质中存在一些蛋白质， 在植物生长时它们负责使细胞壁松弛。例如细胞壁靠近细胞膜的位置p h 由正常的7 0 华中科技大学硕士学位论文 降到4 5 ，低p h 激活了一类称为膨胀素( e x p a n s i n ) 的蛋白质。它能破坏细胞壁微纤 维的氢键，引起细胞壁的结构松弛。 纵观近些年研究进展，有关细胞壁多糖的研究大体包括了两个方面。一是揭示了 细胞壁的几种主要多糖的合成部位和合成机制是不同的，植物生长期间不溶性的纤 维素的合成是由纤维素合酶催化的，发生在细胞壁中，是一个动态过程。对植物细 胞壁纤维素的牛物合成研究揭示了纤维素微纤维的合成和定向都发生在细胞壁。上 胞浆合成的u d p 葡萄糖和a d p 葡萄糖都被运输到质膜的外侧，在那里作为纤维素合 酶( c e l l u l o s es y n t h a s e ) 的原料。二是揭示在植物生长期间和微生物侵染期间等过程 中，有多种糖苷酶参与催化细胞壁多糖的降解，所产生的寡糖参与植物细胞通讯和 保护微生物。 1 1 1 2 植物细胞壁的功能 植物细胞壁首先是细胞消极防御外来病原传入的结构屏障，这是植物细胞壁结构 赋予它的首要功能。与此同时，植物细胞壁在细胞受到感染a n g , j 伤时，能积极参与防 御反应，这包括几个方面：细胞壁中酶水解真菌病原体细胞壁中的多糖成分，其水 解碎片中的活性成分诱导植物抗毒素合成酶基因的表达。病原菌在入侵植物时必 须水解植物细胞壁中的结构多糖，其降解产物也有类似植物抗毒素诱导物的活性； 此外植物在受到侵染时，细胞壁中产生抑制物能抑制病原体释放的酶。在没有病原 体入侵，但受到创伤时，植物自身也会产生些水解酶，降解细胞壁的组分，诱导防 御反应，以及修复创口。 此外，细胞壁与植物生命活动的3 个基本方面信息传递，物质代谢，能量转 化都密切相关巧q 们，具有不同功能的植物组织或细胞，其细胞壁往往在结构上也相 应发生变化。例如细胞壁是植物细胞最火的钙库，壁 c a ”浓度远远大于胞内。壁 中自由c a 2 + 随生长发育、环境刺激而变化，以调节生长发育，一般视之为胞内信使。 细胞壁中还含有水溶性的钙调素( c a m ) ，以离子键结合于壁上，其理化特性与胞内 c a m 基本相同。外源c a m 在胞外起促进细胞增殖作用。细胞壁上有c a m 结合及作 用位点，目l l c a m 结合蛋白在某些信号的传递中起着重要作用。植物细胞初生壁多糖 降解碎片中有类寡糖素可以在细胞生长控制中起调节作用，如双子叶植物细胞壁 4 华中科技大学硕士学位论文 中木葡聚糖( x y l o g l u c a n ，x g ) 的降解产物x g 9 ，即参与细胞的防御功能。 1 1 2 微生物细胞壁糖的结构与功能 绌菌、真菌和酵母等微生物都有细胞壁，但是其多糖组成相当不i j 。 细菌细胞壁是位于细胞膜外的一层较厚的、峰韧并略具有弹性的结构，有保护细 胞的作用，约占细胞干重的5 0 ，机械强度高，生物学活性稳定。细菌细胞壁的主要功 能是：1 ) 维持细胞外形；2 ) 保护细胞免受机械损伤和渗透压危害；3 ) 鞭毛运动支 点；4 ) 正常细胞分裂必需；5 ) 一定的屏障作用；6 ) 噬菌体受体位点所在。细菌细 胞壁中存在许多活性成分，主要包括：脂多糖( lp s ) 、肽聚糖( p g ) 、类脂a 相关蛋白 ( l a p ) 、表面相关物质( s a m ) 、磷壁酸( t a ) 、脂磷壁酸( t c a ) 以及脂蛋白等。