细菌素的研究与其在食品工业上的应用.doc

细菌素的研究及其在食品工业上的应用摘要：细菌素是一类具抑菌活性的蛋白质，可以抑制许多革兰氏阳性菌。本文概述了细菌的分类、与抗生素的区别、细菌素合成、其抗菌机制以及在食品工业中的应用。关键词：细菌素；食品防腐剂；分类；合成；抑菌机制；应用Research on bacteriocins and its Application in FoodLIU Wen-duo (Zhongkai University of Agriculture and Engineering College of light industry and food science, Guangdong Guangzhou 510225)Abstract: Bacteriocins are antibacterial produced by bacteria that can kill or inhibit the growth of some ba cteria.This article gave an overview of the classification,difference with antibiotics,synthesis mechanisms and antibacterial mechanisms,and its application in the food industry has done a classification description. Finally,through the analysis of the current situation this paper also discussed the future development of bacteriocins.Key words: bacteriocin;food preservative;classification;synthesis;antibacterial mechanism;application细菌素（bacteriocin）是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物，其抑菌范围不局限于同源菌，产生菌及其细菌素有自身免疫性。其中有些作为发酵菌种的细菌素对动物无毒副作用，无抗原性。其抑菌范围广，可以杀死或抑制食品中的一些腐烂菌与病原菌，并有一定的热稳定性，延长了食品的保质期，同时不破坏食品的风味与组织状态1。细菌素最早是在20世纪中期Gratia（1946）对大肠杆菌V菌株抑制菌株现象进行研究时发现的。以后Gratia与Fredericq对大肠杆菌V菌株产生的这种抑制物质进行了分离，并称为大肠杆菌素。以由于很多细菌都可以产生类似物质， Jacob（1953）将这类物质称为细菌素2。细菌素具有无毒、热稳定性强、水溶性好、抗菌性强、不影响食品风味等优点。细菌素用作食品保存与医疗工程具有巨大潜力，因为它们可以补充或取代目前使用的抗生素3。细菌素在分子遗传、基因工程、蛋白质工程、食品添加剂与微生态制剂等方面有很好的应用前景，尤其在食品工业中越来越受到重视并且陆续被许多国家所接受。1 细菌素的化学成分细菌素是一种成分非常复杂的物质。其化学成分复杂多样，但它们都有一个相同的构件，一种必需的蛋白质。确定细菌素分子化学组成的常用方法是用特定的酶做敏感性试验是。检测出的streptocin STH1被认为是一种由必需蛋白、脂质与磷酸基团组成的复杂分子4。化学分析表明，许多细菌素可能就是简单的蛋白质。但是很多其他的细菌（葡萄球菌，梭菌与乳酸菌）的细菌素，在纯化状态下，它们是十分复杂的分子，除了蛋白质外还包括一些脂质与糖类等。丁酸梭菌素与产气荚膜梭菌素表现出两亲性蛋白，已经有报道说明它们的疏水基团能够促进它们与靶细胞膜的接触5。2 细菌素的分类6细菌素按其化学结构与热稳定性可分为3大类：第一类（class）定义为羊毛硫抗生素（lantibiotics）。这类细菌素分子量小于5 ku，属于多肽分子，具有1950多个氨基酸不等，并且在分子活性部位有大量稀有氨基酸。class还可以分成两个亚类：classa与classb。前者具有结构柔软、带正电与具有疏水肽的特点，可在目标细胞膜上形成孔洞而起作用；后者是一种球状多肽，结构刚硬并且不带电或带负电荷。第二类（class）指那些细菌生产的小的热稳定的非修饰肽（SHSP），class还可进一步的划分为classa与classb，classa包括小球菌素状的抗李氏杆菌活性多肽，具有保守的N端序列Tyr-Gly-Asn-Gly-Val及两个半胱氨酸在肽的N末端形成S-S桥；classb是由两个必需的不同多肽结合而成的寡聚体，能被硫醇激活,活性基团要求有还原性半胱氨基残基。