（生物化学与分子生物学专业论文）neuritin的组织表达分析及其相互作用因子的筛选.pdf

n e u ritin 的组织表达分析及其相互作用因子的筛选 姓镪 罗鬣 生物纯攀与分子生物学 指导教师 黄瑾教授杨磊教授 张万汪副教授潘泽民戮教授 摘要 n e w i t i n 是1 9 9 3 年以色列科学窳n e d i v i 等人 从大鼠海马齿状脑嬲c d n a 文库中 发现的一 静毒孛缝藿羲因子 磁究发现n e n r i t i n 蛋鑫笼程遴季孛经突莛l l 皇生 菠葜分支零唳霆蠡夔发育或熟 镳 箝突触网路的形成 在神经系统以及神经可塑性相关的区域 n e u r i t i n 表达水平较高 且神经活动 雨in t s 均能诱导其袭达 提示神经活动和n t s 促进神经突起生长的作用 可能与n e u r i t i n 的表达 有关 强豹 本鼍驿究警在避一步明确n e u r i t i n 蛋自秘缀织分布 噩缁藏定瘟 并寻找与之相互作稿的 蛋白 为深入探讨其功能及作用机制藻定理论基础 并为n e u r i t i n 在神经系统痰瘸防治的廊j 提 供理沧依据 方法 采 l 生穆倍患学手段 分摄n e u r i t i n 基鞭及蛋鑫弱甓瓣嚣 霹能戆功筢 藩进露了基瓣发 达串联分析 s e r i a la n n y s i so fg e n ee x p r e s s i o n s a g e 从人黉c d n a 文库中扩增出n e u r i t i n 的开放阅读框 用r t p c r 和免痰组织化学的方法对n e u r i t i n 进行组织表达谱分析 构建 p e g f p c 1 一n e u r i t i n 绿荧光蛋白n e u r i t i n 融台表达载体 结合免疫组织化学的方法对n e u r i t i n 进 行豫缨艇定藏 利潮g a l 4 酵母裂杂交系统 鞋n e u r i t i n 捧诱镡麸人貔薤c d n a 文露中 簿选与之期 互体辩j 的蛋白 结粜 1 削生物信息学手段较全捌的分析了n e u r i t i n 核酸及赞囱的结构和可能的功能 组织分 布 2 n e u r i t i n 组织裘达谱分析 k i t ep a n e l 和免疫组化分板结聚均显示 n e u r i t i n 蛋自在多种 a 髂菠嚣缀缓中表达 冤荬在藏缝织鞠经节鲴麓罨 粒 莲中毫痉表达t3 n e u r i t i n 籀g f p 麴鞋台簸 白 荧光定位为胞浆 与免疫组化缩果一致 即n e u r i t i n 蛋白可以在胞浆分布 但不排除膜蛋向 的可能 4 酵母双杂交实验 利用g a l 4 酵母双杂交系统 以n e u r i t i n 作诱饵从人胎脑c d n a 文席 中 筛选得到5 9 条与n e u r i t i n 蛋自有相互作用的缀彝质的基因 弗避 亍了初步分类和分析 结论 1 m t cp a n e l 组织表达谱实验 多组织免疫组亿结采以及s a g e 分辑均袋明 n e u r i t i n 蛋白除了脑组织高度淡达外 在人体心 肝 肺 小肠以及卵巢等多种正常组织也有表达 提示 n e u r i t i n 蛋自在成年划可能不仅仅在中枢神经系统发挥作用 2 通过绿荧光定位和免疫组化的结 爱诬窦 n e u r i t i n 甓囊为麓浆定位 健不撵除膜蛋蠢的可链 3 辩母政杂交结聚篾示 n e u r i t i n 分别与神经相关 与瓣瓣相关疆及与信号转导相关的蛋白厦有穗互忭瑚 提示 n e u r i t l n 鲎蠢可 能除了与神经可塑性有荚 还可能与细胞增殖以及肿瘤有关 关键词 n e u r i t i n 缀织表达分橱 弧细胞定能 酵母烈杂交 磷巍类壁 a 蘩磁研究 a n a l y s i so f n e u r i t i ne x p r e s s i o na n dt h e p r o t e i n si n t e r a c t i n gw i t hi t p o s t g r a d u a t e l u ox i n g b i o c h e m i s t r y a n dm o l e c u l a rb i o l o g y a d v i s o r p r o h u a n g j i n p r o y a n gl e i a s s o c i a t e p r o z h a n gw a n j i a n g a s s o c i a t e p r o p a nz e m i n a b s t r a c t n e u r i t i nw a sah o v e ln e u r o t r o p h i cf a c t o rw h i c hw a sd i s c o v e r e df r o mt h ea d u l tr a t h i p p o c a m p u sc d n al i b r a r yb yl s r