（发酵工程专业论文）酶法降解壳聚糖工艺的研究.pdf

摘要 壳聚糖是一种具有环境友好特性的天然高分子材料，它是从来源广泛的甲壳素 脱乙酰化获得的，其降解产物一低聚壳聚糖具有许多优异的性能。低聚壳聚糖在医 药、饲料、食品、生物、农业等众多领域具有重要的应用价值。目前，低聚壳聚糖 的制备方法有很多种。主要有物理、化学、酶降解法。酶降解法通常优于其他方法， 其反应条件温和，工艺较易控制，是主要的发展方向。 本课题的目标是通过筛选能有效降解壳聚糖的菌株，进而以壳聚糖为原料进行 酶解工艺的研究，获得分子量在1 0 0 0 2 0 0 0 的低聚壳聚糖的方法。 本文的研究，主要分三步进行：纤维素酶产生的菌株的筛选。通过实验室保 藏的菌株的筛选，获得了一株产纤维素酶酶活较高的菌株m - 2 0 , 结果表明，紫外线 诱变复筛后得到菌株m 2 0 ，该诱变菌株与原来的出发菌株的c i v i c 酶活分别为 9 8 1 2 0 7 5 u g 和4 7 5 0 5 9 u g ，酶活提高了1 0 7 ，并探索了纤维素酶水解壳聚糖的条 件。产甘露聚糖酶菌株的发酵及酶鳃工艺的研究。用纤维素酶和甘露聚糖酶分 别单独， 昆合废替降解胶体壳聚糖，用g p c 对降解后的产物的分子量的分布进行比 较。实验结果表明，先用纤维素酶水解1 2 h ，再用甘露聚糖酶水解1 2 h ，壳聚糖底 物的高分子基本降解，o d 值远高于其他降解情况，降解程度最好。相对分子质量 分布于1 3 x1 0 3 左右。降解得率为9 1 8 。且实验结果稳定。 关键词：壳聚糖纤维素酶甘露聚糖酶g p c c h i t o s a ni sa l le n v i r o n m e n t a lf r i e n d l yc r u d em a c r o m o l e c u l cm a t e r i a l i ti sm a d e f r o mc h i t i nb yd e a c y l a t i o nt h a ti sd i s m b u t e dw i d e l yi nn a t u r e c h i t o o l i g o s a c c h a r i d et h a t i st h ed e g r a d a t i o np r o d u c to fc h i t o s a nh a sm a n ye x c e l l e n tc a p a b i l i t i e s i th a si m p o r t a n t v a l u ei nm a n yd o m a i n s ，e gm e d i c i n ef e e d i n g s m f ff o o d s t u f fb i o l o g ya g r i c u l t u r e i th a sa g r e a tm a n yw a y st od e g r a d ec h i t o s a n m o s t l y , t h e r ea r cp h y s i c a ld e g r a t i o nm e t h o d , c h e m i c a ld e g r a d a t i o nm e t h o da n db i o l o g i c a ld e g r a t i o nm e t h o d t h eb i o l o g i c a ld e g r a t i o n m e t h o di sm u c hb e t t e rt h a no t h e rm e t h o d s ，r e a c t i o nc o n d i t i o ni sm i l d ，t h ec r a f ti se a s i e r t oc o n t r 0 1 n cb i o l o g i c a ld e g r a t i o nm e t h o di st h em a i nd e v e l o p m e n td i r e c t i o n n ct a s ki st o r 啪t h es t r a i n sw i t hah i g h - y i e l dc e l l u a s eo rm a n n a n a s ew h i c hc a n d e g r a d ec h i t o s a nt oc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e t h r o u g ht h o s ep r o c e s s ，g a i nt h em e t h o do f c h i t o o l i g o s a c c h a r i d ew i t hm o l e c u l a rw e i g h ta t1 0 0 0 2 0 0 0 t h es t u d yp r o c e e d e df r o mt h r e ep h a s e s f i r s t l y , t h r o u g ht h es c r e e n i n gs h c a i ：i i s , w e h a dh a v eo b t a i n e ds t r a i nm 2 0 1 飞er e s u l