（生物物理学专业论文）霍山石斛内生真菌的分离及其促生作用的研究.pdf

摘要 本文以国家重点保护的药用植物霍山石斛( d e n d r o b i u mh u o s h a n e n s ec z t a n ge t s j c h e n g ) 为研究材料，采用常规内生真菌的分离方法，以马铃薯蔗糖培养基为分离 培养基，从霍山石斛的根部分离得到3 株内生真菌；通过与霍山石斛试管苗的共培养 实验，发现其中的1 株内生真菌( 编号s h 0 1 ) 对霍山石斛试管苗的生长有显著的促 进作用；实验就s h o l 对霍山石斛试管苗生长的影响进行了研究。 1 从8 5 个石斛根段中，分离得到3 株内生真菌，通过形态学观察初步鉴定分别 隶属于半知菌亚门丝孢纲的枝顶孢霉属和柱孢霉属。 2 通过共培养，从分离得到的3 株内生真菌中，筛选出1 株对霍山石斛试管菌生 长有显著促进作用的内生真菌( s h 0 1 ) ，该菌株与霍山石斛试管苗共培养3 0 d 时，霍 山石斛试管苗增重量是对照增重量的1 2 2 倍，株高的增加量达到对照增加量的1 6 9 倍。且多次重复实验证明，s h - 0 1 对霍山石斛试管苗的生长有显著的促进作用。 3 研究了内生真菌s h 0 1 的培养特性，并以菌丝体生物量为指标对其培养条件 进行优化，综合实验结果和经济因素，筛选出s h 0 1 的最佳培养条件为：2 0 0 9 l 马 铃薯+ l o g l 蔗糖+ s v l 蛋白胨+ 3 9 l 磷酸二氢钾+ 1 5 e d l 硫酸镁，p h 6 0 。 4 ，初步建立了内生真菌与霍山石斛试管苗的共培养体系。共培养的最佳条件为 1 2 m s + 1 0 l 蔗糖+ l o g l 琼脂，p h 5 8 。 5 研究了内生真菌s h - 0 1 对霍山石斛试管苗生长的影响。结果表明，在共培养 3 0 d 和6 0 d 时，与内生真菌s h 0 1 共培养的霍山石斛试管苗的鲜重、株高的增加幅度 均显著高于对照( p 0 0 5 ) 。且在促进霍山石斛试管苗生长的同时，该内生真菌对石 斛主要有效成分石斛多糖和生物碱的积累并没有影响。研究中还发现，共培养6 0 d 时，霍山石斛试管苗鲜重、株高和分蘖与对照相比的增加率都要低于共培养3 0 d 时鲜 重、株高和分蘖的增加率，表明随着共培养时问的增加，该内生真菌对霍山石斛试管 苗的促生作用减弱了。霍山石斛试管苗与内生真菌s h 0 1 共培养移栽后，霍山石斛试 管苗鲜重、移栽成活率比较对照有一定提高，但未达到显著水平。 6 研究了内生真菌s h 一0 1 发酵液对霍山石斛试管苗生长的影响。结果表明，在 霍山石斛试管苗的培养基中加入一定体积的内生真菌s h - 0 1 的发酵液，可以显著促进 霍出石斛试管苗的生长。 关键词：霍山石斛、内生真菌、试管苗、共培养、有效成分、发酵液 i s o l a t i o na n dc u l t u r eo fe n d o p h y t i cf u n g ia s s o c i l a t e dw i t h ah u o s h a n e n s ea n di t se f f e c t so nt h eg r o w t ho fp l a n t l e t s a b s t r a c t d e n d r o i u ms w i st h es e c o n dl a r g eg e n u si no r c h i d a c e a ei nw h i c hm a n ys p e c i e s p o s s e s sm e d i c a lf u n c t i o na n d t h e r e f o r eh a v e b e e nv a l u a b l et r a d i t i o n a lc h i n e s e m e d i c i n e ( t c m ) f o rm a n yy e a r s t h r e ee n d o p h y t i cf u n g is t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mt h e w i l dd h u o s h a n e n s e ( d e n d r o b i u mh u o s h a n e n s ec z t a n ge ts j c h e n g ) r o o t sb yu s i n g s o l i d i f i e dp o t a t od e x t r o s ea g a t ( p d a ) t h e s ee n d o p h y t i cf u n g is t r a i n sw e r ec u l t u r e dw i t h d h u o s h a n e n s ea n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a to n eo f t h e mc o u l dp r o m o t et h eg r o w t ho f t h e p l a n to b v i o