第三类（class）细菌素是那些大分子的不稳定性蛋白（LHLP），它们的分子量大多都大于10 ku。除此之外，还有一些复合细菌素，它们是由多肽与其他非肽类基团结合而形成的细菌素。3 细菌素与抗生素的区别抗生素（antibiotics）是微生物在代谢过程中产生的，在低浓度下就能抑制它种微生物的生长与活动，甚至杀死其它微生物的化学物质7。过去人们经常会把细菌素与抗生素混为一谈，由于我国明确规定禁止在食品中添加抗生素，因此，这样会在一定程度上影响了细菌素在食品工业上的合法应用。传统的多肽抗生素是由细胞多酶复合体催化形成的，不存在结构基因，而细菌素由基因编码，可以通过基因工程的手段加以改造。它们的合成及作用模式与临床使用的抗生素亦不同。此外，对抗生素显示抗性的微生物通常不对细菌素显示交叉抗性，且与抗生素的抗性不一样，细菌素抗性通常不是由遗传决定的8。两者的具体区别见表1。表1 细菌素与抗生素的区别特性细菌素抗生素应用领域食品、农业临床产生机制染色体编码、核糖体合成次级代谢产物抑菌机制在靶细胞膜上形成孔道，导致细胞内容物外泻影响菌类某一种或多种代谢机能抑菌谱窄谱变动谱免疫原性有无毒性未发现有靶细胞耐受性无有抗药性4 细菌素的合成通过对细菌素基因序列的测定发现，编码活性细菌素的基因分布在操纵子簇上。研究者对控制产生基因lantibiotic的操纵子已经有了很好的研究，在许多lantibiotic操纵子序列中发现了同源基因。绝大多数表征lantibiotic的操纵子属于Classa。属于Classb的mersadicin基因序列已经被完全测定出来9。许多基因转录属于Classa的蛋白质类似物。基因编码产生细菌素既可以位于染色体上，也可以在质粒或转座子中。具体来讲，生物体调控基因编码结构蛋白，结构蛋白可协助加工抑菌活性成分，调节蛋白还可以协助细菌素穿过细胞膜而对宿主本身免疫10。所有类别的细菌素都是由核糖体合成的，只有Class是翻译后修饰形成的活性细菌素分子。抗生素不同于细菌素，它不是核糖体合成的，一般被认为是微生物产生的次级代谢产物。虽然有的抗生素（vancomycin）是由氨基酸组成的，但是它们都是酶合成的11。事实上，许多抗生素的合成是通过一种多载体机制合成的，通过把肽装配成氨基酸而形成抗生素分子。因为细菌素是由一个结构基因编码，所以活性位置与结构及功能的关系可以借助基因操作而更容易测定。现代分子技术已经能够通过增强蛋白活力或者改变特异性来构造与评估细菌素类似物。不同于抗生素，它们必须是化学合成或者通过复杂的基因工程增加相关基因的数目来合成。5 细菌素的抑菌范围12细菌素通常由革兰氏阳性菌产生并可以抑制其它的革兰氏阳性菌，如乳球菌、 葡萄杆 菌、 利斯特氏杆菌等，对大多数的革兰氏阴性菌、 真菌等没有抑制作用。对于第一类细菌素可以抑制许多革兰氏阳性菌，如Nisin抑制葡萄球菌属、 链球菌属、小球菌属与乳杆菌属的某些菌种，抑制大部分梭菌属与芽孢杆菌属的孢子；嗜酸乳杆菌与发酵乳杆菌产生的 细 菌素对乳杆菌、片球菌、明串球菌、乳球菌与嗜热链球菌有抑制作用。但有研究发现，Nisin与螯合剂(如EDTA) 连接后，改变了靶细胞壁的渗透性，可以抑制一些革兰氏阴性菌，如 Ec o l i与 Salmonella sp；或将Na P O与 Nisin结合使用， 可以提高革兰氏阴性菌对Nisin的敏感性。而部分非羊毛硫抗生素其抑菌范围。6 抗菌机制只要证明一种新型的防腐剂是否安全有效，最关键的是要确定对抑制靶细胞的生长繁殖是否有较长的效力。已经证实，细菌细胞表现出对多种抗生素的耐受性，并且能够在各代细胞之间传递。虽然细菌素不是抗生素，但是令人担忧的是使用细菌素可能致使细菌对抗生素更具有抵御能力。由于细菌素与抗生素的抑菌机制不同，Tchikindas13已经证明使用Nisin不会影响抗生素（氨苄西林与氯霉素）对于L.monocytogenes Scott A的抑制率。另一项研究证明，用400 IU/mL的Nisin处理一些多重耐药的细菌，这些细菌的细胞仍然对Nisin有很高的敏感性14。尽管Nisin对细菌的抑制作用与其他抗生素基本不存在交叉耐药性，但是仍然有必要搞清楚它的耐药机制以免意外发生。细菌对抗生素的耐受性是由其基因决定的，所以这种耐受机制普遍存在于细菌的各种类系中。与抗生素不同的是，细菌素的抗菌机制是细菌素对靶细胞的胞膜发生改变。对于像李斯特菌那样含C15C17较低的坚硬细胞膜，会对Nisin产生较强的耐受性15。同时也发现，Nisin能够通过其拮抗作用大量降低李斯特菌磷酸酰甘油，双磷酸酰甘油与二磷脂酸甘油的含量16。从另一个层面说，细菌素是作用于靶细胞膜，导致膜通透性增大，致使细胞内容物外泻而死亡。