ti n d i c a t e dt h a tam u t a t e ds t r a i nm 2 0w a s o b t a i n e dt h r o u g ht r e a t m e n to fu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n , i t sc m c a s ew a s9 8 1 2 0 7 5 u g , a n d t h e c m c a s eo ft h eo r i g i n a ls u a i nw a s4 7 5 0 5 9 u g i t sc m c a s ew a si n c r e a s e db y1 0 7 a n d i n v e s t i g a t eo nt h ed e p o l y m e r i z a t i o no fc h i t o s a nb yc e l l u a s e s e c o n d l y ，w eh a v eo b t a i n e d m a i m a n a s ot h r o u g hf e r m e n t a t i o n ，a n di n v e s t i g a t eo nt h ed e p o l y m e r i z a t i o no fc h i t o s a nb y m a n m a n a s e a tl a s t , c h i t o s a nw a sd e g r a d e db ym a n n a n a s ca n dc e l i n l a s ea l t e r n a t e l ya n d i t sp r o d u c t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s a t a sw a so b t a i n e d t h ep r o d u c t i o nw a ss e p a r a t e d t h r o u g hs e p h a d e xg 1 0 0 n e r e s e a r c hi n d i c a t e dt h a tc h i t o s a nw i t hh i g hm o l e c u l a rw e i g h t 啪b ea l m o s td e g r a d a t e dc o m p l e t e l yb yh y d r o l y s i so fc h i t o s a nw i t hc e l l u l a s ef o r1 2 h o u r sf i r s t , h y d r o l y s i so fc h i t o s a nw i t hm a n n a n a s cf o r1 2h o u r s t h em o l e c u l a rw e i g h t o fe n z y m a t i ch y d r o l y s a t e si sm a i n l ya t1 3 0 0 0 d a ，t h ey i e l do fd e g r a d a t i o ni s9 1 8 ，a l s o t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l ti ss t a b l e k e yw o r d s ： c h i t o s a n ；m a n n a n a s e ；c e l l u l a s e ；g p c 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密名 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同l - 作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：鸯建时问：盯口7 年月，6 日 黼娩莲毒 ：房当群 签名吼姊年；月，参日签名日期：岬年易月f 易日 华中农业大学2 0 0 届硕士论文 l 前言 壳聚糖是甲壳素n 一脱乙酰基的产物，一般而言，n 一乙酰基脱去5 5 以上的 就可称之为壳聚糖( 蒋挺大，2 0 0 3 ) 。在自然界中，只有接合菌纲真菌细胞壁中存 在壳聚糖。它主要是由氨基葡萄糖或少量乙酰氨基葡萄糖残基通过p 一1 ，4 糖苷键 连接而成的天然线性高聚物，是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有许多特殊的物理 化学性质和生理功能( 杜予民，2 0 0 0 ) 。因此，开发壳聚糖的应用一直受到广泛的 关注和重视。 虽然一系列研究表明，壳聚糖本身在分析化学、食品工业、功能材料、医药、 农业和轻纺工业等方面有极其广泛的应用价值( 高福成，1 9 9 8 ；v a m mkm 2 0 0 1 ) ， 但由于壳聚糖相对分子质量大，水溶性差，在酸溶液中的高粘性，其在人体内不易 吸收，从而使其应用受到限制( j e o n , 2 0 0 0 ) 。 近年来的研究发现，当壳聚糖高分子降解成为相对较小的低分子后，其理化性 质以及某些生理功能将会发生变化。