a e ls c i e n t i s tn e d i v ij n 19 9 3 t b ee x p r e s s i o np r o d u c to f n e u r i t i nc a ne n h a n c et h ed e v e l o p m e n to fn e u r o na x o na r b o r sb yp r o m o t i n gs y n a p t o g e n e s l s a n db yi n c r e a s i n gt h ea d d i t i o no fn e wa x o nb r a n c h e s a n di t se x p r e s s i o nw a si n d u c e db y n e u r a ia c t i v i t vo rn e u r o t r o p h i n s w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h en e u r a la c t i v i t i e so rn e u r o t r o p h i n s f u n c t i o nw e r er e l a t e dt on e u r i t i n o b j e c t i v e t h ea i mo fp r o j e c ti st oi d e n t i f yt h et i s s u ee x p r e s s i o np r o f i l ea n di n t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no f n e u r i t i n a n dt of i n dp r o t e i n st h a ti n t e r a c tw i t hn e u r i t i nu s i n gy e a s tt w oh y b r i d s y s t e m w h i c hp r o v i d et h e o r e t i c a l b a s i sf o rf u r t h e rr e s e a r c ha b o u ti t sf u n c t i o na n d m e c h a n i s m m e t h o d n e u r i t i ns t r u c t u r ea n di t sp o t e n t i a lf u n c t i o na n ds e r i a la n a l y s i so fg e n e e x d r e s s i o n s a g e lw e r ea n a l y z e du s i n gb i o i n f o r m a t i o nt e c h n o l o g y n e u r i t i no r fw a s a m p l i f l e df r o mh u m a nc d n al i b r a r y a n dt h e nn e u r i t i ne x p r e s s i o np r o f i l ev c a ss h o w e dw i t h r 1 二p c ra n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r y i n t r a c e l l u l a r1 0 c a l i z a t i o no fn e u r i t i nw a si n f e r r e db y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n de u k a r y o ne x p r e s s i o nv e c t o rc o m b i n d e dw i t hg r e e nf l u o r e s c e n c e p r o t e i n p e g f p c l n e u r i t i n s c r e e n e dah u m a nf e t a lb r a i nc d n al i b r a r yw i t hn e u r i t i nc d n a a sb a i tu s i n gg a l 4y e a s tt w oh y b r i ds y s t e m r e s u l t s 1 1a n a l y s i so fn e u r i t i ns t r u c t u r e e x p r e s s i o np r o f i l ea n di t sp o t e u t i a lf u n c t i o n w i t hb i o i n f o r m a t i o nt e c h n o l o g y 2 n e u r i t i ne x p r e s s i o np r o f i l e m u l t i p l et i s s u r ec d n ap a n e l a n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys h o w e dt h a tn e u r i t i ne x p r e s s i o ni nah i g hi e v e ii nm a n yh u m a n n o r l t l a lt i s s u e s e s p e c i a l l yi ng a n g l i o nc e l lo fb r a i na n di i v e r 3 n e u r i t i ni n t r a c e l l u l a rl o c a t i o n t h er e s u l tf r o mg r e e nf l u o r e s c e n c ea s s a ys h o w e dn e u r i t i n1 0 c a t i o ni nc y t o p l a s m w h i c hw a s c o n s i s t e n tw i t hr e s u l to fi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 4 u s i n gy e a s tt w oh y b r i d s c r e e n e dah u m a n f e t a ib r a i nc d n a i i b r a r yw i t hn e u r i t i nc d n a a sb a i t a n df o u n dt h a tt h ep r o t e i n sc o d e db y5 9 g e n e sh a di n t e r a c t i o nw i t hn e u r i t i n k e yw a r d s n e u r i t i n t i s s u ee x p r e s s i o np r o f i l e i n t r a c e l l u l a rl o c a t i o n y e a s tt w oh y b r i d t y p eo ft h e s i s a b a s i sr e s e a r c h 前言 耱疑营蓦嚣予 k n e u r o t m p h i ct h e t o r s n t f s 蹙一类亵蛰经紧统孛表达 粪篷 东含潼港徽 荠撼焱襻羟笺筑姆瀑功嚣懿蘩镦藤 蘧蔷赣鹣耱经营莽麓予蓊不 断发现 人们对神缴篱养因子生物学作用的认澉也不断深入t 在发育过椒中 神 经营葵鼹予对神经缌鼹戆生长 势纯有重要佟爆 在戏年麟 搀经营莠鬣予霹缝 骜爨黧爨涟毒器爱燕滢皇遵凄煞搿 在饕曩蔟魏嚣 蘑爨嚣游蠢子霹藏盘瓣经元 酌懑焱 凋亡 并可促进神经瓣舷 因此 深入研究各种褙l 撼营养因子的幼能及 作用机制 并寻找搠极有效的遗辍 利用已知功能的神经谢嚣医子 对事串疑损伤 雾蛰爨蘩凌逗嚣瞧获瘸蘧嚣藜臻诊鞭 羹疗乃鬻基委法疗 邈富卡舅重要辩慧璺 运氇 整是斋餮秣学骞在撩经科学领域积裰舔激鹩热门谦懑 n e u r i t i n 魁1 9 9 3 年发王嫩的 种新的 申凝营养因子 它是以色刿料常家 n e d i 游太透过穆建昝羹e 酸娄儆黪海太藻酸 k 憝k a i n i ca c i d 激涎受大蕊海 骂蠢状麓霹c d n a 烹捧露嚣楚黼 1 9 9 6 年 n e d i v i 逶蔻巍诱霉蘩蒙大蔑辩霾囊 实验义得到该基因 辩将其命名为娜塑性相关假溉基因1 5i 州 c p g l 5 c a n d i d a t e p l a s t i c n y r e l a t e dg e n e1 5 1 9 9 7 年 n a e v e 也扶k a 激活墼大鼠淤舄棱犍 整妥 淤 文霉嚣 夫樊皮羹e d n a 文黪簿逢 婺窀褥蘩c 爱g 1 5 羚避蠡 了露参懿麓餐 研究 擞观c p g l 5 稔德迸粹羟突起 i 勺快速叠三筏 敝x 将其奇鹳为n e u r i t i n t 9 9 9 年和2 0 0 1 年 c o r r i v e a u 和n e d i v i 分别从猫和爪蟾克隆榭剐n e u r i t i n 2 0 0 1 年 黄爨等式酋次褒鼹爽筷久类除熬c d n a 文黪竟隆褥塑n e r i t i n 氍 我翻簌鬻瑟e 淤a 变薄孛竟鬻褥戮m e u r i t i n 基嚣 覆蕊丽垒长i 6 t 8 话弦 最 大o r f 为4 2 9b p 编码合1 4 2 个黼蒸酸残基的灏自 n e u r i 雌n 定位于人燎色体 6 p 2 5 t 傻含3 个乡 鼹予 与露张g e n b a n k 中泌d n a 秘蛋自给剐比较 没瓣发瑗 与餐瓣融疑銎叁囊煮鼹著蓑露枣粼藏藏滚鳇黪骥藩 冬纂粪 聂囊黎n 群 i t i 霹 丽源髋分剐为9 8 8 8 其有黼艨的保守褴预测完整的犬黼n e u r i t i n 黢达产 物两端备存在一段2 7 个a a 的面耗水区 通过 端糖基磷脚酰肌醇 g t y c o a y 赡o s p h a t i d y l i m o s i t o l g p d 臻瓮褒溪褰筵袭黉 1 9 9 7 年 k a e v e 罴黢镶杂臻诗 懿夫燹n e u r i t i n 裳邀产勃n 端t p i 蔫号菰 蒗n e u r i t i n 衷达劳瓣蝥译本 n e u r i t i n 作用于邻姗的神经元 假进神经突艘的快速生长撼其分支 调节突触 的发商艨热 捉进突揪回路款形成 学者与n a e v e 鼹点幂 鬟 蚀 认炎 露去蒜黠露癸爨丈蕊n e 潞i z i n 爨簌不囊 餐逶籁疑突霆嚣妻长察努支魏 n e u r i t i n 具有黼艇的保守性 搬示其在不闹物种神经系髋的发育过糕巾技挥 着至关煎器的作用 i n o r t h e r n 杂交分柝显示n e u r it i n 在敝牲育和成年嬲主要 在中掇捧瀑系凌表这 在莲爨美蛰鹣慕1 2 灭萋凌鬯漫鹫n s u r i t i n 翡表达 蘧蜃 v 随羲发育 冀表达量逐渐升高 分布范嘲电较为广泛 主要分稚予海马 皮矮 外膝体 三叉神经 舌咽神经和背根神经 肯等 而在出生后的新生期至成年期 n e u r i t i n 表达主要集中在与神经可魍性相关的区域 如海马 嗅球 蒲肯野氏 细胞等 1 1 1 1 2 1o 耪经活动在毒霉 经系绞豹发育 成熟以及损伤后兹露黛修复过程中发撂纂纛要 静调节终嗣1 1 3 l 焉n e u r i t i n 在享聿经系统的表达也受到葜调节作用 c o r r i v e a u 通过研究n e u r i t i n 在猫视觉系统发育成熟过程中的袭达变化 发现n e u r i t i n 受神经活动的调节分为两个阶段 在发育早期 n e u r i t i n 不受依赖n a 通道的动 作电位的神经电活动影响 而当发筒后期和成年期 n e u r i t i n 的表达则需爱依 赖n a 遴道教动份窀位熬圣孛经电活动调 萤n 1 2 0 0 2 年 n e d i v i 也发现n e u r i t i n 在大鼠享觅皮覆发育过程中翦表达先蕊经历了上述两个阶段 褫觉系统麓发育早期 即视神经节轴突投射到外膝体 l7 1 n e u r i t i n 主要高表达于外膝体 视皮质没有 检测到其表达 n e u rjt i n 在这一阶段不依赖神经活动的调节 而当发育到后期 即外膝体神经元轴突投射到视皮质 n e u r i tj n 开始在视皮质表达而在外膝体 数表达承平下黪 遮 时期也是视觉发育魏美挺时期并垮襁皮质功能柱的形成时 闽一羲 n e u r i t i n 逐澎莜赖诤经活动静调节 馥提示 对于璃鬟套麓懿裰滗系 统发育的关键时期直至成年f 旧捌 n e u r i t i n 需要神经活动的介入 其自身w 能 作为一个调节糟与突触前的其它成分相互作用共同调节突触后的树突 促进突触 的发育 成熟刚 n a e v e 通过离 零实验发现成年大躐的海马稻皮质中n e u r i t i n 的表达受到辛f l 经活动帮n t s 瑟联 不同途径静诿节 使滔t r k b 受钵懿鼗l 铡懿k 2 5 2 a 只麓疆鞭b d n f 对n e u r i t i n 的诱导f 2 丑 不影响k c l 对n e u r i t i n 的诱导 而使用钙调蚕囱依赖 性蛋白激酶i i 的抑制剂k n 一6 2 则k c l 对n e u rj t jn 的诱导被阻断 但不影响b d n f 对n e u r t i n 的诱导 故推测 n e u r jt 可能是神经活动和n t s 共同作用的下游 遴子 23 1 壤夔稳稠亡瓣乎褥对享枣翌系绞瓣发育煮至关重要鹃馋羯 蒸瑟翦调节蘩麓 孛 经元凋亡的分子却知之甚少 n e d i v i 最新研究表明 n e u r i t i n 有g p i 锚定型秘 分泌型两种形式 在胚胎鼠脑经历快速增殖和凋亡区域裘达的分泌型n e u r i t i n 可通过抑制c a s p a s e 3 的活化保护皮质细胞免受凋亡 4 i 通过s i r n a 干扰实验证 明n e u r i t i n 对体内外皮层藕体细胞勰 莩活都至关重要 体内n e u r i t i n 的过慧表 达可逶遭簿翻谶亡扩大皮墨蓠诲缁魏涎 导致一令爻大 簧集中嚣受层蠹 强挖 在哺乳动物胚胎莳脑形态发生过程中 某些特异成神缀元细胞的亚克隆中农达的 n e u r i t i n 可通过抑制稠亡来平衡神经冗的数目 并馓终影响脑的大 1 s u 形状 f 2 5 2 叭 细胞表面的黏附分子不仅对细胞间的相互作用至关重要 而且也是撩定细胞 类型和分化阶段的波面标志 最近 日本研究人员发现肝寅质细胞有n e u r i t i n 鲍表达 并陵露i 镶定形式定位予缀箍懿表嚣 著置夔羞 l 手豹发弯遗程 n