斑蝥素抑制NFκB(P65)及Smad3在高转移卵巢癌细胞株HO8910PM中的表达.doc

斑蝥素抑制NFB(P65)及Smad3在高转移卵巢癌细胞株HO8910PM中的表达【摘要】目的：研究斑蝥素对HO8910PM细胞内NFB(P65)、Smad3蛋白及NFB(P65)mRNA表达的影响，探讨其抗肿瘤侵袭转移的作用机制。方法：用Western blot分析NFB(P65)及Smad3蛋白的表达；RTPCR分析NFB(P65) mRNA的表达。 结果： 25100 mol/L的斑蝥素作用于HO8910PM细胞24 h后，明显下调NFB(P65)及Smad3蛋白表达和NFB(P65)mRNA表达(P0.01)，并呈一定的剂量效应。结论：斑蝥素抗肿瘤侵袭、转移与抑制NFB(P65)、Smad3蛋白和NFB(P65)mRNA的表达有关。 【关键词】 斑蝥素； 基因表达；肿瘤Effects of cantharidin on the expression of NFκB(P65) and Smad3 genes in cells of ovarian carcinoma cell line HO8910PM with highly metastatic potentialHE Taiping, HE Zhenhui, MO Lier, LIANG Nianci(Department of Biochemistry, Guangdong Medical College , Zhanjiang 524023, China)【Abstract】 Objective: To observe the effects of cantharidin on the expression of NFκB(P65) and Smad3 genes in the ovarian carcinoma cell line HO8910PM with highly metastatic potential in order to elucidate the mechanisms in which cantharidin inhibits the invasion and metastasis of tumor. Methods: The Western blot analysis was used to detect the protein levels of NFκB(P65) and Smad3, and the RTPCR assay was used to assess the mRNA level of NFκB(P65). Results: The expression levels of NFκB(P65) and Smad3 proteins and NFkB(P65) mRNA were induced to decrease obviously in HO8910PM cells by the treatment with 520 μmol/L of cantharidin for 24 hours. Conclusion: The cantharidins activity against tumor invasion and metastasis are involved in the reduction of expression level of NFκB(P65) and Smad3 protein and NFκB(P65) mRNA .【Key words】 cantharidin; gene expression; tumor斑蝥素（cantharidin）是从斑蝥中提取的一种活性成分，它在治疗癌症和一些疑难杂症方面显示出其独特的疗效。研究证明斑蝥素首先抑制癌细胞RNA和DNA合成，继而影响蛋白质的合成，最终抑制癌细胞的生长分裂。本课题组前期研究表明，斑蝥素有明显抑制高转移卵巢癌细胞(HO8910PM)的侵袭、趋化运动和粘附重组基底膜能力，并影响VEGF、uPA和FAK蛋白的表达。本文分别用蛋白印迹、RTPCR方法研究斑蝥素对核转录因子NFκB(P65)、Smad3蛋白和NFκB(P65)mRNA表达的影响，探讨斑蝥素抗高转移HO8910PM转移的作用机制。1 材料与方法1.1 实验材料 人高转移卵巢癌细胞(HO8910PM) 购自上海细胞生物所，由浙江省肿瘤研究所许沈华等建立。细胞在含10%(体积分数)小牛血清，100 U/mL 青霉素和100 mg/L 链霉素的RPMI1640完全培养基中，37、5%(体积分数)CO2饱和湿度孵箱培养。