甲壳低聚糖( c h i t o o l i g o s a c c h a r i d c s ，缩写为c o s ) 是甲壳素和壳聚糖经过化学降解或酶法降解生成的聚合度为2 2 0 的低聚糖，是由氨 基葡萄糖或n 乙酰氨基葡萄糖组成的低聚物，是甲壳素和壳聚糖一类重要的衍生物 ( 夏文水，2 0 0 1 ) 。甲壳低聚糖由于分子链长度较壳聚糖高分子大大降低，分子之 间不易形成较强的氢键，水溶性大为改善，其中相对分子质量低于1 0 k d a 的甲壳低 聚糖可以直接溶于水中( 段杉等，2 0 0 2 ) ，能在人体内被消化吸收，克服了壳聚糖 水溶性差的缺点：同时，由壳聚糖高分子降解为较短的甲壳低聚糖分子，导致其溶液 粘度也大大降低，这些特点极大地扩展了壳聚糖这一天然资源的应用领域。 甲壳低聚糖不仅保持了壳聚糖大分子所具有的某些功能性质，而且还具有许多 壳聚糖所不具备的独特的生理活性和功能性质，在食品、医药、化妆品和农业等领 域有着极其广泛的应用，己成为国际上新兴的一种功能性低聚糖( 许清森，1 9 9 3 ： 王士奎和王汉替，1 9 9 4 ) 。 1 1 壳聚糖的结构与性质 1 1 1 壳聚糖的结构特征 甲壳素和壳聚糖锝结构式如下： 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 图1 - 1 甲壳素的结构式 图1 - 2 壳聚糖的结构式 f i g1 - 2 s t r u c t u r a lf o r m u l ao fc h i t o s a n 如果把壳聚糖结构式中每个糖基上的氨基换成羟基，就成了纤维素。 图1 - 3 纤维素的结构式 f i 9 1 - 3 s t r u c t u r a lf o r m u l ao fc e l l u l o s e 甲壳素和壳聚糖的结构单元不是单糖( n 一乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖) ，而 是二糖，即甲壳素的结构单元是甲壳二糖，壳聚糖的结构单元是壳二糖，图1 - 1 和 图1 - 2 中大括号内的就是二糖结构单元。我们一般说甲壳素是由n 一乙酰氨基葡萄 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 糖缩合而成的，这是指它的基本组成单位是n 一乙酰氨基葡萄糖，而其基本结构单 元却是甲壳二糖；壳聚糖是由n 一氨基葡萄糖缩合而成，其基本组成单位是氨基葡 萄糖，而基本结构单元是壳二糖。在甲壳素酶自然降解甲壳素时，最后产物是甲壳 二糖而不是n 一乙酰氨基葡萄糖，也就是说，甲壳素是以6 1 ，4 一甲壳二糖残基作 为重复单元形成的；在壳聚糖酶自然降解壳聚糖时，最后产物是壳二糖而不是氨基葡 萄糖，即壳聚糖是以b 一1 ，4 一壳二糖残基作为重复单元形成的。 壳聚糖可由甲壳素通过脱乙酰基反应制得，其反应式如下： 甲壳素壳聚糖 图1 4 壳聚糖得脱乙酰基反应 f i g1 - 4d e a c e t y l a t i o nr e a c t i o no fc h i t o s a n 反应的实质是酰胺的水解反应，一般在加的n a o h 溶液中于1 0 0 1 8 0 加热非均相进行，得到可溶于稀酸，脱乙酰度一般为8 0 左右的壳聚糖。与一般的 胺类物质不同，壳聚糖中的氨基在碱液中十分稳定，即使在5 0 的n a o h 中加热到 1 6 0 c 也不分解( 蔡中丽等，1 9 9 8 ) 。提高反应温度、碱液浓度及延长反应时间可提 高脱乙酰度，但在碱液中壳聚糖的主链降解也变得严重，其表现为随着脱乙酰度的 提高，通常伴随粘度及分子量的下降( r a os ve ta l ，1 9 8 7 ) 。 1 1 2 壳聚糖的物理性质 壳聚糖是白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体，不溶于水和碱溶液，可 溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和醋酸等大多数有机酸，不溶于稀的硫酸、磷酸。在 稀酸中，壳聚糖的主链也会缓慢水解，溶液的粘度逐渐降低，所以壳聚糖溶液一般 是随配随用。n 一脱乙酰度和粘度( 平均相对分子质量) 是壳聚糖的两项主要性能 指标。通常粘度在1 0 0 0 x1 0 - 3 p a s 以上的( 1 的壳聚糖乙酸溶液) 被定为高粘度壳 聚糖，( 1 0 0 0 1 0 0 ) 1 0 3 p a - s 的被定为中粘度壳聚糖，1 0 0 1 0 一p a s 以下的被定 为低粘度壳聚糖。国外将大于1 0 0 0 l o - 3 p a s 的定为高粘度壳聚糖，( 2 0 0 1 0 0 ) 1 0 3 p a s 的被定为中粘度壳聚糖，( 5 0 2 5 ) xl o - 3 p a s 以下的被定为低粘度壳聚糖 ( 倪红等，2 0 0 0 ) 。壳聚糖有很好的吸附性、成膜性和通透性、成纤性、吸湿性和 保湿性。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 1 2 壳低聚糖的性质与用途 1 2 1 壳低聚糖的性质 壳低聚糖是2 1 0 个氨基葡萄糖以b 一1 ，4 糖苷键连接而成的低聚糖，与壳聚 糖大分子相比，低聚水溶性壳聚糖具有独特、优越的生理特性。 ( 1 ) 水溶性 壳聚糖是含氮多糖类天然生物活性物质，在其大分子链结构中含有大量的一 n h 2 一o h 基团。