这 些成分都可以诱导各种细胞因子( 如白介素、干扰素等) 的释放，调节宿主的免疫功 能，与细菌的抗原性、致病性有关。 细菌细胞壁的结构以革兰氏染色不同而分为两类。即革兰氏阳性菌g + 和节兰氏 阴性菌g 一。经革兰氏染色后凡是不能被乙醇脱色，呈蓝紫色，称为革兰氏阳性菌g + ， 凡是经乙醇脱色，呈复染剂颜色，称为革兰氏阴性菌g 一。结果不同主要是细胞壁组 成及结构差异造成的。以金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 为例，细胞壁构 成为一连续层，厚2 0 8 0 r i m 。它由网状骨架：微纤丝两部分组成。其化学组成主要是 肽聚糖1 ( 图1 2 ) 和磷壁酸。肽聚糖( p e p t i d o g l y c a n ) 是细菌细胞壁中的一种特 殊成分。它由n 乙酰葡萄糖胺( 简写为g ) 、n 乙酰胞壁酸( 简写为m ) ，以及短肽等 构成。n 乙酰葡萄糖胺和n 乙酰胞壁酸交替重复连接成聚糖骨架；肽聚糖是细菌细 胞壁特有成分扪，也是原核微生物特有成分( 古生菌没有) 。磷壁酸( t e i c h o i ca c i d ) 又称垣酸，足g + 特有成分。它是由多元醇与磷酸复合物，通过磷酸二酯键与n a m 相 连。根据多元醇不同，有甘油型、核糖醇型等5 种类型1 33 。其主要功能是使壁形成 负电荷环境，吸附二价金属离子，维持壁硬度和一些酶活性。还可提供噬菌体位点。 短肽靠肽键连接在聚糖骨架的n 一乙酰胞壁酸分子上；相邻的短肽交叉联结，形成高 强度的网状结构。不同种类的细菌，组成肽聚糖的聚糖骨架相同，但短肽的组成和 相邻短肽间的联结方式不同。如金黄色葡萄球菌的短肽由l 谷氨酸、d 一谷氨酸、l 一 赖氨酸和d 丙氨酸组成。 华中科技大学硕士学位论文 = 2 = = = = = = = = = = = ；= = = = = = = = = = = = = = = = = = = 一m _ - - 厶m ， 0 70 70g 7g 7 m c m 7m 二f m 7m 乙 ooogo 7 m ，一m j 一 p pp ， 芦g 芦。芦 ， ， g g g 7o g m 乙，m 2 ，以 o g g 7g g 图1 2 肽聚糖结构示意图 革兰氏阴性菌( g r a m n e g a t i v e ) 以大肠杆菌为例：它的内壁层是厚2 3n m 单( 双) 分子层，由肽聚糖构成。它的外壁层有3 个部分：内层是脂蛋白层，以脂类部分与肽 聚糖相连。中层是磷脂层。外层是脂多糖层，是外壁重要成分，厚8 、1 0 n m 。其中脂 多糖( 1 i p o p o l y s a e c h a r i d el p s ) 是g 。特有成分。它的结构特征是：类脂a + 核心多 糖+ 0 - 侧链。它的功能是：1 ) 内毒素物质基础；2 ) 吸附镁、钙离子；3 ) 决定g 一表面 抗原：4 ) 噬菌体受体位点。钙离子是维持l p s 稳定性所必需的。目前，人们比较关注细 菌细胞壁成分p o 和l p s 。 放线菌是由分支状菌丝体构成的原核生物，其细胞壁的主要成分是肽聚糖。 酵母菌( y e a s t ) 细胞壁：厚0 1 - 0 3 9 i n ，三层，由酵母纤维素组成( 甘露聚糖、葡聚 糖、蛋白、类脂) 。用蜗牛酶( h e l i a s e ) 破坏壁来制备原生质体钔。 