细胞经过消化传代，取对数生长期的细胞进行培养。1.2 药品与试剂超级小牛血清购自杭州四季青公司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；4×上样缓冲液(125 mmol/L TrisHCl，pH 6.8，4%SDS，10% β巯基乙醇，20%甘油，0.04%溴酚蓝)；NFκB(P65)小鼠IgG单抗、Smad3小鼠IgG单抗、βActin山羊IgG多抗购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记马抗山羊IgG购自北京中山公司；RTPCR试剂盒购自Qiagene 公司；100 bp DNA marker购自华美生物工程公司；斑蝥素购自Sigma公司，纯度为98。1.3 方法1.3.1 MTT法测定斑蝥素作用24 h对HO8910PM细胞增殖的影响 选取对数生长期的HO8910PM 细胞，经胰酶消化、台盼蓝染色后在血球计数板上计数，确保活细胞在 97%以上。调整细胞浓度按8 000个/孔（100μL每孔）加到 96 孔培养板中。将培养板放入 37、5(体积分数)CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后取出培养板加入不同浓度斑蝥素1 μL，使其终浓度分别为5、10、20、40、80、160 μmol/L，每个浓度设3个平行孔；同时设置空白对照组、溶剂对照组和调零孔。培养板放回孵箱继续培养24 h，取出培养板以每孔50 μg (10 μL)加入MTT，培养板再放回孵箱孵育4 h。吸出上清液，加入200 μL 二甲基亚砜。在平板摇床摇10 min使甲月赞完全溶解。用酶标仪测570 nm 波长处每孔的吸光度(A)值。细胞增殖抑制率(IR)=(对照组A值—处理组A值)/对照组A值×100%1.3.2 Western blot 分析NFκB(P65)、Smad3蛋白表达 取对数生长期的HO8910PM细胞，稀释成1×106/mL，接种于50 mm的培养皿中培养，每皿5 mL。待细胞贴壁后，分别用PBS、0.1% DMSO和5、10、20 μmol/L的斑蝥素处理H08910PM细胞24 h，收集细胞，PBS洗涤2次，加入预冷的细胞裂解液100 μL，用细胞刮器将细胞刮下，并转移至预冷的1.5 mL离心管中，置于碎冰上冰育20 min后，于4，12 000×g离心15 min。上清液转移至另一个1.5 mL离心管中，参照考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量。蛋白样品和4×上样缓冲液按31的比例混合，100水中煮沸5 min使蛋白质变性。 SDSPAGE电泳后电转移至PVPF膜上，5脱脂牛奶封闭后加入第1抗体于室温孵育2 h，用TBS缓冲液洗涤3次，每次10 min，加入第2抗体于室温孵育2 h，再用TBS缓冲液洗涤3次，每次10min，加入发光试剂(ECL)显色，以βActin作内参，用图像分析软件Scion Image进行光密度积分值分析。1.3.3 半定量RTPCR检测NFκB(P65)mRNA的表达 (1) 总RNA的提取：分别收集以PBS、0.1% DMSO和5、10、20 μmol/L的斑蝥素处理HO8910PM细胞24 h后，按Trizol试剂盒说明提取总RNA。(2) 引物设计与合成：NFκB(P65)引物设计参照文献，引物序列为：sense primer: 5TCAATGGCTACACAGGACCA3，antisense primer: 5 CACTGTCACCTGGAAGCAGA3，扩增产物长度为307 bp。以GADPH为内参照，引物序列为：sense primer: 5ACCACAGTCCATGCCATCAC3，antisense primer: 5TCCACCACCCTGTTGCTGT A3，扩增产物长度为452 bp。引物均委托上海生工生物工程公司合成。(3) 扩增条件：50逆转录30 min，95 预变性15 min，循环35次（94 30 s，53 1 min，72 1 min），再72 充分延伸10 min。取5 μL PCR产物加1 μL 6×上样缓冲液混匀，1.8%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL溴化乙锭)在100V恒压电泳约40 min，紫外透射仪观察结果并拍照。