当壳聚糖降解时，其均分子量降低，壳聚糖分子内的氢键作用随 之减弱，使壳聚糖分子在溶液中具有更大的扩展趋势，从而引起壳聚糖分子构象发 生一定的变化。而链长度的缩短和分子构象的变化使得壳聚糖在水溶液中的无序程 度增加，从而使其水溶性能大为改善。 ( 2 ) 吸湿性和保湿性 低聚壳聚糖分子中大量的一n h 2 和一o h 强极性基团的存在，不仅使低聚壳聚 糖的溶性大为改观，也使其具有良好的吸湿保湿功能。研究表明均分子量一定的低 聚壳聚糖具有优于甘油和透明质酸的吸湿保湿功能，且在一定的分子量范围内，随 均分子量的降低，保湿增湿性能逐渐增强( 柴平海等，1 9 9 9 ) 。随着低聚糖分子量 的增加，吸湿率不断减小。分子量为1 5 0 0 时具有最大值，即吸湿和保湿能力最大： 当分子量上升到3 0 0 0 时，吸湿和保温能力基本不变；当分子量为5 0 0 时，各项指标 仅为分子量3 0 0 0 时的一半( 刘楠等，2 0 0 5 ) 。 ( 3 ) 抗菌抑菌作用 l i u 测定了分子质量从5 0 0 0 1 0 8 x1 0 6 的7 种壳聚糖的抑制大肠杆菌的能力， 认为当壳聚糖的分子质量在5 0 0 0 9 1 6 1 0 4 时，其抑菌能力是随分子质量的增加 而增加的；当壳聚糖的分子质量在9 1 6 x1 0 4 1 0 8 x1 0 6 时，其抑菌能力是随分子质 量的增加而下降的( 刘楠等，2 0 0 5 ) 。郑连英等( 2 0 0 0 ) 考察了不同分子量壳聚糖 对金黄色葡萄球菌的抗菌抑菌性能，初步找出了壳聚糖分子量和浓度对抗菌抑菌作 用的影响，提出了壳聚糖的抗菌机理。研究发现：分子量在3 0 万以下时，壳聚糖对 金黄色葡萄球菌的抗菌作用随分子量减小而逐渐减弱：这些实验说明壳聚糖的抑菌 效果是受到其分子质量影响的，而且因为其针对的菌种的特性不同影响效果也不 同。 ( 4 ) 降低胆固醇 壳低聚糖具有吸收胆汁酸和促使胆汁酸排出体外的作用，小肠内胆汁酸的减少 促使肝内胆固醇向胆汁酸转化从而降低肝脏中胆固醇的含量。也可与脂肪，脂肪酸、 胆固醇等脂类物质结合成络和物，产物具有很强的疏水性，不被胃酸水解，不被消 化系统吸收，而随粪便排出。s u g a n o 报告壳聚糖分子量在2 0 0 0 以上有降血脂作用， 分子量为5 0 0 0 时降胆固醇能力很强( s u g a n oe ta 1 1 9 8 8 ) 。 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 1 2 2 低分子量壳聚糖的应用 ( 1 ) 壳低聚糖在食品工业的应用 壳低聚糖具有非常爽口的甜味，与脱乙酰氨基葡萄糖相比，随着聚合度的增大， 其甜昧、吸湿性、溶解度降低，可作为食品添加剂，用于食品结构的改善，提高食 品的保水性及水分活性的调节等。 壳低聚耱由于具有增强人体免疫能力、降低胆固醇、抗肿瘤和溃疡等生理活性， 可用于保健食品的生产。在日本已出现了多种用壳低聚糖制成的保健品，如卡尼期 泰，主要成分是壳低聚糖、壳聚糖有机铁和红花油，具有降低血脂的保健功能。 利用壳低聚糖具有抗菌和抑菌的作用，还可将其用于食品保鲜剂，有望成为一 种新型的“绿色”食品防腐剂，而得到推广应用。壳低聚糖己用于水果保鲜，如苹 果保鲜5 个月，好果率达9 8 ，而对照组的好果率仅5 0 。杨继生等( 1 9 9 8 ) 在 酱油中添加0 1 的壳低聚糖，在夏季敞开条件下，酱油存放3 0 天无白花变质，且 不影响其口感、颜色、体态、香味与成份。 ( 2 ) 低聚壳聚糖在生物医药方面的应用 低聚壳聚糖在生物医药方面的重要用途之一是利用低聚壳聚糖的抑制肿瘤的 作用来制取抗癌药剂，低聚壳聚糖特别是低聚6 8 糖可通过活化人体中的淋巴细 胞，抑制癌细胞的繁殖和扩散来达到抗癌抑癌作用( 吕中明，2 0 0 1 ) 。 癌细胞的形成伴随大量的癌毒素的释放。癌毒素会降低人体血清中的铁质，使 人贫血，食欲减退，而低聚壳聚糖在人体肠内形成的小分子基团会很容易被肠吸收， 从而抑制癌毒素在人体内的释放：同时，壳聚糖作为一种良好的聚电解质，能很好地 吸附在血管壁细胞的表面，从而可抑制癌细胞的转移。另外低聚壳聚糖可有效地活 化人体淋巴细胞。增强人体抵抗病菌的能力。人体中的淋巴细胞具有分辨正常细胞， 杀死病菌细胞的效能，从而使人具有免疫力( 应自忠，2 0 0 0 ；王芳宇，2 0 0 1 ) 。淋 巴细胞的生理活性与周围环境的p h 值有很大关系，以p h 值稍显碱性为最佳。通 常癌细胞的周围为酸性，而低聚壳聚糖上的氨基碱性基团可适当调节体内的p h 值， 并通过这种调节作用改变机体处于病态时的生物化学平衡，加强淋巴细胞的生理活 性，从而对癌细胞的繁殖进行抑制。 采用适当的降解方法将壳聚糖降解为低聚产品，分离制备以壳聚糖低聚6 8 糖为主的抗癌口服药剂及注射针剂等是很有应用价值的一项研究工作，如能尽快实 现经济规模工业化生产，将是广大癌症患者的福音。 低聚壳聚糖保持了壳聚糖大分子所具有的其他功能性质，包括降胆固醇，降血 压，防治糖尿病，强化肝脏机能( 吕朋，2 0 0 1 ) ，治疗烧烫伤( 蒋莉，2 0 0 1 ) 等等。 ( 3 ) 低聚壳聚糖在化妆品方面的应用 低聚壳聚糖在化妆品方面的应用主要是利用其优良的保湿增湿性能。