u s l y t h em a i nr e s e a r c hr e s u l t sa sf o l l o w e d ： 1 t h r e ee n d o p h y t i cf u n g is t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o m8 5p l a g m e n t so f t h er o o t so f w i l d d h u o s h a n e n s ea n dt h e yw e r ec l a s s i f i e dt od e u t e r o m y c o t i n aa n db l o n gt ot w od i f f e r e n t g e n u s 2 o n ee n d o p h y t i cf u n g u ss t r a i nt h a tc o u l dp r o m o t et h eg r o w t ho f t h et u b ep l a n to f d h u o s h a n e n s es i g n i f i c a n t l yh a db e e ns c r e e n e do u tt h r o u g hc o n c u l t u r e ( s h 一0 1 ) t h e i n c r e a s i n g o n 疗e s h w e i g h t o f t h e p l a n t i s1 2 2 t i m e s a n d t h e h e i g h t i s1 6 9 t i m e sc o m p a r e d w i t hc o n t r o la f t e r3 0d a y s c o n c u l t u r e r e p e a t e de x p e r i m e n t ss h o w e dt h a ts h o1c o u l d p r o m o t et h eg r o w t ho f t h e t u b ep l a n to f d h u o s h a n e n s es i g n i f i c a n t l y 3 a f t e rp u r i f i c a t i o n ，t h em o s ts u i t a b l en i t r o g e ns o u r c e ，c a r b o ns o u r c ea n dt h ep h v a l u ew e r er e s e a r c h e df o ri t sg r o w t h ，w h i c hp r o v i d e st h ep r e r e q u i s i t ea n dt h ea p p l i c a t i o n f o u n d a t i o nf o rr e s e a r c ho ni t sb i o l o g i c a la c t i v i t y i n t r g t r e a t e dp h y s i o l o g i c a le f f e c t sa n d e c o n o m i cf a c t o r s ，t h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o nw a s ：2 0 0 9 lp o t a t o + 1 0 9 ls u c r o s e + 5 9 l p e p t o n + 3 9 lk h 2 p 0 4 + i 5 e ，lm g s 0 4 ，p h 6 0 4 e s t a b l i s h e dt h ec o n - c u l t u r es y s t e mb e t w e e nt h ee n d o p h y t i cf u n g u sm a dt h et u b e p l a n to f d h u o s h a n e n s e t h eb e s ti n o c u l a t ec o n d i t i o nw a s1 2m s + 1 0 9 l s u c r o s e + l o g la g a r ，p h 5 8 5 r e s e a e h e de f f e c t so f s h - o lo nt h eg r o w t ho f t h et u b ep l a n to f d h u o s h a n e n s e t h e r e s u l t ss h o wt h a tt h ei n c r e a eo f t h ef r e s hw e i g h ta n dh e i g h to f t h e p l a n tw a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h a to f c o n t r o l sa f t e rt h et u b ep l a n to f d h