相片经扫描仪扫描后，用图像分析软件Scion Image进行光密度积分值分析，计算出NFκB(P65)分别与内参照GAPDH的光密度积分值之比作为NFκB(P65) mRNA的相对含量值。 1. 4 统计学处理采用SPSS11.0统计软件包进行单因素方差分析及q检验，以P0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1 MTT法测定斑蝥素作用24 h后对HO8910PM 细胞增殖的影响分别用0160 μmol/L的斑蝥素作用HO8910PM细胞24 h后，MTT法测定细胞增殖抑制率，结果表明，斑蝥素能明显抑制HO8910PM细胞的增殖，并呈剂量效应关系(P0.01)，见表1。表1 斑蝥素作用24 h后对HO8910PM 细胞增殖的影响（略）组间两两比较，均P0.01。2.2 斑蝥素对NFκB(P65)、Smad3蛋白表达的影响分别用PBS、0.1% DMSO和5、10、20 μmol/L的斑蝥素处理HO8910PM细胞24 h后，Western blot 分析目的蛋白的表达。结果发现，斑蝥素能够明显抑制细胞NFκB(P65)和Smad3蛋白的表达，见图1、2。1:空白对组;2:溶剂对照;3:5 μmol/L斑蝥素;4:10 μmol/L斑蝥素; 5:20 μmol/L斑蝥素图1 斑蝥素作用HO8910PM细胞24 h后对NFκB(P65)、Smad3和βActin蛋白表达的影响（略）*与空白对照比较 P0.01;+与空白对照比较P0.05外，余均P0.01。M:标记; 1: 空白对照; 2:溶剂对照; 35 μmol/L 斑蝥素;410 μmol/L斑蝥素;520 μmol/L 斑蝥素图3 斑蝥素作用24 h后对NFκB(P65)mRNA表达的影响（略）3 讨论NFκB是一类几乎存在于所有细胞内，能与多种基因的启动子或增强子NFκB结合位点发生特异性结合并启动基因转录的一组转录调节因子。NFκB是由亚单位P50和P65组成的异源二聚体，P50与DNA直接结合，P65具有转录活性。静息状态下，NFκB和抑制性蛋白IκBα结合滞留于细胞质中，在一定刺激作用下IκBα解离，NFκB释放进入细胞核激活靶基因。近年研究发现多种致癌因素通过激活NFκB，促进细胞生长，使细胞发生恶性转化并促进肿瘤细胞的转移58。 NFκB还可以通过上调与细胞生存、增殖相关的基因表达或诱导凋亡抑制因子的过表达以及阻断凋亡途径中的某个信号分子的表达而发挥抗凋亡作用。因此抑制NFκB的表达或活性，就能促进肿瘤细胞的凋亡，抑制其生长和转移，干预了肿瘤演变的整个过程。本研究发现，斑蝥素作用HO8910PM细胞24 h后，明显抑制NFκB P65 亚基的表达，从而调控肿瘤转移相关靶基因如VEGF、uPA和FAK的表达，降低HO8910PM细胞侵袭转移能力。Smad3是转化生长因子β（TGFβ）信号转导通路中一个关键的信号分子。研究表明，磷酸化激活Smad后，Smad3与Smad4复合物与SBE(Smad binding element)结合，启动相关靶基因的表达，从而影响肿瘤的发生与发展。TGFβ通常会抑制细胞生长，但有研究表明TGFβ在很多晚期实质性肿瘤会过度表达，有利于肿瘤细胞逃离免疫监控，并促进肿瘤新生血管生成。Lindemann等9的研究表明，在侵袭性乳腺癌MDAMB231细胞中，两种TGFβ的抑制物SB202190和SB203580可明显延迟由TGFβ诱导的Smad3在核中的堆积，并下调PAI和uPA的表达，抑制MDAMB231的侵袭能力。我们在研究中首次发现，斑蝥素也能明显抑制Smad3蛋白的表达，推测斑蝥素能降低TGFβ蛋白表达水平，从而影响侵袭转移相关蛋白VEGF 、uPA 的表达，抑制HO8910PM细胞的侵袭转移能力。 总之，斑蝥素抗高转移卵巢癌HO8910PM细胞侵袭转移的作用机制与NFκB和Smad3这两个靶点密切相关。【参考文献】 1刘健,高建辉,刘晓秋. 斑蝥素及其衍生物的研究进展J.中药材,2003, 26(6):453455. 2许沈华, 钱丽娟, 牟瀚舟,等. 高转移人卵巢癌细胞系HO8910PM的建立及其生物学特性J. 中华病理学杂志, 1998, 27(6): 451452.3王多宁, 赵雁武, 田芙蓉. 考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量J. 第四军医大学学报, 2001, 22(6):528529. 4谢东华, 唐孝达, 夏术阶,等. 核转录因子B在膀胱癌中的表达及临床意义 J. 癌症, 2002, 21(6):