低聚壳聚 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 糖本身具有成膜功能，又具有良好的透气性能，是一种强的吸湿与保湿剂，与传统 的保湿增湿剂相比，低聚壳聚糖的保湿增湿性效果更佳，在洗面奶及各类膏霜中的 使用更显其优越性。护肤化妆品最重要的性能之一是调湿作用，即化妆品的保湿增 湿作用，通常护肤品的有效性就是依据其调湿能力而言的。在护肤化妆品中添加一 定量的低聚壳聚糖，既可以防止化妆品配方中水分的逸失，又可以对表皮水分进行 水合，从而起到保湿增湿作用。而且，低聚壳聚糖良好的透气性又不干扰表皮对废 物和毒素的排泄，不会造成皮肤粉刺。如含有适量低聚壳聚糖的面膜弹性好，对皮 肤有明显的滋润剂保护作用。其他添加低聚壳聚糖的护肤产品也有易被皮肤吸收， 促进血液循环的作用。 ( 4 ) 低聚壳聚糖在农业方面的应用 低聚壳聚糖对植物病害有防治作用，其机理是：诱导植物产生广谱抗菌性，增强 植物自身的防卫能力，抑制多种病源微生物的生长( 何静，2 0 0 1 ) 。同时低聚壳聚 糖本身还对植物病原微生物有直接的抑制作用( 马鹏鹏，2 0 0 1 ) 。研究发现，壳聚 糖对大多数真菌都有一定的抑制作用( 王万泉，1 9 9 7 ) ，可作为食品保鲜剂( 王万 泉，1 9 9 7 ) 。低聚壳聚糖还可以作为新型植物生长调节剂。它可以促进植物生长， 提高种子发芽率，提高产量和抗病性( a g u l l oe 1 9 9 8 ) 。 1 3 壳低聚糖的生产方法 近年来，由于低聚水溶性壳聚糖具有良好的功能性质与广泛的应用价值，使得 低聚水溶性壳聚糖的研究已引起各国学者的关注。目前壳低聚糖的生产方法主要是 通过壳聚糖降解获得，壳聚糖的降解方法又主要有化学降解法、物理降解法与酶法 降解。 1 3 1 壳聚糖化学降解法 化学降解法主要有n a n o 。降解法、酸降解法、氧化降解法。 ( 1 ) n a n 0 2 降解法 n a n o - , 降解法是传统的化学降解法。降解产物分子量可通过改变n a n o 2 ，加入 量和应肘间来控制。国内常用此法降解壳聚糖并提取产物中的单糖组分。此法的主 要缺点是产品分子量分布宽，均一性差，降解中破坏了氨基，而壳聚糖良好的生物 相容性是由氨基提供的。另外，生产过程中三废污染严重。 ( 2 ) 酸降解法 酸解法是研究较早的壳聚糖降解方法，早在5 0 年代就有研究报道。壳聚糖在酸 性溶液中是不稳定的，会发生长链的部分水解，即糖苷键的断裂，形成许多相对分 子质量大小不一的片断，严重水解则变成单糖。酸水解法是制备单糖和一系列相应 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 低聚壳聚糖的主要途径之一。这种方法简便易行，但产品分子量分布宽，不好控制， 主要得到的是单糖，其次是双糖，很难得到所需的活性低聚壳聚糖，同时产物分离 提纯成本高，污染严重。 ( 3 ) 氧化降解法 氧化降解法以过氧化氢氧化法为代表，壳聚糖在氧化剂存在下可以进行氧化降 解。h 2 0 2 是很强的氧化剂，在酸、碱条件下都可以使壳聚塘分子结构中的b ( 1 , 4 ) 糖苷键发生氧化断裂。h 2 0 2 氧化降解中，较高的反应温度与h 2 0 2 浓度有利于降低 产物的分子量，但工艺条件较难掌握，反应稳定性与重复性较差。研究表明，在6 0 7 0 ( 2h 2 0 2 浓度1 0 5 0 9 l 条件下重复性好，产品质量高。 1 3 2 壳聚糖的物理降解法 微波、超声波、7 射线等方式处理也可以降解壳聚糖。微波降鳃壳聚糖可以使 甲壳素脱乙酰化反应与壳聚糖中糖苷键断裂同时进行，这样可以减少生产成本，缩 短生产周期。用超声波降解壳聚糖( 张峰等，2 0 0 4 ；黄永春等，2 0 0 6 ) ，反应温和， 可以在低温下进行，且在降解壳聚糖的过程中，不会发生氨基的缔合反应。丫射线 辐射是一种制备低分子量壳聚糖的有效方法。但这些方法也有一定的局限，如：微 波降解过程中容易发生交联反应；超声波降解虽取得了较好的结果，但要在很稀的 溶液状态下进行；y 射线辐射也容易引起一些交联和岐化反应。 1 3 3 壳聚糖的酶法降解 酶法降解壳聚糖，就是用特定的酶对壳聚糖进行降解，它可以选择性地切断壳 聚糖分子中的o 一1 4 糖营键，从而制得特定的低分子量壳聚糖，克服了化学降解产 品分子量分布宽、均一性差的缺点，产品均一性好。与其它降解方法相比，酶降解 法不发生副反应，反应条件温和，工艺较易控制，是一种较为理想的降解方法。 酶降解法可分为专一性酶降解法和非专一性酶降解法。 1 3 3 1 专一性酶降解法 几丁质酶与壳聚糖酶作为两种新近发现的酶，都能水解壳聚糖，是水解壳聚糖 的专一性水解酶。随着壳聚糖酶法水解的深入研究，几丁质酶与壳聚糖酶受到了广 泛的关注。 ( 1 ) 几丁质酶 1 9 2 1 年f o l p m e r s 首次从细菌和放线菌中获得水溶性几丁质酶以来，人们继从 多种微生物、动物及植物中分离到几丁质酶。1 9 8 4 年国际酶学命名会议上，几丁质 酶( c h i t i n a s e ，e c 3 2 1 1 4 ) 被系统命名。几丁质酶( c h i t i n a s e ，e c 3 2 1 1 4 ) 是能够催化水 解n 乙酰一d 一葡萄糖胺糖苷键的酶。它的作用底物为胶态几丁质，但胶态几丁 7 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 质制备方法繁琐，将壳聚糖作为几丁质酶的可溶性底物，m a s a r u m i t s u t o m 等人发现 几乎所有微生物产生的几丁质酶都能水解部分乙酰化的壳聚糖。