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养猪场埃希氏大肠菌耐药性的流行病学调查研究作者：黄睿蕾 吴聪明摘要：以规模化养猪场为调查对象，按美国NCCLS（1999）法规推荐的纸片扩散法，测定了分离自猪群、饲养员及场内环境188株大肠杆菌对21种抗菌药物的敏感性。结果分离菌全为多重耐药菌株，其中耐受6种、7种、8种抗菌药物的多重耐药菌株最多，占50%以上。分离菌对四环素、复方新诺明、氨苄西林的耐药率最高，猪群分离菌分别为99.21%、85.83%及77.95%，同类药物表现出交叉耐药现象；对链霉素及卡那霉素的耐药率也较突出；对4种氟喹诺酮类药物猪群分离菌耐药率为19.69-33.07%；对头孢类抗生素、阿米卡星、多粘菌素B表现出较低的耐药率。猪群、环境分离菌对其中9种抗生素的耐药率及耐药谱分布有较高符合率，而与饲养员分离菌却存在较大差异。关键词：埃希氏大肠杆菌；药物敏感性；抗菌药物；耐药性细菌耐药性是上个世纪留下的世界性医学难题。自20世纪40年代青霉素问世以来，众多抗生素相继研发出来并应用于临床，极大地降低了感染性疾病的发生率及病死率，有力地保障了人民的生命健康。抗生素用于人类化疗不久，其亦开始用于兽医临床。在用磺胺及链霉素添加于饲料为鸡肠道消毒的过程中，发现它们对鸡有促生长作用，很快在猪体内亦证明有同样促长作用。于是，1949年美国开始批准一些抗生素用作饲料添加剂，1953年英国也随之允许使用。从此，许多不同类别的抗生素作为生长促进剂添加于饲料中大量应用1，我国于上个世纪70年代开始使用生长促进剂。应该说动物养殖中使用抗生素，在控制和预防疾病、促进动物生长、降低动物源性病原菌排放方面，发挥了极其重要的作用，特别是在我国养殖管理水平低，生态环境比较差的情况下畜牧业能够快速发展，抗生素用作生长促进剂功不可没。但随着抗生素在人医及兽医临床中的广泛应用, 以及作为生长促进剂在养殖业中的大量使用，细菌开始对其产生耐药性。上个世纪80年代之前，各国管理部门及公众不太关注细菌耐药性的发生发展问题，因为60-70年代是抗生素开发的黄金时期，几乎隔不了多长时间就会有一种新抗生素推出以对付耐药菌，80年代后抗生素的研发速度开始放慢，当人们回过头来发现细菌已对众多常用抗生素产生了耐药，并且对新推出的寄予厚望的氟喹诺酮类药物也很快产生耐药性时，人们才意识到这个问题的严重性2,3,4。由于广泛及大量使用抗菌药物是细菌耐药性产生及扩散的主要原因，因此医院及养殖场便自然成为产生和传播抗生素耐药菌的重要场所。已证实，家禽、家畜体内的肠道菌可通过人与动物接触，加工、食用肉制品等过程将携带的耐药质粒传递给人体肠道菌5，人们担心养殖业中大量使用抗生素所诱导的耐药菌可能会通过环境或食物链传播到人体对健康造成危害4,6,7。因此世界各国都十分注重动物细菌耐药性的监测8,9。由于我国动物养殖特点、用药传统及其它历史原因，我们对动物中抗生素使用的品种及数量等缺乏详细确切的资料，对动物、食品分离细菌的耐药性监测几乎是一片空白。因此开展动物源细菌耐药性调查研究，掌握食品动物源细菌耐药性的产生及扩散情况已非常迫切！本文以一规模化养猪场为对象，调查各生长阶段猪群、饲养员及养殖环境大肠杆菌的耐药现状，结合养殖场用药情况，分析细菌耐药性发生发展与抗菌药物使用种类与使用量的关系，了解细菌耐药性在动物-环境-人之间的散播情况，为今后耐药性监测工作的开展及耐药性扩散防止措施的制定提供基础资料。1 材料与方法1.1 试验材料1.1. 1培养基 伊红美兰琼脂，批号20011123；普通肉汤，批号20020524；营养琼脂，批号20011215；MH琼脂，批号20020812。