u o s h a n e n s ec u l t u r e dw i t hs h 一0 1f o r 3 0d a y sa n d6 0d a y s ，s i m u l t a n e o u s l yt h ep o l y s a c c h a r i d ea n da l k a l o i dc o n t e n to f t h et u b e p l a n to f d h u o s h a n e n s eh a v en o tc e r t a i n l ya f f e c t e d i nf u t h e rr e s e a r c hw ef o u n dt h a tt h e i n c r e a s i n go f a l lg r o w t ht a r g e to f t h et u b ep l a n to f d h u o s h a n e n s ea f t e r 6 0 d a y s c o n - c u l t u r ew a sl o w e rt h a nt h ei n c r e a s i n ga f t e r3 0d a y s c o n - c u l t u r e w h i c hi n d i t a t e t h eg r o w t h p r o m o t i n gf u n c t i o ni sw e a k e n e d t h et u b ep l a n to f d h u o s h a n e n s ew e r e w a r l s v l a n t e da f t e rc u l t u r e dw i l hs h 0 1 1 1 1 er e a s u l ts h o wt h a tt h e 舶s hw e i g h ta n d s u r v i v a lr a t ea l ei m p r o v e dt h a nt h ec o n t r 0 1 b u tt h a tr o l eh a sn o tr e a c h e ds i g n i f i c a n tl e v e l s 6 r e s e a r c h e de f f e c t so ft h eb r o t ho fs h 0 1o nt h eg r o w t ho f t h et u b ep l a n to f a h u o s h a n e n s e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tac e r t a i nv o l u m eb r o t ha d d e di 1 1t h ec u l t u r e m e d i u mo f t h et u b ep l a n to f d h u o s h a n e n s ec a nb es i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dg r o w t ho f t h e p l a n t l e t s k e yw o r d s ：d e n d r o b i u mh u o s h a n e n s ，e n d o p h y t i cf u n g i ，p l a n t l e t ，c o n - c u l t u r e ，e f f e c t i v e c o n t e n t ，f e r m e n t i v el i q u i d i l l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 王张 时间：c ) 7 年月角 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名塑 对、辛 筹ek 叫间：d 7 年月，闩 司j 毛。 1 文献综述 1 1 内生真菌的定义及研究简史 早在1 0 0 多年前，人们已经发现健康植物组织的内部也有微生物存在，但由于它 们生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，其存在和作用长期以来一直为人们 所忽视。直到1 9 7 7 年，b a c o n 掣1 发现高羊茅内生真菌与牛中毒症状相关后，植物内 生真菌的生物学作用的研究才引起人们的广泛关注。在其后十几年时日j ，研究者主要 侧重于草本植物内生菌研究，特别是在感染内生菌的牧草对草食动物以及对食叶虫的 影响方面作了大量研究【2 卅。2 0 世纪9 0 年代后，植物内生菌的研究范围迅速扩大，人 们开始从更多的植物中分离内生菌，研究其生物多样性、生物学作用、侵染途径以及 与宿主之间的关系等。1 9 9 3 年，s t r o b e l 等【5 j 首次报道了从短叶紫杉的树皮中分离出一 株能产生紫杉醇的内生真菌，对植物内生菌又有了更深的了解，掀起了从植物内生菌 中寻找新物质的热潮。近十几年来，已有数百种新的抗肿瘤、抗菌、杀虫、免疫抑制、 抗氧化、降塘等天然化合物先后从内生菌中分离出来。