如棉花黄萎病菌、 金龟子绿僵菌和粘质沙雷氏杆菌等产生的几丁质酶都能水解脱乙酰几丁质( 李君 等，2 0 0 1 ) 。 微生物几丁质酶与其它来源的几丁质酶一样，也可分为外切几丁质酶和内切 几丁质酶，内切几丁质酶的水解产物是几丁寡糖和几丁二糖，而且酶与底物的亲和 力随底物聚合度的提高而增大。外切酶是从链的非还原性末端依次切下单糖( 韩宝 芹等，2 0 0 1 ) 。微生物可产生胞内和胞外几丁质酶，其中大部分微生物能产生胞外 酶，是目前研究和应用较多的几丁质酶。微生物几丁质酶通常在p i - 1 3 9 范围内较 稳定，而当p h 4 7 ，温度在4 0 5 0 时酶活性最高。它们在分子量上差异很大， 从2 1 6 9 k d a 不等( 蓝海燕和陈正华，1 9 9 8 ) 。 ( 2 ) 壳聚糖酶 1 9 7 3 年m o n a g h a n 等首次报道了壳聚糖酶是一种不同于几丁质酶的新酶，这 种酶对胶态几丁质不水解，但是能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖。1 9 9 2 年壳聚糖酶 ( c h i t o s a n a s c , e c 3 2 1 9 9 ) 也被系统命名。 壳聚糖酶( e c 3 2 1 9 9 ) 以内切作用方式催化水解壳聚糖中氨基葡萄糖苷键，生 成聚合度为2 8 的低聚糖聚合物。与几丁质酶区别在于，壳聚糖酶的底物不同， 仅能作用于几丁质脱乙酰化后的产物。对从各种微生物和植物中分离出的几种壳聚 糖酶的鉴定表明不同来源的壳聚糖酶的氨基酸排列顺序和分子质量差别很大，从植 物中分离得到的壳聚糖酶分子质量范围约为1 0 2 1 k d ，而从微生物中分离得到的 壳聚糖酶分子质量范围则为2 0 4 0 k d ，它们的最适p h 值为4 o 6 8 。 多数微生物来源的壳聚糖酶是胞外诱导酶，但也有组成酶。壳聚糖酶可以催化 降解完全脱乙酰的几丁质和部分脱乙酰的几丁质，却不能催化降解完全没有脱乙酰 的几丁质。不同来源的壳聚糖酶的底物专一性不一样。可根据专一性的差异，将壳 聚糖酶分为三类。第一类是可以水解g l c n a c - g i c n 和g i c n - g l c n 糖苷键的壳聚 糖酶；第二类是只能水解g l c n - g l c n 糖苷键的壳聚糖酶；第三类是既能水解 g i c n g i c n 糖苷键，又能水解g i c n a c - g i c n 糖苷键的壳聚糖酶( m a n s s u ie ta 1 ， 1 9 9 4 ) 。壳聚糖酶催化水解壳聚糖至少需要一个g l c n 基团的糖苷键。不同来源的 壳聚糖酶对底物的脱乙酰要求也不一样。壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖时，得到 的寡糖不仅与壳聚糖的乙酰化度有密切关系，而且与壳聚糖酶本身的性质有关系。 对于只切断g l c n g l c n 糖苷键的壳聚糖酶，壳聚糖的乙酰化度高，可以得到较高 聚合度的壳寡糖，但是水解速率慢，乙酰化度低，容易得到聚合度非常小的寡糖 ( d a v i de ta 1 ，1 9 9 2 ) 。有研究利用计算机程序分析壳聚糖酶和几丁质酶、溶菌酶、 己糖酶的氨基酸序列，没有发现任何同源性，因此壳聚糖酶可能形成了糖苷水解酶 8 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 的新酶族，它与降解壳聚糖的其它酶完全不同。 1 3 3 2 非专一性酶降解法 非专一性酶中研究得最多的是纤维素酶，除纤维素酶外，木瓜蛋白酶、，菠萝 蛋白酶、疏基蛋白酶及酸性胃蛋白酶的水解作用亦相当显著，其反应溶液粘度可下 降9 6 ( d a v i de ta 1 ，1 9 9 2 ：m a n s s u ic ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 目前己发现有近3 7 种水解酶，如蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶等对壳聚糖都有降 解效果( m u z z a r e u ie ta 1 ，1 9 9 4 ；p a n t a l e o n ec ta 1 ，1 9 9 2 ) 。从这此酶结构上看不存在 共同的催化基团，其具体的作用机制尚不清楚，但它们的降解反应存在几个共同特 点：水解最适p i - i 值为3 0 5 0 ：水解初期以内切酶作用为主，溶液粘度迅速下降：n 一乙酰化度对其活性有影响，随着脱乙酰化程度的提高，酶的水解活性增强：无论是 提高酶的质量分数还是底物的质量分数都可以提高反应速度，故反应速度较快，是 一条生产寡糖的较好途径( 王扬等，2 0 0 1 ) 。 m u r a k i e 等曾利用t r i c h o d e r m a v i r i d e 中的纤维素酶，在5 0 ，p h 值为5 6 的 条件下获得聚合度为6 8 的壳寡糖。