7 细菌素在食品工业中的应用7.1 肉类与海鲜制品发酵型肉类产品在成熟过程中发生的变化可以抑制单增性李斯特菌的生长（肉类发酵在短时间内的干燥过程可以产生少量酸而抑制李氏菌的生长）。然而，熏肉在快速成熟过程中李斯特菌在特定的条件下还是可以使环境温度升高并且减缓酸的产生。在熏肉中接种能产生抗李斯特菌素的细菌，经过一段时间后测定pH为5.7，李斯特菌含量水平明显降低17。研究发现，在其他发酵肉类成熟的过程中加入一定量的李斯特菌与产生抗李斯特菌素的细菌，也能明显抑制李斯特菌的生长繁殖。但是，在没有细菌素加入的条件下，很多李氏菌被抑制的主要原因是由于pH的降低。人们利用细菌素的抑菌机理在4下对真空包装小熏肠与法兰克福香肠进行保藏，这两种食品的保藏方法是袋装产品与散装产品在加工后防止污染的保藏模式。研究证明，在法兰克福香肠中加入107 cfu/g的片球菌能够延长60 d的保质期，但是如果在不添加片球菌的条件下致病菌会从104cfu/g增加到106 cfu/g18。细菌素另外一个保鲜应用在海鲜产品中，比如虾类。虾类一般采用山梨酸钾或苯甲酸钠来延长其货架寿命。Einarsson and Lauzon19向虾类产品中加入3种不同的细菌素，发现只有Nisin Z对虾类产品有明显的保鲜作用，并且比没经过处理的产品货架寿命从10 d延长到了31d。而其他两种细菌素没有明显效果。然而最有效果的防腐剂还是那些苯甲酸钠或者山梨酸钾之类的化学防腐剂，它们在质量分数0.05%0.1%下能够保存到59 d之多。7.2 乳制品在奶酪制品中，硝酸盐常被用来抑制产气与产酪酸的酪丁酸梭菌及其他梭菌，防止“late blowing”现象。在巴氏杀菌后的涂抹型干酪中加入一定量Nisin能够有效抑制梭状芽孢杆菌的孢子，从而能够替代硝酸盐19。李斯特菌也能引起奶酪制品的污染，特别是在奶酪成熟时pH升高的过程中，如意大利的塔雷吉欧干酪、戈尔根朱勒干酪、莫扎里拉奶酪。Giraffa等20阐述了在塔雷吉欧干酪生产过程中抗李斯特菌细菌素的稳定性与其产生菌粪肠球菌之间的关系。将粪肠球菌作为培养菌加入到原料乳中，其产生的细菌素不会影响到耐热粪肠球菌本身的活性。L.lactis产生的细菌素能够控制莫扎里拉奶酪加工后的污染。研究发现，向热处理后的莫扎里拉奶酪里加入L.lactis后包装成小袋，过一段时间后测定李斯特菌含量，结果表明李斯特菌数量比开始时有明显下降。在5下保存2周3周，测试样品的李斯特菌数量大大低于没有添加生物防腐剂的样品。7.3 蔬菜类制品细菌素的防腐功效在蔬菜制品保鲜中也发挥着强大的潜力。特别是乳酸菌素LAB对成品沙拉与发酵蔬菜的防腐能力。Vescovo等21将细菌素LAB加入到混合蔬菜沙拉中，一段时间后发现即食沙拉中的细菌数量有所下降。还有研究发现，将能产生细菌素的菌投入到德国泡菜与橄榄制品中可以有效抑制微生物的生长。而且，细菌素的使用基本不会影响到食品的原有风味。生物防腐剂的用途也被用来在朝鲜传统泡菜（发酵白菜制品）中防止李斯特菌的污染。研究者用2种细菌素分别加入到朝鲜泡菜中，结果发现L.sake Lb 706产生sakacin A在14的条件下对李斯特菌没有影响，而由P.acidilactici M分泌的细菌素对李斯特菌的数量有显著而快速的影响，后者能在发酵16 d内抑制李斯特菌的生长22。8 展望细菌素作为一种新型的生物防腐剂已经以崭新的姿态向我们证明了它的功效。但是，目前所了解的细菌素种类有限，提取成本太高，安全性尚未完全测定，只有乳酸菌素是唯一纯化后能在商业上使用的细菌素，国内外仍然主要将化学防腐剂使用在食品工业中。所以，如何解决微生物防腐剂替代化学防腐剂是当前的热门问题。首先，化学防腐剂与微生物防腐剂的复合使用可以降低单纯使用细菌素的成本，而且两者的协同作用可以更有效的抑制病菌。其次，从自然界中筛选不同的野生菌种来开发出新的细菌防腐剂。通过运用优良的筛选与育种方法得到高产菌株是现在细菌素工业中最主要的任务。另外，运用基因工程技术来制造高产稳定的基因工程菌也是一种规模化生产细菌素防腐剂的出路。细菌素的开发前景十分广阔，不只局限在食品工业中，而且可以开辟更多的应用领域，如医药行业等。参考文献1 郝纯,常忠义,高红亮,等.天然食品防腐剂-细菌素的研究新进展J.