霉菌( m o l d s ) 细胞壁厚1 0 0 2 5 0 h m ，多含几丁质。 在植物与微尘物相互作用中，微生物细胞壁多糖不仅超着识别宿主的作用，也 起着保护自身的作用。 1 ，2 寡糖分析在细胞壁功能研究中的意义 1 2 1 功能寡糖与糖生物学 科学家对糖的研究始于1 9 世纪。糖与蛋白质、脂类和核酸一样，是组成细胞的重 要成份，糖作为能量物质及结构物质的作用早已被人们所熟悉。随着研究的深入，特 6 华中科技大学硕士学位论文 别是分子生物学及细胞生物学的发展，糖的其它诸多生物功能不断被认识。早在2 0 世 纪6 0 年代，科学家就发现了细胞表面充满着如糖蛋白、蛋白多糖及糖脂等糖缀合物， 并推测糖不仅可以以多糖或游离寡糖的形式直接参与生命过程，而且可以作为糖缀合 物参与许多重要的生命活动，特别是担负识别功能，但限于当时的研究条件却无法用 实验证实。随着外切和内切糖苷酶相继在糖的结构测定中应用以及糖基转移酶的克 隆，对糖缀合物的糖的功能研究才有了可能。糖缀合物主要是糖蛋白，其糖多为寡糖 1 5 1 9 9 0 年1 1 月同时由三个不同的研究小组发现当组织受到损伤或感染时，白细胞 表面的四聚糖唾液酸路易斯x ( s - l e x ，一种血型抗原) 与血管内皮细胞表面的蛋白 s e l e c t i n 间的识别介导白细胞与内皮细胞粘附，使白细胞沿血管壁滚动终至穿过血管 壁进入受损组织以杀灭入侵病原物，但过多的白细胞集中则引起炎症及自身免疫疾病 如类风湿等。这是真正第一次在人体中确证了寡糖s l e x ( 也包括s l e a ) 的生理功能。 1 9 9 4 年，v e l l u p i l l a i 和h a m 从一种血吸性寄生曼蚊卵表面抗原中发现了两类在 动物对寄生虫的防卫反应中起信号转导作用的寡糖l a c t o - n f u c o p e n t a o s ei i 和其非岩 藻糖基化同系物l a c t o n n e o t e t r a o s e ( 图1 3 ) 这证明寡糖参与丁动物防卫反应。 g a 】p ( 1 - 4 ) g i c n a c ( 1 - - , - 3 ) c , 1 9 ( 1 - - - 4 ) g l e a f u c ( l a c t o - n - f u c o p e n t a o s e1 1 ) g a l p ( 1 4 ) g l c n a c 0 ( 1 3 ) g a 坤( 1 一) g i c ( l a c t o - n n e o t e t r a o s e ) 图13 两类在抗寄生虫的防卫反应中起信号转导作用的寡糖的结构 此外，糖在细胞的构建、细胞的生物合成和细胞生命活动的调控中，均扮演着重要 的角色。科学家们发现，糖链几乎参与了真核生物的所有生命过程6 1 引。在分子内， 糖影响蛋f l | 质链的折叠、抗原性和其它生物活性；在分子间，能通过糖缀合物糖链与蛋 7 华中科技大学硕士学位论文 白质的相互作用来介导细胞的识别，调控生命过程：糖脂糖链不仅有识别功能，本身也 是信号传导分子。总之，生物的受精、发生、发育、细胞分化、内分泌、免疫、神经 传导、癌变等生命过程，都离不开糖的参与。科学家认为，不搞清糖的结构与功能。很 难对蛋白质的许多功能作出科学的解释，对糖的结构和功能的好奇与探索导致了一 门新的科学分支糖生物学的产生和发展。 