e u r i t i n 的表达有上升趋势 在出生后到成年阶段达最大值 另外 当肝脏受损伤后 静 止的肝实质细胞进入细胞周期 溉时n e u r i t i n 的表达有短期的下调 与肝酶的 表达襁乎行日 这然结果显示 n e u r i t i n 不仅是鉴定翳绥簸类型的一个非常舂 雳的表面标恚 i 掰艇也与蒡手细魏的分化成熟 以及再生有关 卡波氏肉瘤相关病毒 k a p o s i ss a r c o m a a s s o c i a t e dh e r p e s v i r u s k s h v 又称人8 型瘪疹病毒 h u m a nh e r p e s v i r u s8 h h v 8 涉及淋融浸澜性 疾痪褰卡波氏瘸癌豹发生 它黢傣多 转纯8 鬃照稻蠹疫缀藏舞霾黪两梭影改交 并伴随细胞转录表达的明显改变 1 2 0 0 5 年 a s h l e ev m o s e s 等人用基因芯 片筛出了几十条在k s h v 相关的卡波氏肉瘤中袭达上调的基因 其中包括c k i t r d c i 褰n e u r i t i n 逶过s i r n a 予拢实验 正实 已翘豹细聪薅薹毽e kjt 在k s h v 诱导的微血管内瘦绷胞 d e r m a lm i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a le e l l s d m v e c 的转化中起重要作用 最近 他们又以同样的方法检测r d c l 和n e u r i t i n 发现 用s i r n a 直接作用予r d c l n e u r i t i n 同样可以抑制i i s h v 对微血管内皮细骢的转 位 辫辩 转染n e u r i t i n 翡n i h 3 t 3 缨魏鑫鬻澎态鹣改变幂羹突起豹自主醺黛长 然而转染 r d c l 的n i h3 t 3 细腆却出现显著的增殖 这就意味着以前观察到的 n e u r i t i n 调节细胞形态的功能在非神经细胞中也适用 而熙 这两种n i h 3 t 3 缎魅均缝在骠氯中澎或瓣癌 这一凌豢表骥癌缨蕤中n e u r i t i n 愆遭瘦淡这可弓l 起肿瘤发生过程中细胞形态学的改变 并通过某种未知的途径促进肿瘤的形成 n e u r i t i n 作为神经活动和n t s 发挥作用的共同下游因予 初步功能研究表明 能促遴圣孛经突起的快速生长 分支和突触的发生 同时具有摊毒峥 经元调亡的作 用 敬在神经再生领域中具有氛好戆应用前豢1 3 2 3 3 1 近来骈究显示n e u r i t i n 还 可能涉及肿瘤等其它领域口4 1 本研究旨在进一步明确n e u r i t i n 蛋白的组织分布 亚细胞定位 并寻找与之相互作用的蛋白 为深入探讨其功能及作用机制奠定理 论鏊蓐窭 黉为n e u r i t i n 杰享孛经系绞疾病跨治煞应爱提袋璎浚菝据 英文缩略词 a a a m i n oa c i d 氨基酸 残基 b l a s t b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o 同源性检索工具 b p b a s ep a i r d n a 碱基对 e s t e x p r e s s e ds e q u e n c et a g 表达序列标签 h u g o h u m a ng e n o m eo r g a n i z a t i o n 人类基因组组织 m t c p a n e l m u l t i p l et i s s u ec d n a p a n e l 多组织c d n a 板 m w m o l e c u l a rw e i g h t 分子量 o r f o p e nr e a d i n gf l a m e 开放阅读框 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p b s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 多聚酶链式反应 r t p c r r e v e r s et r a n s c r i p tp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 逆转录p c r s a g e s e r i a l a n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n 基因表达串行分析 帅 a m p i e i l l i n 氨苄青霉素 印n f b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r 脑源性神经营养因子 n r 一3 n e u r o t r o p h i n 一3 神经营养素 3 n r4 5 n e u r o t r o p h i n 一4 5 神经营养素 4 5 c p