近年，在研究植物内生菌的过 程中引入了现代分子技术，从而使对内生菌的研究进入到分子水平。 随着对植物内生真菌研究的深入，对植物内生真菌( e n d o p h y t e ，e n d o p h y t i cl u n g o rf u n 蹦e n d o p h y t e ) 的定义也在不断发展变化。内生菌一词最早由d eb a r y 于1 8 6 6 首 先提出1 6 j ，是指生活在植物组织内的微生物，用以区分那些生活在植物表面的表生菌 ( e p i p h y t e ) 。按此定义植物的致病菌、菌根菌也归属于内生菌的概念范畴。1 9 8 6 年， c a r r o l l l 7 将内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内并不引起明显病害症状的 真菌，突出强调内生菌与植物的互惠共生关系，因此，在这个内生菌概念的范畴内不 包含植物致病菌和菌根菌。p e t r i n i ( 1 9 9 1 ) 【8 】把c a r r o l l 的概念范畴进一步扩展，将内 生菌定义为那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起 明显病害的菌，这个定义包括那些在其生活史中的某一阶段营表面生的腐生菌，对宿 主暂时没有伤害的潜伏性病原菌( 1 a t e n t p a t h o g e n s ) 和菌根菌。目前关于内生菌的概念 范畴还有争议 9 1 ，但在现有的内生菌研究中，p e t r i n i 提出的内生菌概念被广泛地接受。 一般研究中所涉及到的内生菌都是指内生真菌。 1 2 植物内生真菌的研究进展 1 2 1 植物内生真菌的生物学作用 ( 1 ) 促进植物生长发育 内生真菌对宿主植物的促进作用表现在种子发芽、幼苗存活、分蘖生长、花序、 生物量等多个方面( j o 】。c l a y 发现， 经内生真菌感染的黑麦草和高羊茅种子，其发 芽率均比相应未感染种子高1 0 左右，且感染和未感染的高羊茅种子中，饱满种子 所占比率分别为4 4 和1 9 ；其后c l a y 又对美国l o u i s i a n a 中部的高羊茅草场进行了 3 年的观察，结果表明感染植株的存活率比未感染植株高5 0 ，且产生的分蘖、花 序和生物量分别比未感染植株高5 0 、4 0 和7 0 【l l 】。 内生真菌促进植物生长的生理生化机制主要包括：影响感染植物体内的物质 代谢，提高植物的资源利用效率；产生生长素等激素类物质，促进植物的生长。内 生真菌对感染植株的氮代谢和氮积累有显著的影响，感染植株叶片和叶鞘中的可溶性 氨基酸总量、氨浓度增加，谷氨酰胺合成酶( g s ) 活性显著提高，植物对土壤氮的利用 效率大大增加【l2 1 。另外，内生真菌能够改变植物体中碳水化合物的源库关系，内生真 菌作为碳水化合物的一个储库，能迅速地将蔗糖转变成植物不能代谢的糖醇，从而减 少或阻止对光合作用的反馈抑制，促进植物的光合作用。c l a y d o n 等【1 3 1 从生长在含有 色氨酸的培养基上的一种瘤座菌( b a l a n s i ae p i c h l o e ) 中分离出吲哚乙酸及其它吲哚类 衍生物。因此，内生真菌可能通过改变植物体内的激素代谢，促进植物生长。 m c l e o d 等【“j 对内生真菌对黑麦草( l o l i u mp e r e n n e ) 、紫羊茅( f e s t u c ar u b r a ) 、高 羊茅( ，a r u n d i n a c e a ) 、草甸羊茅旷p r a t e n s i s ) 等植物生长调节作用的研究，发现这 种内生真菌对高羊茅和紫羊茅叶的鲜重和干重都有显著的影响，对草甸羊茅叶的鲜重 有影响。张集慧等( i 鄙从兰科金线莲( a n o e c t o c h i l u sr o x b u r g h i i ) 等药用植物中分离的5 种 内生真菌均能不同程度地产生一种或几种植物激素，其发酵液和菌丝体中可以提取到 赤霉素( g a 3 ) 、吲哚乙酸( i a a ) 、脱落酸( a b a ) 、玉米素( z ) 、玉米素核苷( z r ) 等5 种植 物激素。 ( 2 ) 增加宿主对环境胁迫的抗性 内生真菌对植物抗逆性的增益作用既表现在非生物胁迫( 如抗高温，抗干旱等) 方面，也表现在生物胁迫( 如阻抑昆虫和食草动物的采食、抵抗病虫害等) 方面。 p r e s t i d g e 等【i 刨观察到内生真菌感染的多年生黑麦草可以抵抗阿根廷象鼻虫 ( l i s t r o n o t u sb o n a r i e n s i sk u s c h e l ) 的侵袭。r e a d 和c a m p 【1 7 l 通过3 年的放牧实验观察 到受内生真菌感染的高羊茅的产草量比未受感染的高，尤其是在夏季干旱高温时期， 未受感染的高羊茅产量减少5 4 ，而受感染的仅减少4 。m a r k 和c t a y l l 8 1 进一步对 高羊茅的光合特性进行了研究，发现当叶温超过3 5 c 时，感染植株的光合速率比 未感染植株高2 0 2 5 。 有关内生菌提高宿主植物抗性的作用机制方面的研究报道较少。