生物分子的分离纯化与PCR技术.doc

生物分子的分离纯化聚合酶链反应一、 名解生物大分子: 生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。酚抽提法: 即SDS法。最初在1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。 凝胶过滤层析：凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应。多重PCR： 是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定。荧光域值: 一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR315个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。退火: 为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.它是影响PCR特异性的较重要因素。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。二、问答1、根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？答：根据作用原理生物分子的分离纯化可分为以下几种类型：根据分子极性大小和溶解度的不同进行分类，包括溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；根据分子形状和大小不同进行分类，包括凝胶过滤层析等；根据物质吸附性质不同进行分类，包括选择性吸附与吸附层析法等；根据分子带电性（电离性质）的差异进行分类，包括离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。根据配体特异性进行分类，包括亲和层析等。2、什么原因易引起DNA降解，该如何解决？答：引起DNA降解原因可能是：（1）材料不新鲜或反复冻融；（2）未很好抑制内源核酸酶的活性；(3)提取过程操作过于剧烈；(4)DNA被机械打断；(5)外源核酸酶污染；(6)反复冻。主要的解决办法包括：（1）尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；（2）液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液；（3）在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解 液中螯合剂的含量；（4）细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔；（5）所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌；（6）将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。3、 简述PCR技术的基本原理答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTPs为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA单链DNA，94。退火：引物单链DNA杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70左右， Taq DNA聚合酶以种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物3末端为起点的53DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。4、 简述PCR实验中常见的问题及其对策。答：(1) 假阳性：PCR产物是最主要的污染源。阳性对照的污染。标本之间的交叉污染。在采集标本时，其他污染源带来的污染。使用带有污染的试剂。预防措施：PCR前后工序分室操作，试剂器材分室存放；凡耐高温的试剂器材均高压灭菌；Tip头、Ep管等最好一次性使用；操作人员必须戴手套进行操作；试剂小量分装保存，用前先离心，防止开盖时液体溅出。(2) 假阴性：假阴性是PCR反应中另一个易出现的问题。造成的原因也比较多。可以归纳以下几方面原因。1)标本处理的原因： 处理标本时，靶DNA丢失。处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）。2)PCR试剂问题： 引物设计不合理。 Taq DNA聚合酶失活。 Mg2+浓度过低或是没有加。3)PCR扩增过程中的问题：PCR扩增仪故障。PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。 4) PCR产物鉴定中的问题： 电泳时没有加溴化乙锭。 电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。凝胶浓度过低，使扩增带跑散。(3) 引物二聚体形成引物二聚体的原因有：两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3端有互补区。 引物比例太高，可增加模板用量。 退火温度过低。热循环次数过多。(4) 非特异性PCR产物，造成非特异性PCR产物的常见原因及其预防措施： 引物特异性不高或用量太大，应更换引物或降低用量；Taq DNA聚合酶质量不好或用量太大，应更换酶或降低酶使用量； Mg2+浓度过高，可适当调整其浓度；退火温度过低，可提高退火温度；延伸时间过长，可减少延伸时间；热循环次数过多，应适当增加模板量，减少循环次数。5、简述实时荧光定量PCR定量的基本原理？答：实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。 （1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP