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生物科学专业毕业论文范文 生物科学专业研究对象有生物科学家根据生物的发展历史、形态结构特征、营养方式以及它们在生态系统中的作用等将生物分为若干界下面是小编整理的生物科学专业毕业论文范文欢迎阅读 摘要：为探讨栀子(Gardeniajasminoides)果实中藏花素的合成机理克隆了栀子类胡萝卜素生物合成的关键酶八氢番茄红素合成酶(GjPSY)基因的全长cDNA结果表明推导的GjPSY氨基酸序列与双子叶植物来源的GjPSY亲缘关系较近采用HPLC检测栀子果实中的藏花素1含量为(3.961.48)mgg1在叶片中未检出通过RTPCR分析表明GjPSY在栀子叶片和果实中均有表达且表达水平一致因此推测GjPSY的转录水平与果实中藏花素1的合成无关 关键词：栀子;阿朴类胡萝卜素;藏花素;八氢番茄红素合成酶;基因表达 1材料和方法 1.1材料和试剂栀子(Gardeniajasminoides)植株培养于广东药学院采集栀子成熟叶片和花后16周的栀子果实果肉为橙色所有材料贮存于80CreatorTMSMARTTMcDNA文库构建试剂盒购自Clontech公司PrimescriptonestepRTPCR试剂盒购自TaKaRa大连公司藏花素1(Crocin1)的对照品购于SigmaAldrich公司乙腈、甲醇为色谱纯其它生化试剂等为分析纯 1.2藏花素1含量的测定以改良的HPLC测定栀子叶片和果实中藏花素1(Crocin1)的含量叶片和果实在液氮中研磨后以50%(V/V)的甲醇水溶液提取在超声处理30min后以10000g离心10min取上清液在20下贮存HPLC分析时上清液以0.45m滤膜过滤以DiamonsilTMC18(2)柱(250mm4.6mm,5m)(Dikma公司中国)分析梯度洗脱 仪器为Waters2995HPLC仪(Waters公司,美国)配备2996光电二极管阵列检测器检测数据分析图1Crocin的生物合成途径IPP：异戊烯焦磷酸;DMAPP：二甲基丙烯焦磷酸;GPP：香叶基焦磷酸;GGPP：香叶基香叶基焦磷酸Fig.1Biosynthesispathwayofcrocin.IPP:Isopentenyldiphosphate;DMAPP:Dimethylallyldiphosphate;GPP:Geranyldiphosphate;GGPP: Geranylgeranylpyrophosphate.第5期441以Empower2软件完成洗脱条件为：10%20%乙腈溶液(乙腈/水V/V)020min;20%50%乙腈溶液2025min流速为1mLmin1检测波长440nm目标峰通过与藏花素1对照品的保留时间和吸收光谱的比较而确定通过标准曲线确定藏花素1的含量共进行3次重复实验 1.3GjPSY基因的克隆以CTAB(Hexadecyltrimethylammoniumbromide)法提取栀子果实中的总RNA按照CreatorTMSMARTTMcDNA文库构建试剂盒的说明书从总RNA构建栀子果实的cDNA文库将获得的SMART双链cDNA克隆接入pDNRLIB载体并转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5 根据植物八氢番茄红素合成酶基因PSY的保守区设计简并引物F1：5ATHTGGGCNATHTAYGTNTGG3和F2：5RAARTTRTTRTARTCRTTNGCYTC3从cDNA文库的细菌裂解液中扩增PSY基因获得了GjPSY基因的中间片段将该片段回收并测序命名为GjPSYM根据GjPSYM片段序列分别设计5端特异引物GSP1：5GCGATACAACAATAGCGATGCCCATACAG3和3端特异引物GSP2：5GTGCAGGAGAACGGATGAGCTGGTT3配合文库构建试剂盒提供的5端和3端的质粒检测通用引物采用RACE方法从cDNA文库中获得GjPSY基因的5端和3端序列获得的片段分别命名为5GjPSY和3GjPSY将片段回收和测序并进行序列分析与GjPSYM拼接出GjPSY的全长cDNA根据全长GjPSY序列经过BLAST比对和开放阅读框(ORF)序列分析分别设计引物F1：5CGCCATTAATATGTCTGTCGCTTTGCTATGGGTTG3和F2：5ATGCTCGAGGGCCTTTGCTAGTGGAGATGATGTTCT3从cDNA文库的细菌裂解液中扩增得到GjPSY的ORF序列 1.4GjPSY基因的表达分析从栀子果实和叶片中分别提取总RNA采用PrimescriptonestepRTPCR试剂盒进行RTPCR分析反应所用GjPSY特异引物分别为F1：5GACATACTTGCTGGAAAGGTCAC3和F2：5GCTAGTGGAGATGATGTTCTTGG3以组成性表达的RPS251基因(40S核糖体小亚基蛋白251基因GenBank登录号：GU797554)为内参RPS251基因的特异引物分别为F1：5CAGAAGAAGAAGAAGTGGAGCAA3和F2：5TGGTAGCTCTGGTGTATATCTGC3RTPCR反应程序为：952min接着9430s5530s721min共30次循环最后72延伸7min扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 2结果 2.1栀子叶片和果实中藏花素1的含量使用甲醇水溶液提取栀子叶片和果实中的藏花素1提取液用于HPLC分析通过与crocin1对照品的保留时间和吸收光谱进行比较在果实样品中观察到crocin1峰在叶片样品中未观察到crocin1峰(图2)同时检测到果实中crocin1的含量为(3.961.48)mgg1 2.2GjPSY基因的克隆为了克隆GjPSY基因构建了栀子果实的cDNA文库以简并引物从cDNA文库中扩增得到GjPSY基因cDNA的中间片段GjPSYM长度为688bp接着通过5RACE获得了长度为1596bp的5GjPSY片段;通过3RACE获得了长度为956bp的3GjPSY片段将5GjPSY、GjPSYM和3GjPSY共3个片段序列进行拼接得到全长cDNA长度为1876bp根据全长序列从cDNA文库中扩增得到ORF序列(图3);经序列分析此全长cDNA含有1314bp的ORF5端非翻译区为393bp3端非翻译区为169bp命名为GjPSY(GenBank登陆号：HQ599860)预测GjPSY基因编码的蛋白质含有437个氨基酸分子量为49.3kDa等电点为8.82 2.3GjPSY的序列分析GjPSY的氨基酸序列经BLAST分析结果表明GjPSY与多种植物的八氢番茄红素合成酶的序列相似它们均含有两个保守的富含天冬氨酸的模体DXXXD这个模体被认为可通过Mg2+结合于底物的焦磷酸基团在八氢番茄红素合成酶催化两个GGPP分子缩合的反应中发挥重要作用 采用ClustalW2软件对相似度较高(相似度为55%93%)的18条来自多种植物的八氢番茄红素合成酶序列进高蓝等：栀子八氢番茄红素合成酶基因的分离及表达分析442热带亚热带植物学报第21卷行同源进化比对采用Mega4.1软件构建氨基酸序列的NJ(Neighborjoining)系统进化树用重复1000次的自展支持率(Bootstrap)检验各分支的置信值结果表明GjPSY与中粒咖啡的PSY最为相似与番茄和拟南芥PSY的相似度均大于来自禾本科的玉米及水稻的而在与玉米和水稻的各3种PSY的比对中可知GjPSY与PSY1最为相似而与PSY3关系最远 2.4GjPSY的表达分析分别提取栀子叶片及果实中的总RNA采用RTPCR法分析GjPSY的表达水平以组成性表达的RPS251为内参结果表明GjPSY的转录水平在叶和果实中表现一致 讨论类胡萝卜素是异戊烯类色素在植物的光合作用和光保护作用中发挥作用是人体中重要的营养物质是维生素A的前体由类胡萝卜素衍生的阿朴类胡萝卜素如藏花酸和藏花素既可作为色素使用也具有药用作用有研究表明藏花素和藏花酸具有防止动脉粥样硬化、抗炎、抗细胞增殖、预防视网膜变性、神经保护作用和改善胰岛素抵抗等作用八氢番茄红素合成酶是类胡萝卜素生物合成中的第一个限速酶PSY基因在单子叶和双子叶植物中广泛存在基因复制现象这个基因家族中各个基因的表达往往具有组织特异性或对环境胁迫等因素产生应答目前对多种植物的PSY基因的分离、表达及转基因植物的分析研究方兴未艾 番茄中有两个PSY基因：PSY1和PSY2它们均在幼苗、成熟叶片及果实中表达PSY1在幼苗和果实成熟后期的表达高于PSY2而PSY2主要在成熟叶片中表达推测PSY1是由PSY2经基因扩增产生的平行同源基因GjPSY的氨基酸序列与番茄的PSY2的氨基酸序列较相似(相似度达81%与PSY1的相似度为75%)并且在果实中的表达水平与叶中相近提示它不是与果实成熟相关的基因两个番茄PSY1突变体一个是W180*无义突变一个是一个氨基酸替换突变体P192L对它们果实中的类胡萝卜素的含量和比例进行了分析W180*的果实为黄色果肉直到成熟颜色都不发生变化代谢分析表明在果实中没有类胡萝卜素其PSY1蛋白失去活性证明PSY1是唯一在果实成熟过程中发挥作用的PSYP192L果实也为黄色直到破色期后的第3天才转为红色这是由于八氢番茄红素合成的减少造成番茄红素和胡萝卜素的积累延迟其PSY1蛋白的活性被抑制与GjPSY的氨基酸序列比对表明W180*发生突变的氨基酸对应于GjPSY的W204P192L突变体的氨基酸相当于GjPSY中的P216这两个氨基酸均在两个DXXXD模体之间且在多种植物的PSY中高度保守 木薯中的两个PSY基因在不同组织中的表达也不相同叶中PSY1和PSY2均有高水平的表达在根和花药中的表达水平均较低但根中PSY2的表达是PSY1的10倍另外木薯的PSY1可对高盐胁迫响PSY2中的单碱基突变导致的单氨基酸突变(A191D)可使木薯根中的类胡萝卜素含量提高20倍A191氨基酸位于两个DXXXD图4来自不同植物的18个PSY的亲缘关系图谱节点上的数字为重复1000次的自展支持率(Bootstrap)子叶和果实中GjPSY基因的转录水平等：栀子八氢番茄红素合成酶基因的分离及表达分析444热带亚热带植物学报第21卷模体之间的较保守的区域本研究中分析的来自12种植物的18条PSY氨基酸序列中A191均为丙氨酸GjPSY的氨基酸序列与木薯PSY2的相似度为76%与PSY1相似度为74%所以更接近PSY2但从以上与番茄和木薯的序列比对及表达分析还难以明确判断GjPSY的功能 玉米、高梁、小麦和水稻各有3个PSY基因都编码有功能的八氢番茄红素合成酶小麦中的3个PSY基因中只有PSY1与面粉的黄色素含量有关PSY2只获得了部分序列PSY3的启动子区存在可应答脱落酸ABA的顺式作用元件其PSY1的表达与籽粒中类胡萝卜素的积累正相关PSY2则与叶中类胡萝卜素的合成相关在叶中表达最多PSY3在未受到胁迫的叶中的表达比PSY1和PSY2低在根中稍多一点在外源ABA且受胁迫的根中3种PSY的表达均有增加以PSY3的增加最多即PSY3对ABA的反应远大于PSY1和PSY2与小麦的比较分析也难以判断GjPSY的种类和作用玉米的PSY1主要在叶片和胚乳中表达并与胚乳中类胡萝卜素的积累呈正相关关系;其PSY2的表达则与光诱导的脱黄化过程正相关;PSY3在根和胚乳中大量表达可被干旱、高盐和外源ABA处理所诱导水稻胚乳中不含类胡萝卜素3种PSY基因在胚乳中都无表达;而在进行光合作用的组织中3种基因都有表达 水稻的OsPSY1和OsPSY2在根和叶中的表达均高于OsPSY3其中OsPSY1和OsPSY2均受光调控OsPSY1表达最多OsPSY3不被光诱导但在根中的表达可被高盐或干旱所诱导通过分析水稻、玉米和拟南芥的PSY基因的结构及它们的启动子区认为OsPSY1是单子叶和双子叶植物的古老PSY基因的遗存OsPSY2和OsPSY3均是OsPSY1的平行同源基因因此我们推测GjPSY相当于玉米和水稻中的PSY1 参考文献 1MachidaK,OyamaK,IshiiM,etal.StudiesoftheconstituentsofGardeniaspecies:II.TerpenoidsfromGardeniaeFructusJ.ChemPharmBull,2000,48(5)