均购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.2肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管 型号 GYZ-11e，批号 20020806， 购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.3标准菌株 大肠埃希氏菌ATCC25922；金黄色葡萄球菌ATCC25923；铜绿色假单胞菌ATCC27853。均购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1. 4药敏纸片 药物纸片种类及含药量见下表1，批号略，购自杭州天和微生物试剂有限公司。购买的每批药物纸片在使用前均要用上述3种标准菌株进行抑菌圈直径监测，符合要求方可使用，每周用标准菌株ATCC25922检测抑菌圈直径，符合要求才可继续使用。表1 各种抗菌药物纸片含药量及判定标准抗菌药物名称纸片含药量（g/片） 抑菌圈判断标准（mm） 耐药（R） 中介（M） 敏感（S）氨苄西林101314-1617阿莫西林1013 14-1617头孢氨苄301415-1718头孢唑啉301415-1718环丙沙星51516-2021诺氟沙星101213-1617恩诺沙星101516-2021洛美沙星101819-2122链霉素101112-1415庆大霉素101213-1415卡那霉素301314-1718阿米卡星301415-1617新霉素301213-1617壮观霉素1001415-1718四环素301415-1819强力霉素301213-1516氯霉素301213-1718呋喃唑酮3001415-1617呋喃妥因3001415-1617复方新诺明23.75/1.251011-1516多粘菌素B30089-11121.2.试验方法1.2.1 标本采集 分别从广东省某猪场的猪群、场内环境（包括土壤及污水）及饲养员采样饲养员和猪均以灭菌棉签采集直肠拭子标本，猪群分大猪、中猪、小猪三小类，各类猪群分别采集10个标本；土壤及污水去除表面层，以灭菌小匙取表面下层土壤及水，共10个标本；饲养员采集了9个标本。1.2.2抗菌药物使用情况调查 在采样的同时，调查猪场抗菌药物使用情况（包括治疗用药及生长促进剂），以及饲养员在1年内服用抗菌药物情况。1.2.3菌株的分离 直肠棉拭子直接在伊红美兰琼脂平板上涂布，37，24小时培养后，从平板上随机挑取4-5个紫黑色带金属光泽的菌落进行纯培养及生化鉴定。土壤及污水标本先以灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释，再从2-3个梯度稀释液中吸取0.1mL倾布于伊红美兰琼脂平板上，37，24小时培养后，挑取大肠杆菌可疑菌落进行下一步操作。1.2.4菌株的鉴定 按杭州天和微生物试剂有限公司介绍的肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管鉴定法进行。 即将分离纯化的可疑大肠杆菌菌株接种到系列细菌生化编码微量鉴定管内，37，24小时培养后，对菌株的生化反应结果进行判断并进行编码，按其编码检索肠杆菌科细菌生化编码表即可获得结果，对不确定的菌株进一步补充生化反应予以判定。1.2.5药敏试验 整个药敏试验严格按照美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS1999)推荐的纸片扩散法操作程序进行。在营养琼脂平板上挑取单个菌落接种于2ml普通肉汤管内，37培养16-18小时后，用MH肉汤调制菌悬液，使其达到0.5麦氏比浊管浊度。用灭菌棉拭子蘸取已调制好的菌悬液，于管壁上挤去多余液体，在已烘干的MH琼脂平板上均匀涂抹，平皿涂好后放置3-5分钟，待其培养基表面水份吸收干，即用无菌眼科镊将药敏纸片贴于平板上，每种药物贴2个纸片。37培养16-18小时后观察结果。用游标卡尺量取每种药物2个抑菌圈的直径，计算平均值，参照NCCLS1999公布的标准以敏感、中介或耐药3种形式对抑菌圈的大小作出解释，个别NCCLS1999没有列出但我国仍在临床上使用的药物（如恩诺沙星、新霉素、呋喃唑酮等），按杭州天和微生物试剂有限公司提供的标准进行解释。2 结果2.1 接受调查猪场抗菌药物的使用情况见表2。接受采样的9名饲养员6个月内都没有服用过任何抗菌药物。饲料添加抗菌药物种类预防或治疗性使用抗菌药物种类利高霉素（含林可霉素及壮观霉素）金霉素、新霉素、阿散酸、杆菌肽锌、泰农（泰乐菌素）、强力霉素、二甲硝唑磺胺二甲嘧啶（SM2）+TMP环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、土霉素、阿米卡星、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素、阿莫西林、利高霉素、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、黄连素、鱼腥草、痢特灵、林可霉素、阿维菌素、痢菌净等常规轮换添加于各生长期猪饲料中临产、断奶、转群或感染性疾病流行期预防或治疗使用表2 养猪场抗菌药物使用情况2.2 整个猪场共分离大肠杆菌188株，其中小猪群47株，中猪群31株，大猪群49株，饲养员32株，环境29株。各猪群、饲养员及环境分离大肠杆菌对21种抗菌药物的耐药率见表3。由表中见，猪场分离大肠杆菌对四环素类抗生素的耐药性最严重，如猪群、人群及环境分离菌对四环素的耐药率分别为99.21%、96.88%及100%，强力霉素与四环素表现为完全交叉耐药；紧接着的是磺胺类抗菌药和青霉素类抗生素，猪群、饲养员及环境分离菌对它们都表现为高度耐药；分离菌对各种氨基糖苷类抗生素的耐药性表现不太一致，以卡那霉素最严重，其次为链霉素，对庆大霉素、壮观霉素及新霉素的耐药性猪群及环境分离菌要比饲养员分离菌严重，表现出较大差异，而分离菌对阿米卡星的耐药性则刚好相反，以饲养员分离菌为最高；猪场分离菌对头孢氨苄、头孢唑啉及多粘菌素B的耐药率最低，而氯霉素虽然已禁用，但细菌对其仍有较高的耐药率，从表中还看到，分离菌对硝基呋喃类抗菌药的耐药率亦较突出，尤其是环境分离菌；对氟喹诺酮类药物耐药性，猪群、饲养员及环境分离菌之间的差异不大。表3 各猪群、饲养员及环境分离大肠杆菌对21种抗菌药物的耐药率（%）抗菌药种类简称小猪群中猪群大猪群猪群饲养员环境环丙沙星环38.312.96.1219.6934.3824.14氟哌酸氟42.5512.96.1221.2631.2527.59恩诺沙星恩40.4316.138.1622.0531.2527.59洛美沙星洛53.1925.8118.3733.0743.7534.48氨苄西林氨89.3670.9771.4377.9593.7589.66阿莫西林阿72.3451.6159.1862.259.3875.86 头孢氨苄（）03.2300.7900头孢唑啉（）004.081.5700四环素四97.8710010099.2196.88100强力霉素强97.7410089.894.4993.75100链霉素链59.5748.3940.8249.6171.8858.62卡那霉素卡97.8710057.1482.6868.7596.55阿米卡星阿6.38002.3615.630庆大霉素庆36.1716.1314.2922.839.3827.59新霉素新29.7929.038.1621.262558.62壮观霉素壮40.4332.2624.4932.286.2524.14氯霉素氯46.8167.7444.951.182551.72多粘菌素B多000003.45痢特灵痢8.5129.0314.2915.7412.531.03呋喃妥因呋4.266.4520.69复方新诺明复93.6296.7771.4385.8381.2593.12.3 将三类猪群分离菌对21种抗菌药物的耐药率作柱状图1。从图可直观地看到，三类分离菌对四环素、强力霉素、氨苄西林、阿莫西林都很高；对卡那霉素及复方新诺明的耐药率,虽然三类猪群都高，但小猪群及中猪群分离菌的耐药率却较大猪群更突出；对头孢氨苄、头孢唑啉及多粘菌素B几乎不表现耐药性；对氟喹诺酮类药物耐药性三类猪群分离菌表现出差异，其中以小猪群分离菌最高，大猪群最低。2.4由于21种受试抗菌药物中有不少是结构同类药物，因此细菌对它们表现出交叉耐药性。21抗菌药物分属于9类药物，从各类药物中选一种，比较猪群、饲养员及环境分离菌对这9种抗菌药物的耐药率差异（见折线图2）。从图2可见，代表猪群、饲养员及环境分离菌的三条折线中，猪群及环境两条折线有很高的符合率，而饲养员折线却与它们表现出较大的差异，特别是对链霉素与氯霉素耐药率两个点上。2.5 猪群分离菌的多重耐药情况见图3，猪群、环境及饲养员分离菌的耐药谱型见表4。从图3可见，从该猪场猪群分离的大肠杆菌几乎全为多重耐药菌株，其中以耐受6种、7种、8种抗菌药物的菌株最多，占据了50%以上，另外50%菌株则耐受35种或913种抗菌药物，只耐受1种及耐受15种以上药物的菌株十分稀少。从表4可看到，猪群分离大肠杆菌有28种耐药谱型，环境分离株有16种，饲养员分离株仅有12种。另外，猪群、环境及饲养员分离菌株都没有敏感菌株，但饲养员分离菌株中有3.12%为中介菌株。比较猪群、环境及饲养员分离菌株的耐药谱型还可发现，除axtlfd型外，分离自猪群及环境的4耐菌株其耐药谱型有很高的符合率，它们中的atsd、atld 、atlfd及atsld型所占百分率都很高，为其主要耐药谱型，而猪群、环境分离菌株的耐药谱型与饲养员分离菌株的耐药谱型则差距较大。表4 猪群、饲养员及环境分离大肠杆菌耐药谱比较猪群环境饲养员耐药谱型比率耐药谱型比率耐药谱型比率atslfd2.36atslfd10.33atslfd3.13catsld2.36catsld3.45catsld15.63catsfd1.57catsfd6.90axtlfd0.79atlfd5.51atlfd6.90atsfd0.79catfd3.45atsfd6.25atsld10.24atsld6.90catld4.72catld6.90catsd9.45catsd3.45catsd18.75atld14.96atld6.90atld3.13atsd11.02atsd20.67atsd9.38atsl0.79atlf3.45cats0.79atsf3.45ctld0.79tlfd2.36tsld3.15tsld3.45atd3.94atd6.90atd15.63atl1.57ats3.94ats9.37tfd0.79tld1.57tld3.45tsd1.57tsd3.12ad0.79as3.12at2.36at6.25td7.09td3.45td3.12tf0.79ts0.79t3.15中介0中介0中介3.12敏感0敏感0敏感0注： c 环丙沙星； a 氨苄西林； x 头孢氨苄； t 四环素； s 链霉素； l 氯霉素；f 呋喃唑酮； p 多粘菌素B； d 复方新诺明；中介 至少对1种抗生素不敏感；敏感 对9种抗生素全敏感 3 