糖生物学是研究糖缀合物糖链的结构、生物合成和生物学功能的一门科学。 糖生物学作为生物医学和生物化学交叉点的新前沿在西方发达国家受到高度重 视。荚园能源部资助佐治亚大学于1 9 8 6 年创建复合糖研究中心( c c r o ，建立复台糖 结构数据库c c s d 其计算机计划也称c a r bb a n kp r o j e c t 。在1 9 9 0 年底仪有糖结构数 据6 ，0 0 0 个，到1 9 9 6 年该数据库已有记录4 2 ，0 0 0 多个。仅9 6 年一年的增加数相当于 1 9 9 1 年的4 倍。目前该数据库已移至g l y c m o r n i n d s ( m w g l y c o m i n d s n e t ) 。在线虫基 因组研究完成后，作为基因组和蛋白质组研究的延伸，美国新罕币什入学化学系的结 构生物学研究中心启动了一项“线虫糖组学研究”计划，分析测定线虫的糖组 ( g l y c o m e ) ( 定义为细胞内所有的糖链组分) 、开展糖组学( g l y c o m i c s ) 研究( 即研究糖链 的表达和调控) ，目的在于确定基因所携带的遗传信息与其功能之间的关系”粥。 当前糖生物学的研究的范围主要包括糖链的结构、性质、糖链在细胞中的生物合 成，糖链在生命系统中的功能，糖链基因程序和分子操作。 1 2 2 细胞壁与寡糖素 植物和微生物的细胞壁是功能寡糖的重要来源。文献眨o t 2 1 比较全面综述了有关 的进展。七十年代初，a l b e r s h e i m 等首次从侵害植物的真菌病原体p h y t o p h t h e r e m e g a s p e r m a 的细胞壁中发现一种植物防卫反应的寡糖，经分离纯化，确定该寡糖的 结构是一种葡聚七糖，其结构式如图1 4 。 g l c 9 ( 1 6 ) g l 雌( 1 - - * 6 ) g i c t i ( 1 - * 6 ) g l c 8 ( 1 一- 6 ) g i c + i ” p g l ct i g l c 图1 4 植物防卫反应的葡聚七糖 8 华中科技大学硕士学位论文 表12 寡糖素的生理功能 寡楷桑 聚台艘嫩娅来辙 毕 啦作用文商如 抑 5 l | 2 4 诱译的豌最上胚 59i 。- 、1 0 链玫瑰悬浮培养细胞壁 3 j 3 5 轴伸长生长 未 p 91 0 - 间上 激发统霞上胚辅纤维索酶活 2 1 3 6 确 性，健生长 聚 9 1 0 j o 。i em斟上 抑制琬甚上胚铀h + 诱导的忡 柑 长生长 3 1 寡 假挪威撤细胞培养率窿抑制2 4 幻诱导的豌售上肝 5 6 船 9 1 0 - k 轴伸长生长 寮 x g a 、9 1 l1 0 e t 0 一同上随上 2 5 91 竭上化学台成嘲上 2 9l o 一1 0 一【0 。葫舻h 培养细腿锩抑制胡萝 原生质体缝再生 2 0 i o v l l6 x l 寸氛f聚果竣酸钠诱导大煦于叶抗逝索台成 1 8 1 2札 酒。叶大豆细胞壁柑桔果胶 同上2 8 ，3 9 擞发蓖麻无菌研壹尔酮台成 1 3 h n g 曲i 蓖麻无菌博细胞蹙 喃基因袭选 1 1 ，2 9 3 1 p6i 【r x j h l幕茄果腋诱导裤茄叶片p 1 摧圈袁地 673 8 0 1 2 l 9 3l 皿j 1 诱导稀茄质膝中酱白质p p ” i 4 1 5删上 2 2 2 3 噩自质磷酸化 寡 33 1 0 。