主要原因是一方 面，内生菌与宿主植物的相互关系十分复杂：另方面，内生菌长期生活在宿主植物 体内，生存环境相对稳定，研究者很难建立与内生菌生活相同或相似的环境模型，而 直接在植物活体上研究内生菌的作用机理又难以开展【1 9 1 。因此，目前关于内生菌增强 宿主植物抗逆性作用机制的研究结论多为推论性的或者是间接的。归纳有以下几个方 2 面：内生菌通过影响宿主植物的物质代谢并产生生理活性物质来改变植株的生理特 性，提高植物的抗逆性 2 0 l 。如香港城市大学的u r i j m o e d 教授等从中国南海红树上分 离出来的一株内生真菌可以产生灰黄霉素a 和多种醌类抗生素，对酵母菌和霉菌等 均有抑制作用【2 1 】；诱导宿主植物产生系统抗性( i n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e ，i s r ) 。 v a np e e 一2 2 j 等认为内生菌诱导植物产生的i s r 无病程相关蛋白( p r p ) 的积累，且能 诱导植物产生一些结构方面的抗性。陈世萍 2 3 1 等证明，在正常条件下，感染内生真菌 的黑麦草体内保护酶系统如p o d 、s o d 的活性明显高于未感染内生真菌的植株，并 认为内生真菌很可能增强了植物的s o d 活性调节能力，从而对植物的抗旱性产生了 有益影响：与病原菌竞争生态位点和营养物质。吴蔼民1 2 4 1 等认为，从棉株维管束中 分离出的内生菌作为一种能在植物组织中运转、对植物无害或基本无害的细菌，由于 它在植物体内有稳定的生存空间而对棉花黄萎病菌具有拮抗作用；一定数量的内生 菌及其诱导植物产生的酚类、醌类物质在细胞间隙的积累往往构成病原菌进入植物体 内或在植物体内运转的机械、化学屏障。 ( 3 ) 生物防治 人们在研究中发现，植物内生真菌并不引起宿主植物明显的病症【2 5 1 。有的内生 真菌在定条件下可成为拮抗菌。c l a y ，l a t c h 以及s i e g e 等的研究都表明， 在牧草 植物中，麦角菌科( c l a v i c i p i - t a c e a e ) 内生真菌对其非常有益，它们抑制对牧草植物有 害的昆虫和一些植物病原真菌 2 6 , 2 7 2 8 1 。c a r - r o l l 的研究也显示感染非牧草植物的内生 真菌可作宿主植物的保护性互依生物【2 9 1 。因此，植物内生真菌可作为培育抗虫和抗病 害的一类潜在的生物防治材料。 1 2 2 植物内生真菌及其次级代谢产物的多样性 ( 1 ) 植物内生真菌的多样性 内生真菌是一个多样性丰富的生物类群，普遍存在于目前已研究过的各种陆生及 水生植物中，具有分布广、种类多的特点，而且不同植物体内分离到的内生真菌数量 不同，少则十几种，多则近百种。在热带雨林植物中，内生菌的这种多样性更为突出。 a n o r l d 等【3 0 1 分析了巴拿马中部雨林中2 种植物叶子中的内生菌，结果发现分离自8 3 个健康叶片上的内生菌可有多达4 1 8 个形态学种，这些内生菌同时也表现如一定的宿 主专一性和地域专一性。现代分子系统学研究也表明，同一种内生菌往往还具有多 样化的遗传型l 引】。 根据内生真菌与宿主专一性分析，平均每种寄主有4 。5 种寄生菌，按地球目前已 知的2 5 万种植物计算，内生真菌的种类至少有1 o x l 0 6 。g a m b o a t 3 2 】等在研究内生真菌 时认为，由于目前我们对内生真菌了解的很少，对植物内生真菌的估计可能还比较保 守。内生真菌的生物多样性和存在的普遍性为内生真菌的研究提供了最基本的保证。 ( 2 ) 植物内生真菌次级代谢产物的多样性 3 植物内生真菌丰富的生物多样性直接决定了其代谢产物的多样性。研究表明， 植物，特别是药用植物内生菌是继土壤微生物、极端微生物、海洋微生物之后的又一 重要的微生物药物来源，从中寻找新的天然活性化合物是当前内生菌研究的热点之 一。目前，已从药用植物内生菌中分离出多种生物活性物质，包括抗菌、抗肿瘤、杀 虫、免疫抑制、抗氧化等具有特殊生物活性的天然化合物，其中不少是新的化合物， 具有特殊的生物学作用，主要作用综述如下。 植物生长调节类物质 内生真菌长期和宿主植物生活在一起，对植物的生长发育具有很重要的作用。研 究表明植物内生真菌可以产生或促进宿主植物产生某些植物激素。吴静萍【3 3 】等研究发 现密花石斛d e n d r o b i u md e n i f l o r u m 菌根菌能够产生g a 3 。张集慧f 1 5 】等研究证明会线莲 a n o e c t o c h i l u sr o x b u r g h i i 、铁皮石斛d e n d r o b i u mc a n d i d u m 、天麻g a s t r o d i ae l a t a 等兰科 植物内生真菌能够产生g a 3 、i a a 、a b a 、z 、z r 等植物生长调节剂。 抑菌类物质 现阶段，由于抗生素的大量使用，越来越多的人类病原菌产生了耐药性。并且随 着环境污染的日趋严重，人类时常会受到些新的病源性真菌或细菌的感染。植物内 生真菌作为一大类新的微生物资源，能产生多种具有不同抗菌活性的物质，对植物或 人类病原菌有抑制活性。