药物的体外抗菌试验 第十九章.doc

第十九章药物的体外抗菌试验 教学要求 .（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。 .（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。 .（三）了解体外抗菌试验的影响因素。 第一节常用的体外抑菌试验 一、药物的体外抗菌试验 .又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。 .最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。 .优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。 .缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。试验菌 .细菌、霉菌和酵母菌常用 .标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。 .临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。控制培养时间。 .接种菌量的多少的计算 培养基 .根据试验菌的营养要求进行选择 .培养基质量控制 供试药物 .药物的浓度和总量要精确配制 .供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。 .中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度 对照试验 .试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长 .已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。 .溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用 （一）连续稀释法 .方法：液体法和固体法。 .用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。 .抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长 .杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。 1、液体培养基稀释法 .方法：两倍稀释法 .步骤：液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每管加入一定量试验菌 24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。 液体稀释法图解抗菌药物的浓度增加最低抑菌浓度移种平板最低杀菌浓度图20-1液体培养基连续稀释法 .优点：能与药物充分接触，结果更具有精确性和可重复性。 .缺点：药液和培养基的混合物若不澄清，无法直接观察结果，需进一步试验才能确定MIC值。 杀菌曲线 .选择适当的药物浓度，取适量于无菌试管中，加入试验菌液，使各试管菌浓度约为 105CFU/ml。 .一定间隔时间内将试验管充分混合后取样并稀释，用平板法进行活菌计数，绘制活菌数的对数-时间曲线。 2、固体培养基稀释法 .（1）平板法 .方法：系列浓度的药物混入琼脂平板，用微量加样器或多点接种仪接种试验菌。 .用途：用于各种药物的抗菌活性测定及新抗菌药物的筛选。特别适合于非酵母样的真菌药敏试验及颜色深、澄明度差的样品的抗菌作用测定。 .优点：在一组平板中测定多种试验菌的 MIC，不受药物颜色及浑浊度的影响；容易发现污染菌。 .缺点：不易进行再培养而确定MBC。 .（2）斜面法 .方法：不同浓度的药物混入培养基中制成斜面，于斜面上接种一定量的试验菌，观察其 MIC值。 .用途：用于需长时间培养的试验菌（如TB）或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。 .优点：不受药物颜色及浑浊度的影响；容易发现污染菌。 .缺点：不易进行再培养而确定MBC。 （二）琼脂扩散法 .定性试验 .