m多聚半乳糖醮髓谱导菥茄毡a 氧化 4 1 聚 抑制h a 诱导肫珧苴上腌轴 9 半 ) 8 0 l j n g 丑1 聚累胶酸钠 停长生长抑制乙烯合成 乳 锥 j 一7 l i r a 矗l柑艳粟姣 诱导耩茄细匏鹱髅i 毡辨- 去极 醛 1 0 2 0化 j 2 酸 诱导蓖麻悬浮细胞术质聚合 7 0 1 5 m g 品l 多聚半累糖醛酸 1 2 成 使豇锚荚果产生超嗷反应出 4 3 i 趣6 h l豇聂细臆壁 l3 现枯斑 bs 0 i m 互h l或熟棼茄果脆诱导繇蔷茄乙烯台成和催熟 1 0 假挪威罐培莽纲胞，柑抑制假挪威撼细胞器白旗台 5 5 口 l 皿g 甄i 桔集脏 成杀死细胞 抑静j h + 诱导韵筑强上胍轴伸 纤维寡摊 n7 1 0 。纤维誊粉 3 2 长生长 葡聚寡糟7 8l 直蔺细胞燎化学合成携导大再子叶橇青寮台成 3 0 根短菌感染甘挫过糙 根摘寡稚 41 0 。诱导蓖稽形成讯瘸 3 0 中产生的 甘孬糖寡糖 铲71 n z 果实成熟祷茄果肢儡绿赫茄合成乙烯和催熟 4 2 铲9i 0 0 i r a 啪株真菌壳泉糖澈活甜瓜无茼莆讫聚糖酶 4 3 壳聚糖寡糖激活莱崩掠生质休光聚糌酶 7 2 5 t m 上 4 4 基因转球 脱乙酰强 聚糖寡罄鼍 p6 弧g 面l 真蔺脱乙酰究聚耱 诱导蒋茄叶片pl 基园裹选 5 4 啦圭多种培养细胞生长和谈生 参募糖铲8 1 g 弼l a 参培养细胞壁 5 7 嘞爵台茂 华中科技大学硕士学位论文 伤叶片内pi 基因活化，如切断叶柄只有损伤叶片内pi 基因活化，后来发现寡糖分 子能模拟受伤诱导效应，活化pi 基因。为此，b o w i e s ( 1 9 9 0 ) 曾认为寡糖分子代表可 移动的信号分子。损伤植物一个叶片，受伤部位细胞壁多糖结构断裂产生寡糖分子， 然后寡糖分子释放到维管束系统中在植物体内运输，从而诱导植物令身pt 基因表 达。但是这个模型缺乏足够的证据。最近报道放射性标记的寡糖分了不能征植物体 内运输，说明寡糖分子不可能是长距离移动信号分子。 像这样一类产生于细胞壁多糖的降解过程的功能寡糖，有一个统一的名称寡 糖素。由于它一开始运用即和生物学功能联系，因此对寡糖素的组成和结构没有严 格定义，它可以单指某种寡糖，也可以是寡糖的混合物。现在知道寡糖分子不仅能 激发包括植物抗毒素合成在内的多种防御反应系统，而且能有效地调节植物生长和 发育过程。表1 2 总结了近年来证明的寡糖素的生理功能及其来源口”。 和人体或动物寡糖的作用机制相似，植物或微生物细胞壁来源的寡糖素也可能 是通过与植物细胞膜受体结合来介导的。 ：世纪8 0 年代末到9 0 年代系列放射性标记的寡聚口一葡萄糖分子和大移细胞质 膜结合的实验表明，寡糖分子可以和细胞质膜上某些蛋白质结合。这种结合具有饱和 性和可逆性，不同寡糖分子和细胞质膜结合能力不同，活性高的结合能力强，而且其 最有效诱导活性浓度也是和质膜蛋白质结合的最佳浓度。g r a b 等( 1 9 8 9 ) 在人鬯悬浮培 养细胞中加入葡聚七糖，诱导抗毒素合成时细胞内约3 5 种蛋白质磷酸化。因此，大 豆细胞质膜某些蛋白质符合受体应具备的条件：饱合性、专一性和产生后效应。虽然 寡聚半乳糖醛酸类寡糖素受体未见报道，但d i e t r i c h 等( 1 9 9 0 ) 弄n f e l i x ( 1 9 9 1 ) 分别发现 这类寡糖素激活pi 基因和细胞质膜中蛋白质激酶催化某些蛋白质磷酸化过程相关。 