s t r o b e lg 等从雷公藤( t r i p t e r i g e u m s i l f o r d i i ) 的茎中分离到一株 内生真菌( c r y p t o s p o r i o p s i sq u e r c i n a ) 能产一种肽类抗生素c r y p t o c a n d i n ，不仅能抑制 灰葡萄孢( b o t r y t i sc i n e r e a ) 等一些植物病原真菌，而且还能抑制白假丝酵母( c a n d i d a a l b i c a n s ) 等人类病原真菌。现已有几家公司准备开发此产品，用于真菌引起的指甲和 皮肤病的治疗1 3 4 】。l u h o n g 【3 5 】等首次从黄花蒿叫r 耙翮孥胁a n n u a ) 的茎中分离了刺盘孢 ( c o l l e t o t r i c h u ms p ) 内生真菌，该内生真菌能产生1 1 种化合物，其中有9 种化合物可抑 制枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l 捃) 、金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、藤黄八叠 球菌( s a r c i n al u t e a ) 和假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) 等细菌的生长；有4 种化合物在m i c s 达至0 5 0 - 1 0 0m g m l 时，可防治白色念珠菌( c a n d i d aa l b i c a n s ) 和黑曲霉似s p e r g i l l u s n i g e r ) 等真菌的危害。 抗虫类物质 内生真菌感染能提高农作物的抗虫性，这一观点已经得到广泛认同。在2 0 世纪8 0 年代早期，f u n k 等f 3 6 】首次报道内生真菌可以控制害虫的危害，发现长圆形拟茎点霉 ( p h o m o p s i so b l o n g a ) 可以保护榆属( u l m u s ) 树木免受美洲榆皮天牛( p h y s o c n e m u m b r e v i l i n e u m ) 的危害。k i n d l e r 等【3 7 】的研究表明，黑麦草的内生真菌对草地螟( l o x o s t e g e s t i c t i c a l i sl ) 有很好的控制作用，同时可以减轻阿根廷茎象( l i s t r o n o t u sb o n a r i e n s i s ) 的危害。兰琪等【3 8 l 从芦苇草( f e s t u c a a r u n d i n a c e a ) 和黑麦草中分离出的内生真菌已达6 个属，其中枝顶孢属“c r m o n i u m ) 菌类可以控制蚜虫的危害。f u r i l c 等f 3 9 】从胶冷杉翻确搿 4 b a l s a e a ) e o 分离到一株内生真菌，其液体发酵产物中分离的2 个二萜类活性成分，以6 t t m o l l 头生测，对枞色卷叶蛾( c h r i s t o n e u r a m m ) 的胃毒致死率分别为2 8 和3 2 ；从 北美落叶松( l a r i xl a r i d i n a ) 分离到的一株内生真菌，其发酵液中分离到1 种化合物 ( h o g e n e s 瞎) ，以4 0 0 p g g 生测，对枞色卷叶蛾的胃毒致死率为9 6 。j o h n 等h o 】从冬青 ( g a u t t h e r i a p r o c u m b e n s ) 中分离到一珠内生真菌，其发酵产物中含有两种5 羟基2 苯呋哺活性化合物，以o 8 p 头的剂量处理云杉蚜虫( c h r i s t o n e u r a f u m i f e r a n ac l e m ) ， 致死率可以达到3 6 。 抗癌类物质 a 紫杉醇( t a x 0 1 ) 及类似物 1 9 9 3 年，s t r o b e l 等从短叶红豆杉( t a x u sb r e v i f o l i an u r ) 的韧皮部中分离出2 0 0 余 种微生物，其中一株内生真菌( t a x o m y c e sa n d r e a n a e ) 能产生紫杉醇；1 9 9 4 年，邱德有 等( 4 1 1 从云南红豆杉( t a x u s y u n n a n e n s 括) 韧皮部中分离出8 0 多株真菌菌株，其中有一个 菌株具有产紫杉酵的能力：1 9 9 9 年，中山大学王伟等【4 2 】从南方红豆杉( 7 缸“jc h i n e n s i s v a r m a i r e i ) 韧皮部分离得到8 7 个内生真菌菌株，其中6 个菌株能分泌紫杉烷类化合物， 它们分别属于头孢霉属、轮柄梳霉属和无孢菌属等。他们指出，红豆杉内生真菌的存 在并同宿主一样具有产紫杉烷的能力可能不是个别现象。另外，在红豆杉树以外的树 种中，研究人员也分离到可产紫杉醇的内生真菌。