基本方法：利用药物可以在琼脂培养基中扩散的原理，将试验菌加入琼脂培养基，混合倾注平板或用L棒使试验菌均匀分布，然后加药于含菌平板，培养18-24小时后，根据抑菌圈或抑菌范围大小初步判断抑菌作用的强弱。 .用于细菌和酵母菌的药敏试验 1、滤纸片法含药物的滤纸片含菌平板抑菌圈37培养K-B法 .基本原理：滤纸片法，但需用统一的培养基、菌液浓度、纸片质量、纸片含药量以及其他试验条件。 .结果判断：卡尺精确量取，根据抑菌圈的直径大小判断该菌对该药物是抗药、中等敏感或敏感。 .打孔并注入药液代替滤纸片含菌平板药液3、管碟法 .小管（玻璃管、铝管、钢管）放于含菌平板上，小管内加入药液，根据抑菌圈直径判断抗菌效力。含菌平板小管药液4、挖沟法 .于无菌平板上挖沟取出琼脂条，沟内加入药液，然后在沟两旁接种几种试验菌。.适用于一药多菌的测定。ABC 1 2 3 4 5药液细菌菌苔接种的细菌琼脂扩散法特点 .优点：简单、快速、可同时进行多样品或多菌株的研究。 .缺点：粗糙、重复性差、干扰因素较多，只用于抗菌药物的初筛。 第二节杀菌试验一、最低杀菌浓度或最低致死浓度的测定 .最低杀菌浓度：指该药物能杀死细菌的最低浓度。从对微生物广义而言，也可称之为最低致死浓度（ MLC）。 . MBC（或MLC）的含义也可定义为: 在一定条件下，使绝大多数微生物被杀死，但允许有最少量微生物存活的药物最低浓度。 .将待检药物先以合适的液体培养基在试管内进行连续稀释，每管内再加入一定量的试验菌液，培养后可得该药物的 MIC，取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别移种于另一无菌平板上，培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度即为该药物的MBC（或MLC）。 图 20-1液体培养基连续稀释法 .进行实验时，在药物连续稀释后，每管内加入定量实验活菌液（105-106细菌/ml）。培养后从肉眼观察无菌生长的试管内各取培养液0.1ml或0.01ml涂布于平板上测定存活菌数，以使99.9%微生物致死的药物最低浓度为MLC，即在一定条件下，存活的菌数不多于原始接种数的0.1%。 二、活菌计数（viable counting method） .是在一定浓度的定量药物内加入定量的实验菌，作用一定时间后，取样进行活菌计数，从存活的微生物数计算出药物对微生物的致死率。 方法 .取实验菌与药物作用后的混合液，经稀释后取定量混入琼脂培养基，倾注成平板。培养后计数长出的菌落数或菌落形成单位（CFU）。再乘以稀释倍数，即可得药物稀释后每毫升内存活的细菌数或CFU。 三、苯酚系数测定法（phenol coefficient） .又称酚系数法，是以苯酚为标准，在规定的实验条件下，作用一定时间，将待测的化学消毒剂与苯酚对伤寒沙门菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较，所得杀菌效力的比值。 .苯酚系数是了解消毒剂杀菌效力的一种方法。 .苯酚系数 =消毒剂的杀菌稀释度/苯酚的杀菌稀释度苯酚系数大于或等于2为合格。 .举例：将苯酚准确稀释为1：90、1：100，、等；待测消毒剂准确稀释 1：150、1： 170、。分别取上述稀释液各5ml（10ml）加入一系列无菌试管中，置于20恒温水浴，使反应保持在20以下进行。各管内再加入伤寒沙门菌培养液各0.5ml,立即开始准确计时,在加菌后5、10、15分钟，分别从管中取一接种环的混合液接种于一支5ml（或 10ml）的肉汤培养基中，培养一定时间后，观察并记录结果。 . +为有菌生长， -为无菌生长。 .根据5分钟不能杀菌，10分钟能杀菌的最大稀释度为标准来计算，则： .苯酚系数=250/100=2.5 .或根据三个相同杀菌结果的稀释度比值的平均值来计算,则: .苯酚系数 =(225/90+250/100+275/110)/3=2.5 .苯酚系数愈大,则被测消毒剂的效力愈高。 .苯酚系数的应用有一定局限性,因为某一消毒剂对伤寒沙门菌的苯酚系数的大小并不能完全代表它对其他细菌作用的强弱。 苯酚系数法还有以下缺点 1)有机物存在时消毒剂失去活性; 2)消毒剂可能对组织有毒性; 3)随温度变化而影响测定结果 ; 4)只适用于同类消毒剂的杀菌效力测定,对非酚类、季铵盐及不稳定的次氯酸盐等均不能给予正确评价. 