食品科学，2005，25(12)：193-1972 Christelle Richard，Raquel Ca on，Karim Naghmouchi，et al. Evidence on correlation between number of disulfide bridge and toxicity of class IIa bacteriocinsJ.Food microbiology，1972，23(2):175-1833 Richard Schlegel，Hutton D Slade.Bacteriocin production by transformable group H streptococciJ.Bacteriol，1972，112(2)：824-8294 Clarke，D J Moyra Robson,R Morris.J G Purification of Two Clostridium Bacteriocins by Procedures Appropriate to Hydrophobic ProteinsJ.Antimicrob agents chemother，1975，7(3)：256-2645 王镜岩，朱圣庚，徐长法，等.生物化学(上册)M.3版.北京：高等教育出版社，2002:5236 刘翀，杨洋.安全的天然食品防腐剂细菌素J.食品科学，2004，26 (7)：521-2557 Zhang，S，Mustapha,A.Food Prot J,1999，62 ,1123-1271 8 许杨,孙红斌,谢俊杰.微生物学通报J,1998，25(2):104-1069 Karsten Altena，AndrGuder，Claudia Cramer，et al.Biosynthesis of the Lantibiotic Mersacidin:Organization of a Type B Lantibiotic Gene ClusterJ.Applied and environmental microbiology，2000，66 (6)：2565-257110 Klein，C Kaletta,C Entian.K D Biosynthesis of the lantibiotic subtilin is regulated by a histidine kinase/response regulator systemJ.Appl Environ Microbiol，1993，59(1)：296-30311 Robert E W Hancock,Daniel S.Chapple.Peptide AntibioticsJ. Agents chemother，1999，43(6)：1317-132312 Tchikindas M，Cleveland J，Li J，et al.Unrelatedness of nisin resistance and antibiotic resistance in Listeria monocytogenesM. Milwaukee：Program,Abstract Book IAFP，2000：5513 E Severina，A Severin and A Tomasz.Antibacterial efficacy of nisin against multidrug-resistant Gram-positive pathogensJ.Antimicrob chemother，1998，41(3)：341-34714 Mazzotta A S，Crandall A D，Montville T J.Nisin resistance in Clostridium botulinum spores and vegetative cellsJ.Environ Microbiol，1997，63(7)：2654-265915 Ming Xintian，Daeschel Mark A.Nisin resistance of foodborne bacteria and the specific resistance responses of Listeria monocytogenes Scott AJ.Journal of food protection，1993，56(11)：944-94816 U Schillinger，M Kaya，F-K Lcke.Behaviour of Listeria monocy togenes in Meat and Its Control by a Bacteriocin-producing Strain of Lactobacillus sakeJ.Journal of applied bacteriology，1991,70(6)：47817 Berry E D，Hutkins R W,Mandigo R W.The use of bacteriocin producing Pediococcus acidilactici to control postprocessing Listeria monocytogenes contamination of frankfurtersJ.Journal of foo