纪莹等用复合纤维素酶水解溶于h c i 溶液中 壳聚糖，p h 5 0 ，5 0 水浴酶解4 8 h 调p h 至中性，8 0 0 0 r r a i n 离心1 0 m i n ，上清液 加二倍体积的无水乙醇，8 0 0 0 r r a i n 离心1 0 m i n ，取沉淀溶于适量去离子水中，冷冻 干燥即为壳寡糖的粗提物，用柱色谱分离纯化，h p l c ：分析得该产物的主要成分为 聚合度6 7 的壳寡糖。 若将非专一性水解酶按比例配合，利用酶之间水解作用的协同或互补效应，可 进一步提高对壳聚糖的水解程度。 杜星光等以壳聚糖为原料研究了酶法降解制备壳寡糖的方法，通过对专一性和 非专一性降解用酶的筛选，确定以壳聚糖酶或6 0 3 6 酶为降解酶，探索了球孢白僵 菌发酵酶液代替6 0 3 6 酶粉的可能性，考察了底物浓度、酶量、温度、p h ，溶解介 质等因素对降解反应的影响，探讨了提高和控制壳寡糖聚合度的方法，在此基础上 进行了扩大试验，确认了该过程实现工业化生产的可行性。 2 2 a a n ghd 等研究了复合酶降解法制备壳寡糖的方法，发现用纤维素酶、a 一 淀粉酶和蛋白酶复合降解与膜分离藕合使用，可将脱乙酰度为2 4 壳聚糖降解为聚 合度为3 1 0 的壳寡糖。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 1 4 本课题的研究目的与意义 甲壳素在自然界中的储量非常丰富，年生成量约有1 0 0 亿吨，产量仅次于纤 维素，是迄今为止发现的唯一天然碱性多糖。以虾和蟹壳为原料制得的壳聚糖的 分子量很大，通常在几十万甚至上百万。由于分子内外氢键的作用，其化学性质 稳定，溶解性差，只能溶于少数的稀酸溶液中而不能直接溶于水，所以在很大程度 上限制了它的应用。低聚糖能直接溶于水，且具有优于壳聚糖大分子的功能性质， 低聚壳聚糖在医药，保健食品和化妆品以及工业上有着广泛的应用前景。壳低聚糖 目前在国内外已经用于食品、化妆品当中，在医药方面也显示出良好的前景。寻找 能够规模生产具有生物活性壳低聚糖的方法和途径是目前甲壳素研究的热点，其中 具有生物活性的五一九个单体聚合物，特别是六糖和七糖在抑制肿瘤方面的作用引 起了广泛关注和研究开发热潮。 资料显示，以往研究多用单一酶直接降解壳聚糖，或是用复合酶直接同步降解 壳聚糖，本实验选择两种分别具有良好降解壳聚糖能力的纤维素酶和甘露聚糖酶， 研究它们交替降解胶体壳聚糖的效果，试图找到一种较为有效的酶解获得低分子量 壳聚糖( 1 0 0 0 0 k d a 以下) 的方法。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 2 实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 里氏木霉( n 翻哦蛔敝r e e s e i ) ，华中农业大学发酵工程研究室保藏。 短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l i s ) ，华中农业大学发酵工程研究室保藏。 2 1 2 主要试剂与药品 粉状壳聚糖：脱乙酰i 9 0 ，国药集团生产。 魔芋精粉：武汉强森魔芋食品有限公司生产。 2 1 2 1 柠檬酸盐磷酸缓冲液( p h 4 8 ) 甲液o 1 m o l l 柠檬酸溶液：1 0 0 。| m i 含q 魄西h 2 02 1 0 1 9 乙液0 2 m o l l 磷酸氢二钠溶液：1 0 0 0 m l 含5 3 6 1 9n a 2 h p 0 4 7 h 2 0 按甲液2 5 2m l 、乙液2 4 8 m l l 比例混合后调节p h 值为4 。8 。 2 1 2 21 的c m c 溶液 取l g c m c ，加k p h 4 8 的柠檬酸盐一磷酸缓冲液混合，水浴加热至完全溶解。 此溶液在4 1 2 冰箱储存，有效期3 天。 2 1 2 3d n s 试剂 a 液：取魄结晶酚于1 5 2 m l 2 8 m o l l n a o h 中，稀释至6 知儿再加6 9n a h s 0 3 。 b 液：将2 5 5 9 酒石酸甲钠加到3 0 0 m 1 _ 2 8 m o l l n a o h 中，再加入8 8 0 m l l o g l 3 , 5 二硝基水杨酸溶液。 将a 、b 混合，贮存在棕色瓶中，室温放置7 1 0 天后备用。 2 1 2 40 5 刚果红溶液 0 5 9 刚果红溶于l o o m l 麓水，过滤后备用。 2 1 2 50 1 9 l 标准葡萄糖溶液 称取在1 0 5 干燥2 h 的分析纯葡萄糖1 9 ，加水溶解，稀释定容至l o o m l 2 1 2 6 壳聚糖胶体溶液 3 9 壳聚糖，加入7 5m l 的1 醋酸溶液，8 5 c 水浴1 0 h 至完全溶解，再用1 醋酸定溶至1 0 0 m l ，4 冷藏。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 2 1 2 7 葡聚糖分子量标样 d e x t r a n t - 1 0 ，m w ( 分子量) = 1 0 0 0 0 ；d c x t r a n t - 4 0 ，m w - - 4 0 0 0 0 ；d e x t r a nt _ 7 0 ， m w = 7 0 0 0 0 ；d e x t r a nt - 5 0 0 ，m w = 5 0 0 0 0 0 ：由p h a r m a c i a 公司提供。 