第三节联合抗菌试验 .抗菌药物联合应用的效果有四种： .协同作用：加强药物抗菌作用 .拮抗作用：减弱药物抗菌作用 .累加作用：作用为两者之和 .无关作用：相互无影响 .常用方法：棋盘稀释法和琼脂扩散纸片法 一、纸条试验（paper strip test） .即在已接种实验菌的平板表面垂直放置两条浸有一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或无影响来判断它们在联合应用时的效应。 二、琼脂扩散纸片法 .含不同的两张滤纸片，放于平板表面，间距约3-5mm。培养后，按各自抑菌圈形状，来判断两种抗菌药物联合时对受试菌株的作用情况。 协同作用甲乙甲乙甲乙两药抑菌环交界角平直细菌对甲药不敏感，乙药抑菌环向甲药扩大甲乙无抑菌作用的两药之间出现抑菌环累加作用甲乙甲乙两药抑菌环交界角钝圆无关作用甲乙甲乙甲乙细菌对两药均耐药细菌对甲药耐药，对乙药敏感，抑菌环交界角尖锐细菌对甲、乙两药均敏感，抑菌环交界角尖锐拮抗作用甲乙甲乙细菌对甲药耐药，对乙药敏感，甲药对乙药发生切割状拮抗现象细菌对甲、乙两药均敏感，乙药使甲药的抑菌环呈扁圆形三、梯度平板纸条试验（paper strip-gradient plate test） .含药的梯度平板的制备: .先将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜置待凝，再将平板放置水平，加入含抗菌药物的琼脂培养基。在重叠的双层平板中含有梯度浓度的抗菌药物，自高浓度（ +）至低浓度（ -）依次递减。 .将实验菌悬液涂布于平板表面， .取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板中药物浓度递减的方向置于平板表面。 .培养后，如待检药液对平板的药物有加强作用，则可见纸条两端的抑菌区被扩大。 三、棋盘格法 .含两种不同浓度药物的试管或平板排列呈棋盘状而得名。 .方法：分别测定联合药物各自对被检菌的 MIC，以确定药物联合测定的药物稀释度。选择6-8个稀释度，每种药物最高浓度为其MIC的2倍，然后分别依次倍比稀释到其MIC的1/8-1/32。 2.0 1.0 0.5 0.25 0.12 0.06 0+ 0.25/ 0.50 -2.0/0 B A0 0.06 0.12 0.25 0.50 1.0 2.0 液体棋盘稀释法的药物浓度编排 部分抑菌浓度 FIC 也称联合抑菌分数，指某一药在联合前后所测得的MIC比值，可根据FIC指数来评价两抗菌药物联合作用时所产生的效果。 如二待测药为A、B，则 A药与B药联合试验时A药的MIC ；FIC（A）= A药单独试验时的MIC B药与A药联合试验时B药的MIC ；FIC（B）= B药单独试验时的MIC所谓FIC指数，指二药各自的FIC之和，即 FIC指数= FIC（A）+ FIC（B） FIC指数与联合抗菌效应 FIC指数0.75协同作用 FIC指数0.75-1累加作用 FIC指数1-2无关作用 FIC指数2拮抗作用 FIC指数越小，则联合抗菌作用越强。 四、药物的体内抗菌试验 .在体外测定药物抗菌作用的同时，需进一步了解药物对试验感染动物是否有疗效，以确定体内抗菌效果。 .方法：将临床分离致病菌注入动物体内或感染外伤部位，使动物感染发病或死亡，选用能引起小鼠全部死亡的最小菌悬液浓度即最小致死量（MLD）作为感染量；感染后再用欲测药物以不同剂量或不同给药途径进行治疗，同时试验对照组以生理盐水代替药物进行给药。 第四节体外抗菌试验的影响因素 1、试验菌 .应用标准菌株。标准菌株来自专门的供应机构。 .我国由北京卫生部生物制品检定所菌种保藏中心供应。 .在特定条件下，有时需用临床新分离菌株。 .试验菌加以合理的保藏，使用前应加以纯化及必要的生物学特征鉴定。 2、培养基 .质量需加以控制； .原料、成品的外观及性能应符合要求，经无菌检查合格后使用。 3、抗菌药物 .药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的结果，需要精确配制； .固体药物应配制成溶液使用，有些不溶于水的药物需用少量有机溶剂或碱先行溶解，再稀释成合适浓度，如氯霉素及红霉素需用少量乙醇溶解； .药液的PH值应尽量接近中性，使能保持药物的稳定性而又不致影响试验菌的生长；中药制剂中含有鞣酸，且具有特殊色泽