s t r o b e l 等即从一种松树 ( w o l l e m i a n o b i l i s ) 中分离到一株产紫杉酵的内生真菌；l i 等【4 4 】从秃柏 ( t a x o d i u m d i s t i c h u m ) 的树皮、韧皮部和木质部中都分离出产紫杉醇的内生真菌。而其 它树种是否也能分离出产紫杉醇的内生真菌，还有待研究。至今已有数十株产紫杉醇 的内生真菌问世，充分证明具有生态多样性【4 5 1 。 b 长春碱( f u s a r i u mo x y s p o r u mv i n c r i s t i n e ) 长春碱是夹竹桃科长春花属多年生草本抗癌药用植物长春花( c a t h a r a n t h u s r o s e u s ) 的有效药用成分之一，具有抗肿瘤活性，但其在长春花植物体中是含量很低，而且长 春花生长缓慢，因此限制了其作为抗癌药物的进一步开发和利用。1 9 9 6 年以来，张 玲琪等【舶】从长春花植株中分离出2 l 株内生真菌，其中有4 株产长春新碱类似物，它 们分属于镰刀菌属( f u s a r i u m ) 、交链孢属( a l t e r n a r i a ) 和无孢菌群( m y c e l i as t e r i l i a ) 等。 c 喜树碱( c a m p t o t h e c i n ，c p t ) 喜树( c a m p t o t h e c aa c u m i n a t ed e c n e ) 是珙桐科乔木植物，也是我国南方特有的 树种，其喜树碱是迄今为止发现的唯一专门通过抑制拓扑异构酶i 发挥细胞毒性的天 然植物活性成分，具有抗癌特性【4 ”。但是喜树中c p t 含量也是很低的，陈贤星等 ( 2 0 0 3 ) 从喜树果实中分离、纯化得到5 株内生真菌，经摇瓶培养用薄层层析对其菌 丝体提取物进行分析后，初步发现其中一株可能产生喜树碱类似物【4 8 1 。 d 鬼臼毒素( p o d o p h y l l o t o x i n ) 早在汉代神农本草经中就有鬼臼的记述。民间主要用于蛇咬伤、癖疖肿毒、 跌打、风湿筋骨痛及气管炎等症。自从1 8 8 0 年，p o d w y s s o t z k i i 从美洲桃儿七的树脂 中分出结晶性成分鬼臼毒素，之后的一系列医学、生物学和化学研究，证明了鬼臼毒 素的抗癌活性【4 9 】。李海燕等从云南中甸采的桃儿七植株地下茎和根中共分到2 8 株真 菌，其中一株的培养物经检测，含有鬼臼毒素，但含量少。该菌经鉴定为曲霉属 口s p e r g i l l u s ) 黑曲霉群“n i g e r ) 的真菌【5 0 1 。 中华山荷叶( d i p h y l l e i as i n e n s i s “) 为小檗科( b e r b e r i d a c e a e g ) 鬼臼亚科 ( p o d o p h y l l o i d e a e ) 山荷叶属( d i p h y l l e i a ) 的多年生草本植物，也叫窝儿七或山荷叶。它 是我国特产的一种传统草药，其根状茎入药具有清热解毒、活血散瘀、消炎止痛的功 效1 5 ”。其根状茎等部位含有鬼臼毒素。刘仕平等【5 习从采自云南省中旬县的中华山荷 叶的根状茎中分离出可产生鬼臼毒素或其类似物的内生真菌。另外，郭仕平等 5 3 1 证明 了川八角莲某些内生真菌也能够产生鬼臼毒素。 e 球毛壳甲素( c h a e t o g l o b o s i na ) 球毛壳甲素是s e k i t a 等【5 4 5 l 于1 9 8 3 年新发现的抗癌化合物，为细胞分裂抑制剂。 2 0 0 0 年，张玲琪等首次报道了从美登木叶中分离筛选到一株产球毛壳甲素的内生真 菌，表明植物内生真菌也可产生与宿主不同的抗癌物质。 f ：其他抗癌类物质 王军等【驯从红树林内生真菌n o 2 5 3 3 分离到抗癌物质异香豆素( a v i e e n m i n a ) 。 张永杰等 5 7 1 从裸子植物中发现了抗肿瘤活性的内生真菌。研究还发现，植物内生真菌 含有多糖类化合物 5 8 - 5 9 ，这类化合物对癌细胞虽然没有直接杀死作用，但可以刺激 抗体的形成，即通过恢复和提高患者的免疫功能而发挥其抗癌活性，它与化合物联合 使用，还可减少化疗药物的毒副作用，从丽增加疗效。 其他类型代谢物质 植物内生真菌除有以上各种抗癌、抗菌、抗虫类等次级代谢产物外，还能代谢某 些具有特殊的功能和活性的酶类，比如几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶等等。s t a m f o r d t l 等 6 0 l 发现玉米叶子中的内生真菌链孢予囊菌s t r e p t o s p o r a n g i u m s p 在p h 8 0 的淀粉 - c z a p e k 培养基上可以高效产生耐热葡萄糖淀粉酶。s t r o b e lo 等【6 1 1 从一种具有免疫抑 制活性的中药植物中发现一种内生真菌f u s a r u m s u b g l u t i n a i l s ，它能产具有免疫抑制活 性的粘霉醇。