g 1 5 c a n d i d a t ep l a s t i c i t y r e l a t e dg e n e1 5 可塑性相关候选基因1 5 g p i 9 1 y c o s y l p h s p h a t i d y l i n o s i t o l 糖基磷脂酰肌醇 i f r 6 i s o p r o p y l t h i o 一0 一d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代b d 半乳糖苷 i a k a i n i ca c i d 海人藻酸 k a n k a n a m y c i n 卡那霉素 n o r n e r v eg r o w t hf a c t o r 神经生长因子 n r s n e u r o t r o p h i n s 神经营养素家族 r e r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e 限制性核酸内切酶 s o s s o d i u md o d e c y ts u l f a t e 十二烷基硫酸钠 学位论文独创性声明 本人囊呈突终学位论文是在我譬萍舔指导下避行戆壤宠王作及塞褥麓磺究残募 据我所知 滁文中已经注明引用的内容外 本论文不包含其他个人已经发表线撰写 过的研究成果 对本文的研究做出蘑要贡献的个人和集体 均已在文中作7 明确的说 鹾莠轰示遴意 研究出签名 零邂 时间 护矿f 年 上月彩日 学位论文版权授权书 本人完垒了解磊河予大学毒关保磐 使用学幢论文薛怒定 学校有权保馨学位论 文并商国家主管部门或指定机构送交论文的电子鞭和纸癀版 有权将学位论文弼予赢 利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被套阑 有权将学位论文的内容端入有 关数据进行检索 凑敏将学位论文的标题和摘要汇编舨 保密酶学位论文在解密屠适 用本规定 研究生签名 罗隆 搬签名 蔫莲 时间 w 吖一年 乙月杉日 醣阗 弦 车f z 是 s n e u rtn 的组织表达分析及其相互作用因子的筛选 材料和方法 1 材料与试剂 i 1 材料 m u l t i p l et i s s u ee d n ap a n e l 美国c l o n t e c h 公司产品 m a t a c h m a k eg a l 4t w o h y b r i ds y s t e m 3 美国c l o n t e c h 公司 自石河子大学医学院病理科收集4 2 例尸检人体正常各组织 病理诊断证实 脑 3 v 脑 小脑 延脑以及海马 基底节 中央沟回等局部脑组织 脊髓 心 肝 肺 脾 胎盘 脐 小肠 结肠 卵巢和胰腺 均为福尔马林固定 石蜡 包埋组织标本 蜡块保存时间2 5 年 l 2 试剂盒 酶类 抗体 常用试剂等 l i p o f e c t a m i n e t m2 0 0 0 真核转染试剂盒 美国i n v i t r o g e n 公司产品 m i c r o s p i ng 2 5 纯化柱 a m e r s h a m p h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 q i a p r e ps p i n 质粒抽提试剂盒 德国q i a g e n 公司产品 q i a q u i c kp c r 纯化试剂盒 德国q i a g e n 公司产品 q i a q u i c k 胶回收试剂盒 德国q i a g e n 公司产品 p c r c l e a n u pk i t 2 5 0 v g e n eb i o t e c h n o l o g yl i m i t e d 产品 r a p i d p l a s m i dd a i l y p r e pk i t v g e n eb i o t e c h n o l o g yl i m i t e d 产品 d n ag e le x t r a c t i o nk i t v g e n eb i o t e c h n o l o g yl i m i t e d 产品 p l a s m i dm i n ik i t 1 0 0 德国q i a g e n 公司产品 d n a 分子量m a r k e r d l 2 0 0 0 日本t a k a r a 宝生物 公司产品 条带从大到 小依次为2 0 0 0b p 1 0 0 0b p 7 5 0b p 5 0 0 b p 2 5 0 b p 1 0 0 b p 1 0 0 b d d n a l a d d e r m a r k e r 日本t a k a r a 宝生物 公司产品 条带从大n 4 依次为1 5 0 0b p 1 0 0 0b p 9 0 0 b p 8 0 0b p 7 0 0b p 6 0 0b p 5 0 0 b p 4 0 0b p 3 0 0b p 2 0 