f a r m e r 等( 1 9 8 8 ) 贝j j 发现聚合度在2 2 0 之间的寡糖分子能诱导马铃薯和蕃茄细胞质 膜蛋白质p p 3 4 的磷酸化。f a r m e r 等f 1 9 9 1 ) , 和j 用不同寡糖分子进行试验证明，寡精分 子活性大小和蛋白质磷酸化水平正相关。p e l i s s i e r 等( 1 9 8 6 ) 和t h a i n 等( 1 9 9 0 ) 分别报 道，诱导pl 基因表达的寡糖分子能改变细胞质膜中h 十一a t p 酶活性，快速导致蕃 茄、炯草等叶细胞质膜电势去极化。根据这些结果，r y a n ( 1 9 9 2 ) 建议 个寡糖素作 用原理的模型。在这个模型中，寡糖分子首先和细胞质膜受体结合，改变膜相关的牛 1 0 华中科技大学硕士学位论文 理过程，激活膜中蛋白质激酶活性，调节专一性蛋白质磷酸化，进而影响相关酶活性 和导致专一性基因表达。 1 2 3 寡糖素对人体和动物体的作用 寡糖素的活性作用最初是因其能诱导植物抗毒素合成而确定的。但是现在证明 来自植物和微生物细胞壁的寡糖素对人和动物也有一定的作用 2 4 , 2 5 1 。 1 - 2 3 1 胃肠道活性 纯寡糖是寡糖类化合物中结构最简单的一类寡稀，但其却具有许多重要的牛物功 能。首先，纯寡糖( 如乳果糖、果聚糖、大豆低聚糖、异麦芽糖等) 可作为种促双歧 杆菌生长因子。所谓双歧杆菌促生长因子是指能促进双歧杆菌生长繁殖的一大类天 然及合成物质，能提高人体免疫力，使肠道内p h 值下降，抑制肠道有害菌生长产生b 族维生素，分解致癌物质，促进肠蠕动及蛋白质吸收。已知的这类物质约有2 0 多种。 人体摄入适量的b f 可以促进双歧杆菌的增值并增强其活性，有益于调整微生物群落 的分布。除此以外天然的纯寡糖还有其它如供能、预防蛀牙、降低血脂及促进矿物 质吸收等十分重要的功能。大豆低聚糖还有拮抗机体过氧化损伤及降脂作用。果寡 糖饮用后钙、铁、镁的吸收率有上升趋势。基于纯寡糖的上述功能，人们丌发出许多 寡糖类保健食品。某些纯寡糖也有一定的副作用，如大豆低聚糖中的棉了三糖和水苏 四糖不能被冒和肠上段的消化酶消化，而被结肠中的细菌发酵产气，引起肠胃胀气，被 称为大豆胀气因子，是大豆的抗营养因子之一。 1 2 32 增强造血功能活性 中药具有纯天然、低副作用等优点，但成份复杂，作用机理0 ：易阐明，使得中药难以 得到国际公认。要改变这种状况，研究者首要解决的问题是提取中药中的有效成分。 而糖类作为中药中普遍存在的成分，也就成为中药有效成分研究的重要对象之一。近 几年从中药中提取出的寡糖有效成分有很多，其中地黄多糖，甘草及巴戟天中的多糖 研究尤其引人瞩目。 1 2 3 3 促有丝分裂活性 甘草fg l y c y r r h i z a u r a l e n s i s ) 根的果胶多糖类中提取出的t i ，性低聚糖多羟糖 酸组分，具有抗补体和促有丝分裂活性。其中，最长和最短的低聚糖多羟糖酸组分， 华中科技大学硕士学位论文 具有相对强的抗补体活性，而其余所有低聚糖多羟糖酸组分，仅表现弱的抗补体 活性，但有显著的促有丝分裂活性。 1 2 3 4 抗抑郁活性 中药巴戟天系茜草科巴戟属植物巴戟天的根经炮制而成的传统中药，具有补肾壮 阳、强筋祛风之功效。崔承彬等经各种榔郁模型筛选发现，巴戟天提取物有明显臼5 抗 抑郁活性。