另外，张玲琪等 6 2 删从德国莺尾防西g e r m a n i c a ) 的根状茎干片中分离到 1 4 株丝状真菌，其中1 株能代谢产香物质，其内生真菌为米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) ，经 鉴定此产香物质为莺尾酮( i r o n e ) 。顾爱国等【“】从苦皮藤( c e l a s t m sa n g u l a t u sm a x ) i 内生 真菌中分离得到麦角甾醇( e r g o s t e r i n ；e r g o s t e r 0 1 ) ，它是维生素d 2 的前体物。王梅霞【6 5 】 从银杏( g i n k g o b i l o b a l ) 内生真菌c o l l e t o t r i c h u ms p 中分离到黄酮类化合物，这类物质 具有多种药理功能。 6 从内生真菌代谢产物的多样性可以看出，内生真菌在筛选活性物质方面的巨大潜 力，但是同时也应该看到，植物内生真菌产生的活性物质离大规模的工业生产还有很 大距离，实现工业化生产的瓶颈是内生真菌产生的生物活性物质产量过低。开发利用 内生真菌资源，必须提高活性物质产生菌的筛选效率，建立科学的筛选模型，以获得 产量高的适合生产或研究用的菌株，并以传统的育种手段结合原生质体、基因工程等 现代育种技术，对已有菌株进行改造；探索发酵条件，优化生产工艺，最终为活性物 质产生菌实现产业化奠定基础吲。 1 3 石斛内生真菌的研究现状 石斛( h e r b ad e n d r o b i i ) 是兰科多年生附生草本植物，其药用部分是新鲜或干燥 茎，具有益胃生津、滋阴清热的功效 6 7 1 。石斛的种子极小、无胚乳，自然条件下需与 某些真菌共生才能萌发，很难栽培；而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低，加上 人为的过度采挖和破坏生境，其资源己濒临灭绝，被国家列为重点保护的药用植物之 一1 6 ”。虽然已有不少有关通过组织培养大量繁殖霍山石斛试管苗的研究报道，但试管 苗移栽成活率仍然较低，且生长缓慢，对大规模进行繁育造成了一定的困难。石斛在 其生活史中与内尘真菌的关系非常密切，其种子萌发和植株的生长发育都需要依赖与 之共生的内生真菌【6 9 1 ，因而研究石斛内生真菌及其与寄主植物的相互关系具有重要的 意义。 1 3 1 石斛内生真菌分离方面的研究 对石斛内生真菌的分离，主要集中于用石斛的根来分离与其共生的菌根真菌 ( m y c o r r h i z a ) 。且专门系统地进行石斛内生真菌分离鉴定的很少，到目前为止，专门 对石斛内生真菌分离的资料仅见郭顺星等【7 0 】从铁皮石斛和金钗石斛的根中分离得到 2 5 种内生真菌，4 种未鉴定，己鉴定的2 1 种内尘真菌分属担子菌 i b a s i d i o m y c o f i n a 和半知菌i - d e u t e r o m y c o t i n a 的1 2 个属。综合有关石斛内生真菌的分离鉴定资料，包 括在其他兰科植物研究中涉及到的相关资料表明，到目前已分离鉴定出的石斛内生真 菌( 主要是菌根真菌) ，主要属于担子菌亚门和半知菌亚门的1 7 个属( 见表1 ) ( 7 1 - 7 6 。从 表1 中可以看出，目前，对霍山石斛的内生真菌的分离还是一个空白。 表l 石斛内生真菌分类 t a b l e lt h et a b l eo nc l a s s i f i e de n d o p b y f i ef u n g io fd e n d r o b i u m 蛙n纲目科 厦 来游植物 担子茵溉订层曲纲 伞荫目伞断科小菇属铁皮石斛dc a n d l d u m ，盒锻石斛 半知翦弧门 d e u t e r m 廿c - o 无孢科丝核葫属i u l l z 钟m n l a 癌蘸根菌属e l 嗍l o r h t z , t 角馥根蕊羼。删，搿 念璩苗根趋属m o n l l i o p j 扫 丝孢纲丝孢目从梗孢科术霉羼t n c h o d c r m n h v p h o m y c m o n i l i a c e - - e t a l p a e 癌座孢目癌座孢科 t u b e r c u l at u b e r c r u l r l - a l e ja r i a c e a e 头孢霉属c e p h a l o s 蚀丝= 蓐属f u s o m a 短梗梭孢壤雕c h r o m o s 粘， l 耀压g l o r l c l o 轮枝撑属v e r t t o l l i u m 枝顶孢稀属a c r e m o n i u m 俦孢霉属c y h n d r i m 梭孢霉属f u s a m a 镰刀属f u a w r u m n n o b l l e 铁皮石斛 铁皮石斛 较皮石辫，盘锓石辫 敦瑰石斛d , c r e p p l a t u m 、翅梗石斛 n 咿”唧眠铁皮石斛，盒 覆石斛 铁皮石解 铁皮石斛 梳唇石斛n “。冒一h 帕枷 铁皮石解会镊石料 铀升秆新t h n n c o c k l t 铁皮石解 聚石斛珊e n k i n i l 骧石斛 箍楗石辫n 础帅s 。船删 岫轴石甜o g l b s o m i 齄孢纲黑盘孢目黑盘