0 b p 1 0 0b p 一次性滤菌器 i n t e r m o u n l a i ns c i e n t i f i c 公司产品 p r o t e i ng a g a r o s e 美国s a n t a c r u z 公司产品 n e u r i f i n f f l 一1 4 2 i g 克隆抗体 美国s a n t a c r u 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l o n t e c h 公司产品 s d a g a r b a s e g a l r a 培养基 美国c l o n t e c h 公司产品 一u r ad os u p p l e m e n t s 一h i s 一u r ad o s u p p l e m e n t s h i s 一t r p 一u r a d o s u p p l e m e n t s 一h i s 一l e u 一哪 一u r ad os u p p l e m e n t s 美国c l o n t e c h 公司产品 d m e m 细胞培养基 购自美国g i b c o 公司 氯化锰 m n c l 2 美国b b i 公司产品 氯化铷 r b c l 美国a m r e s c o 公司产品 甘油 g l y c e r 0 1 美国a m r e s c o 公司产品 乙酸钾 k a c 美国a m r e s c o 公司产品 冰乙酸 分析纯 上海试剂四厂昆山分厂产品 磷酸 上海菲达工茂有限公司产品 n e u rtn 的组织表达分析及其相互作用因子的筛选 磷酸二氢钾 k h 2 p 0 4 分析纯 上海恒信化学试剂有限公司产品 磷酸氢二钠 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 分析纯 上海新华化工厂产品 氯化钾 k c l 分析纯 上海化学试剂公司产品 3 0 过氧化氢 h 2 0 2 上海化学试剂公司产品 氢氧化钠 n a 0 h 上海化学试剂公司产品 氢氧化钾 k o h 上海化学试剂公司产品 氯化钠 n a c l 分析纯 上海彭镇营房化工厂产品 纯化琼脂粉 上海化学试剂公司产品 电泳琼脂糖 上海y i t o 公司产品 1 3 菌株 质粒和细胞株 克隆载体p b l u e s c r i p t n e u r i t i n 上海联合基因科技集团有限公司提供 大肠杆菌d h 5 a 菌株 基因型s u p e 4 4 a l a c u l 6 9 q 8 0 1 a c z a m l 5 h s d r l 7 r e c a l e n d a l g y r a 9 6 t h i l r e l a l 本实验室保存 大肠杆菌b l 2 1 d e 3 菌株 基因型f 一 o m p t b s d s b r b m b d c m g a l d e 3 本实验室保存 酿酒酵母a h l 0 9 y 1 8 7 菌株 购自美国c l o n t e c h 公司 克隆载体p b l u e s c r i p t s k 购自美国s t r a t a g e n e 公司 真核表达载体p e g f p c 1 购自美国i n v i t r o g e n 公司 真核表达载体p c d n a 4 h i sa 购自美国i n v i t r o g e n 公司 成人脑c d n a 文库 上海联合基因科技集团有限公司提供 h u m a nf e t a lb r a i nm a t c h m a k e rc d n a l i b r a r y 美国c l o n t e c h 公司 a d 2 9 3 细胞株 由复旦大学谢毅课题组提供 p g b k t 7b d p g b k t 7b d p g b k t 7 5 3 p g b k t 7 t p g b k t 7 l a i nv e c t o r y e s t m a k e r t mc a r t i e rd n a 美国c l o n t e c h 公司 1 4 主要仪器设备 微波炉 日本松下公司 g e n e a m p9 6 0 0 型p c r 仪 美国p e r k i ne l m e r 公司产品 p t c 一2 0 0 型p c r 仪 美国m j 公司产品 a b l 3 7 7 型d n a 自动序列分析仪 美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司产品 e b a l 2 高速台式离心机 德国h e t t i c h 公司产品 m s l 微量振荡器 i k a 公司产品 n e u ri t i n 的组织表达分析及其相互作用因子的筛选 n u a i r 8 5 超低温冰箱 日本n u a i r 公司产品 微量移液器 0 5 1 0 此 1 0 一1 0 0 此 2 0 0 1 0 