讨论3.1该猪场添加于饲料中用作生长促进剂的抗菌药物有利高霉素（内含大观霉素）、新霉素、金霉素、SM2+TMP等，因群猪场分离菌对这些抗菌药物有很高的耐药率不足为奇；链球菌病是该猪场防疫的重点细菌性流行病，该猪场常常在链球菌病流行期添加阿莫西林于饲料中进行预防，因此随着时间的延长，自然细菌对其敏感性大大降低；青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、恩诺沙星等是该猪场常用治疗性药物，另外在在母猪临产、仔猪断奶及转群期间将特意在饲料及饮水中添加一些预防性药物，如利高霉素、磺胺药、恩诺沙星等，但氟喹诺酮类药物味苦，口感差，除非不得已，一般不作为饲料添加药物作用；一般哺乳仔猪及小猪（均归为小猪群）较常发生腹泻及呼吸道疾病，因此是猪场的重点监护对象，故预防性用药及治疗性给药的机会小猪群要高于中猪和大猪群，因此，对氟喹诺酮类药物、青霉素类药物、氨基糖类药物，小猪群分离菌对其比中猪和大猪群有更高的耐药率是合理的；氯霉素已禁用，但猪场分离菌对其还有较高的耐药率，其中原因不得而知，有可能是药物压力共选择的结果；研究报道细菌对硝基呋喃类药物较难产生耐药性，但我们分离的大肠杆菌对其耐受的菌株已占相当比例，这是一个值得注意的情况。3.2国内从事养殖业的人员这样调侃，在饲料中添加药物尤如在食品中加盐，因此使用抗菌促生长剂在养殖业是最普通不过的事情。接受调查的猪场已有5年生产历史，可见5年中添加抗菌促生长剂对细菌所造成的选择压力！据我们分离的188株大肠杆菌对21种抗菌药物敏感性试验结果，已没有对这21种抗菌药物全部敏感的菌株存在，连只耐受1种药物的菌株都非常稀少，分离株几乎全为耐2种以上的多重耐药菌。尤其是细菌对氨苄西林、四环素、链霉素及磺胺同时表现耐受，并且有很高的耐药率。因此从我们认为：不仅病原菌，肠道共生性大肠杆菌的耐药性高低与抗菌药物的使用种类及用量亦有密切的关系，我们应该谨慎使用抗菌药物，尤其是抗菌促生长剂。3.3抗生素的广泛使用，不仅引起病原菌产生耐药性，也会引起条件性致病菌及体内外的共生菌产生耐药性，而且共生菌可能还是病原菌耐药基因的贮库，因此共生菌耐药水平是监控抗生素选择压力及预测病原菌耐药性趋势的良好指示器。食品动物的耐药性共生菌可通过与职业人群的接触或通过污染食品进入人体，因此监测分离自环境、食品动物、动物源食品、以及人体指示菌（如大肠杆菌及肠球菌）的耐药情况，可了解细菌耐药性的流行趋势，为评估耐药细菌或耐药基因从动物转移至人的危险性评价提供必要的数据10。我们对猪场猪群、环境及饲养员分离大肠杆菌的耐药性进行比较分析，发现猪群分离菌与环境分离菌对9种抗菌药物的耐药率及耐药谱有较高的符合率，它们之间的内在联系，有待于深入研究。可能猪群使用抗菌药物所诱导的耐药菌或耐药基因可向环境扩散并在环境中维持存在，或者猪群经粪、尿排放的残留药物对环境菌产生同样的压力，诱导出类似的耐药菌。接受调查的9名饲养员在6个月内都没有服用过任何抗菌药物，有的甚至1年以上没有服用过任何药物，但从他们体内分离的大肠杆菌对四环素类、青霉素类、磺胺类、以及氨基糖苷类中的链霉素及卡那霉素同样表现出较高的耐药率，对氟喹诺酮类药物的耐药率与猪群及环境亦较接近，而分离菌的耐药谱却与猪群、环境存在相当差异，其原因不得而知。3.4必须开展细菌耐药性监测已成大家的共识。常规的细菌耐药性监测结果可提供系统的细菌耐药性流行趋势，分析药物选择压力及其它因素对细菌耐药性产生和发展的影响，评价细菌抗生素耐药性从动物转移到人对公众健康的潜在危害；细菌耐药性监测还有利于临床上更合理地使用抗菌药物，有利于药物研究部门及制药企业开发新药、新药注册及制定药物上市规划。人医非常重视对细菌耐药性的监测，已建立起监测网络并运作11，12。我们呼吁兽医部门也应建立相应的机构对细菌耐药性进行监测，尤其是加强对人畜共患病原菌耐药性的监测。【参考文献】1 Wolfgang Witte. 2000. 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