经进步萃取、透析、凝胶柱色谱及高效液相色谱等分离手段得到4 个 具有显著抗抑郁活性的寡糖单体。其化学结构式如图1 5 所示。 h 0 2 0 hh 2 0 h n = 2 ，3 ，4 ，5 图i 5 从中药巴戟天系茜草科巴戟属植物巴戟天提敏的寡糖 1 2 3 5 提高免疫活性 甲壳质是肛乙酰基d 。葡萄糖胺以夕( 1 4 ) 苷键结合而成的多糖。它是蟹、虾 等甲壳类、甲虫等的夕卜骨骼及蘑菇等菌类的细胞壁的构成成分，是广泛存在于自然界 的天然高分子物质。它的脱乙酰基化合物称为壳聚糖。甲壳质、壳聚糖部分酸解 可分别得到几丁寡糖( c h i t i no l i g o s a c c h a r r i d e s ) 和壳寡糖( c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ) 。几 丁寡糖是指一乙酰葡萄糖胺以芦( 1 4 ) 禄苷键连接i 成b b 2 j 0 个单元的 瓦 聚糖( g 1 u n a c 2 - - g i u n a c l 0 ) ，可通过甲壳质水解制得。壳寡糖是葡萄糖胺通过l ，4 键合而形成的2 1 0 个单元的低聚糖，可由壳聚糖部分水解制得。几r 聚糖在食品领 域有望作为乳酸菌的增殖促进剂。壳寡糖具有增强人体免疫力，在改善食品结构提高 食品保水性能方面有重要作用。此外，壳寡糖县有能被溶菌酶分解的性质，可以使壳寡 糖的 7 j 生物作为医疗诊断的指标。在医药方蕊，近年铃木等发现- 乙酰壳寡六糖具有 很高的抗感染、抗癌活性；m i n 踟i 等人也验证了壳寡糖对伤口的愈合有显著的作用， 华中科技大学硕士学位论文 有望成为实用的医用品；另外发现几丁寡糖、壳寡糖还在植物生长、分化及生物体抗 御方面具有信号传导活性。在诞生不久的婴儿肠道内存在一个稳定而复杂的微生物 群落，它包括4 0 0 多种相互依赖的细菌，这对于一个抵御疾病能力很弱的婴儿来说无 疑是颗定日、j 疾病炸弹，但母乳喂养的婴儿并没有因此而出现很高的发病率利死t ： 率。这主要是得益于母乳为婴儿提供了很好的抵御病原体的物质。复合糖作为母乳 中活性成分之，可为抵御疾病起到十分重要的作用。 此外，r i n as a k s e n a 等从水牛的乳汁中提取出的一种4 4 糖寡糖也具有重要免疫活 性。其结构为：g i c n a e f l ( 1 - - - * 3 ) g a l ? ( 1 - - - ，| 4 ) g l e n a c p ( 1 3 ) g a l f l ( 1 4 ) g l c 。这种寡 糖经过处理后注入b a l b p c 小鼠体中，可同时诱发小鼠产生迟发型超敏反应应答和 产生基于巨噬细胞数量的非特异性免疫应答。实验结果提示该五糖寡糖是一种免疫 刺激剂口6 1 。 1 2 3 6 抗病毒活性 朗：多天然寡精提取物具有重要的药理活性。研究者根据它们的作用机理和构效 关系而进行合理的结构改造修饰，可以得到一些有更好药理活性、更低毒副作用、更 适于作为药物使用的化合物。k a n a m ek a t s u r a y a 等合成的磺酸化的寡糖有很好的抗 h i v 活性。这些化合物是k h 4 6 个单糖组成的罗布寡糖衍生物。k a n a m ek 1 等计细 研究了这些衍生物的合成及其构效关系，发现单糖数越多，其抗h i v 活性越高；寡糖的 磺酸化程度越高，其活性也越高；r 基团的碳原子数适当