0 0 此 法国g i l s o n 公司产品 微量进样器 上海高欣玻璃仪器厂 g e n e q u a n t i i 型紫外分光光度计 p h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 u l t r o s p e c 4 0 0 0 紫j b l 可见分光光度计 a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公 司产品 m o d e lg 2 5 培养摇床 n e wb r u n s w i c ks c i e n t i f i c 公司产品 3 0 0 型电子天平 美国d e v e n 仪器公司产品 m i l l i o a c a d e m i c 超纯水仪 美国m i l l i p o r e 公司产品 h i t a c h ic r 2 2 e 型高速冷冻离心机 日本h i t a c h i 公司产品 u v p 成像系统 u lt r a v i o l e t 公司产品 超声破碎仪 s o n i c s m a t e r i a l s 公司产品 s d j 超净工作台 上海淀山湖净化设备j 一产品 z d 一9 5 5 6 水平摇床 江苏太仓医疗器械厂产品 p y x d h s 型隔水式电热培养箱 上海跃进医疗器械厂产品 d y 5 0 1 型电泳仪 上海精益有机玻璃制品仪器厂 p h s 3 t c 精密数显酸度计 上海天达仪器有限公司产品 9 9 1 型磁力搅拌器 上海志威电器有限公司产品 h s 1 0 0 a 恒温水浴控制器 上海万达科技器材服务部产品 d y a 电泳仪 上海西巴斯生物技术开发有限公司产品 d n a 电泳槽 上海复日科技有限公司产品 手提式紫外灯 上海复日科技有限公司产品 h 肌8 b 型超级微量恒温器 上海浦江分析仪器厂产品 1 5 常用试剂配制 1 0 0m g m l 氨苄青霉素 o 5g 瓶装氨苄青霉素注入5m l 灭菌双蒸水充分溶解 过滤除菌 分装于1 5m l 离心管中 贮存于一2 0 c 5 0m g m l 卡那霉素 o 2 5g 瓶装卡那霉素注入5m l 灭菌双蒸水充分溶解 过 滤除菌 分装于1 5m l 离心管中 贮存于一2 0 c 1m 0 1 li p t g 2 3 8gi p t g 注入1 0m l 灭菌双蒸水充分溶解 过滤除菌 分装 于1 5m l 离心管中 贮存于一2 0 1 0 0 m m 0 1 l p m s f 称取0 1 7 4g 溶于1 0 m l 异丙醇中 分装于1 5 m l 离心管 中 贮存于一2 0 n e u r i t n 妁组织袭达分析及其相互作用因子的筛选 0 1m o l l c a c l 2 称取1 1 0 9 9g 无水氯化钙 溶解于8 0 0 m l 灭菌水中 定容至 1 乞 高温灭莹 t f b l 1 0 0m m o l lr b c i 5 0 m m o l lm n c h 3 0m m o l lk a c 1 0m m o lc a c l 2 1 5 甘油 用醋酸调至p h5 8 t f b 2 1 0m m o l l m o p s 1 0m m o l lr b c t 7 5m m o l lc a c l 2 1 5 甘油 用 k o h 臻至p h 6 1 2 x s d s 上样b u f f e r 1 0m l1m o l l t r i s h c i p h67 2gs d s 2 0m l 甘油 0 1 g 澳酚蓝 将上述试剂溶于无黼水 加水定容至9 0m l 阁时按l 9 的比例现用 瑗攘8 一菝基乙黪 5 0 x t a e t r i s 碱2 4 2g 加d d h 2 06 0 0m l 充分溶解 加冰乙酸5 7 lm l o 5m o l l e d t a p h8 0 1 0 0 m l 定铎至ll 分我灭菌 1 0m g m l 溴化乙锭 e b 在1 0 0m l d d h 2 0 中熟八lg 澳纯乙锭 磁力搅搀至 完全溶解 然后转移至爱铝箔包裹静棕色簸中 室湿保存 1 5m o l l t r i s h c l p t t8 8 称取y r i s 碱1 8 1 6g 加5 0m l d d h 2 0 究分溶解 加浓盐酸调节p 歪8 0 加水定窖至10 0 m l 灭菌 lm o l lt r i s h c i p h6 8 8 0m l 拳中溶麟1 2 l lgt r i s 藏 魏入浓麓菠调p 壬 至6 8 加水定蜜至1 0 0 m l 灭菌 d a b 显色液 5 m g d a b 溶于1 0 m l5 0 m m o l l t r i s h c l p h7 6 中 用时加 l ob t l3 0 过氧化氢 l 8 培养基 l og n a c l 1 0g 援白胨 5g 酵母粉 溶予i l 蒸馏水 2 0g 阻琼 脂粉 用于固体培养基 y p d 培养基 2 0g l 蛋白胨 l og l