2 1 3 培养基 2 1 3 1刚果红麦芽汁c m c 培养基 m a l te x t r a c t ( b d2 1 8 6 3 0 ) 3 0 m l a g 缸b a c t o ( b d2 1 4 0 5 0 ) 1 5 9 c m c - n a 5 9 蒸馏水1 l p h 5 5 左右 1 2 1 3 23 0 m i n 灭菌后，趁热按2 m l 果红溶液1 0 0 m l 培养基加入0 5 的刚果红。 2 1 3 2c m c - - 土豆培养基 去皮土豆2 0 0 ，切碎，沸水煮3 0 m i n , 过滤；然后加羧甲基纤维素2 0 9 琼脂2 ， 添加水至1 0 0 0 r a l p h 自然 2 1 3 3 产纤维素酶固体发酵培养基 稻草6 0 9 麸皮4 0 9 k h 2 p 0 40 0 5 9c a c l 20 0 5 9 m g s 0 40 2 5 9 ( n h 4 h s 0 41 8 9 n a c io 1 9 水物料= 1 ：2 21 吐温- 8 0 p h 自然 2 1 3 4 麸皮管保藏培养基 麸皮：水= 1 ：l 2 1 3 5 产甘露聚糖酶一级培养基： 胰蛋白胨1 0 吕，l酵母提取物5 e l 氯化钠5 9 i p h 7 4 加入2 魔芋精粉 。灭菌。 2 1 3 6 产甘露聚糖酶发酵培养基 胰蛋白胨加g l 酵母提取物5 9 l 氯化钠5 c a , p h 7 4 加入8 诱导物灭菌。 诱导物制备：在1 3 魔芋溶液中加入2 的一级发酵液，4 6 水解1 h 。用无水 乙醇将其沉淀，干燥。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 2 1 4 主要实验设备 7 5 2 型分光光度计 电热恒温培养箱 精密p h 计 电子分析天平 恒温磁力搅拌器 紫外线辐射源 h h - 4 数显恒温水浴锅 旋转蒸发仪 超声波破碎仪 乌式粘度计 平提式不锈钢蒸汽消毒器 b s 1 0 0 a 自动部分收集器 c r 2 1 g 型高速冷冻离心机 管式离心机 上海第三分析仪器厂 上海索浦仪器有限公司 上海罗素科技有限公司 上海垒固仪器有限公司 金坛富华仪器有限公司 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司 上海亚荣生化仪器厂 宁波海曙金达超声波设备有限公司 成都科析仪器成套有限公司 北京天来生物医学科技有限公司 上海东风五金厂 h r r a c h l 日本日立公司 上海浦东天本离心机械有限公司 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 2 2 实验方法 2 2 1 壳聚糖特性粘度的测定 采用乌氏粘度法测定样品的特性粘度( 唐振兴等，2 0 0 4 ) 。 把壳聚糖样品干燥恒重，精确称取1 1 2 9 ( 称量精度 0 0 0 5 9 ) 。用o 1 m 乙酸0 2 m 氯化钠溶剂配成5 0 m l 样品溶液， 此样品浓度为c 1 ，此溶液经3 号砂芯漏斗过滤，精密量取中 间部分滤液1 0 m l ，移入乌式粘度计侧管( 粗管) 。将粘度计 垂直固定于恒温水浴保温1 0 m i n ，以上，使管内溶液的温度 与水浴温度达到平衡。在另外两根支管口各接一根乳胶管， 将侧管上面的乳胶管用夹子夹住，用吸球自中间乳胶管口 吸气，使样品溶液渐渐上升，直到深度线a 以上，此时先 放开夹子，再移走吸球，使样品溶液在毛细管内自然下落， 用秒表准确测量并记录溶液下降时通过刻度线a 和b 之 图2 1 乌式粘度计 n 醇1v i s c o s i t ym e t e r 间的时间( t 1 ) ，然后精确量取5 m l 溶剂小心加入到粘度计中，将样品溶液摇匀稀 释，此时的溶液浓度为q ，用同样的方法测定其流经刻度线a 和b 之间的时间( t 2 ) ， 再依次精确量取溶剂5 m l 和1 0 m l ，分别加入到粘度计中稀释，浓度分别为c 3 和 c 4 , 并分别测定t 3 和t 4 ，在测定样品溶液的粘度之前，要按上法先测定溶剂的粘度， 需用的溶剂为1 0 m l ，测得的时间为t 0 稀释后溶液的浓度分别为：c 2 = 2 3 x c lc 3 = 1 2 c lc 4 = 1 3 xc 1 对应于各浓度的相对粘度m r 】为；r l r l - - t d t o 1 1 r 2 = t 2 t o r l r 3 = t 3 t o q r 4 = t 4 t o 噌比粘度= 叩一1比浓粘度为_ n 。c 依次计算，得到4 个比浓粘度，并对浓度作图，可得到一条直线，将此直线外 推至与纵坐标相交与一点a ，此截距( a o ) 即为h 】，糊啊，k ，a ( 脱乙酰度选度 k 和a ) 代入n = k m 4 ，即可求得粘均相对分子质量。 2 2 2 产纤维素酶菌株的筛选 2 2 2 1 菌种的复壮 加l m l 无菌水于保存有木霉的冻干管中，稀释至1 0 - 5 ，涂布于c m c - 土豆培养 基上，3 0 培养，挑出透明圈较大的单菌落。接种于固体发酵培养基，3 0 培养4 天，测酶活力，挑选出优良菌株。 2 2 2 2 紫外线诱变育种 ( 1 ) 孢子悬液的制备 取复壮后的木霉接种于土豆斜面上，3 0 培养4 天后用1 0 m l 无菌生理盐水洗 1 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士论文 下，倒入1