（应用化学专业论文）对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 双光子荧光显微镜是生物活体组织成像的一个极其重要的工具，愈来愈受到人们的 重视。设计和合成双光子吸收截面大和上转换荧光强的有机分子能大大促进双光子荧光 显微成像在生物系统中的应用，其应用包括：单分子检测、免疫测定、d n a 片断测定、 化学和生物传感器、生物微芯片、毛细管分离检测等。双光子荧光分子能避免由单光 子荧光分子产生的诸如荧光漂白、光致毒和生物自发荧光干扰等缺陷，并且兼具定靶激 发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低荧光损耗等优点。双光子成像显示了无与伦比的 优越性，为探索生命体中各种客体的作用机制提供了强有力的工具，促进生命科学与医 药科学的研究与发展。 合成了一系列a a - a 和d a - d 结构的2 ，5 二氰基1 ，4 二苯乙烯基苯类双光子荧 光染料，就端位取代基对染料双光子吸收截面及其溶解性的影响进行了详细研究，端位 氨基能显著提高染料的双光子吸收截面、溶解性能和荧光量子产率，并能较大地红移染 料的荧光发射波长。 首次将两个氰基引入到d - r - a 结构的二苯乙烯类的受体端，一是扩展兀共轭电子体 系，提高双光子吸收截面及荧光量子产率：二是增加受体端的拉电子能力，以提高激发 态偶极矩，即激发态分子内的电荷转移程度，增大分子的倍频效应，显著地提高双光子 吸收性能；三是降低分子的对称性，有助于生成非中心对称的空间群，保证激发态较大 的偶极矩。同时在分子的另一端引入氨基，通过氨基与氰基的协同作用，实现分子的强 双光子吸收。一是扩展兀共轭电子体系，提高双光子吸收截面及荧光量子产率；二是增 加受体端的拉电子能力，以提高激发态偶极矩，即激发态分子内的电荷转移程度，增大 分子的倍频效应，显著地提高双光子吸收性能； 设计合成了一系列d 兀- a 和a - 兀- a 结构的双氰基二苯乙烯类双光子荧光染料，研究 了端位取代基对双光子吸收截面及光物理性质的影响，端位氨基能显著提高染料的双光 子吸收截面和荧光量子产率，并能较大地红移荧光发射波长，双氰基二苯乙烯类染料显 示了很大的双光子吸收截面。 合成了一系列d - a - d 和d 以结构的双光子金属阳离子探针，对它们的离子识别 选择性，紫外可见滴定、单光子荧光滴定、双光子荧光滴定及双光子吸收截面进行了 研究，可以借助这些双光子荧光探针对某些金属阳离子进行双光子荧光检测。 设计合成了一系列d 仍a 结构的双氰基二苯乙烯类溶剂生色探针，系统地考察了它 们对各种溶剂、对温度及对粘度的单双光子荧光光谱的变化，它们的发射最大波数与 溶剂参数显示了极佳的线性相关性，它们的双光子吸收截面随溶剂极性的不同而发生显 著的变化，一般是双光子吸收截面随溶剂极性增大而减小。 对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究 关键词：二苯乙烯；双光子染料；双光子探针；双光子吸收截面；溶剂生色探针 i i 大连理工大学博士学位论文 s t u d y o nt w o - - p h o t o nf l u o r e s c e n c ed y e sa n ds e n s o r sd e r i v e df r o m t e r e p h t h a l o n i t r i l e a b s t r a c t t h ed e s i g n sa n ds y n t h e s e so fo r g a n i cm o l e c u l e s 、枥n 1l a r g et w o - p h o t o na b s o r p t i o nc r o s s s e c t i o n ( 卉儆) a n ds t r o n gu p c o n v e r s i o nf l u o r e s c e n c ea r ea b l et og r e a t l yp r o m o t et h e a p p l i c a t i o n s o ft p f mi n b i o l o g i c a ls y s t e m ，w h i c h i s c o m p o s e do fs i n g l e - m o l e c u l e d e t e r m i n a t i o n s ，i m m u n o a s s a y s ，d e t e c t i o no fs i n g l ed n af r a g m e n t s ，c h c m o s e n s o r sa n d b i o l o g i c a ls e n s o r s ， m i c r o c h i p s i nb i o c h e m i c a l a n a l y s e ， s u b m i c r o m e t e r c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o n , a n ds oo n t w o - p h o t o nf l u o r e s c e n c em o l e c u l e sc a na v o i ds u c h d r a w b a c k sa sp h o t o b l e a c h i n g ，p h o t o d a m a g e ，t i s s u ea u t o f l u o r e s c e n e e ，e t c ，w h i c hr e s u l t sf r o m o n e - p h o t o ne x c i t a t i o n m o r e o v e r , t p f mp o s s e s s e sf i x e dt a r g e te x c i t a t i o n ，h i g ht r a n s v e r s ea n d l o g n i t u d i n a lr e s o l u t i o n s ，a n dl o wf l u o r e s c e n c el o s s t w o p h o t o ni m a g i n ge x h i b i t su n p a r a l l e l e d s t r o n gp o i n t s ，a n db e c o m e sap o w e r f u lt o o lf o rs t u d yo nm e c h a n i s m so fo b j e c ta c t i v i t i e s ，a n d i t sa p p l i c a t i o n su n d o u b t e d l ys t i m u l a t et h ed e v e l o p m e n t so fl i f es c i e n c ea n dm e d i c i n e as e r i e so f t w o - p h o t o n f l u o r e s c e n t d y e s f o rd - a da n da - a - a 2 , 5 d i c y a n o 一1 ，4 一b i s ( s u b s t i t u t e ds t y r y l ) b e n z e n ew i t hd o u b l ec y a n og r o u p sw e r es y n t h e s i z e d t h ee f f e c t so ft h e i rt e r m i n a ls u b s t i t u t e dg r o u p su p o nt h e i r6 w aa n ds o l u b i l i t i e sw e r ed e t a i l e d s t u d i e d ，w h i c hs u g g e s t st h a tt e r m i n a la m i n oc a l lr e m a r k a b l yi n c r e a s em o l e c u l a r ，f l u o r e s c e n c e q u a n t u my i e l d ，a n dl a r g ee m i s s i o nw a v e l e n g t h d o u b l ec y a n og r o u p si nt h es i n g l ea r o m a t i cr i n ga r eo r i g i n a l l ya n dc o v a l e n t l ya t t a c h e dt o t h ea c c e p t o rt e r m i n u sf o rs t i l b e n eo fd 一兀- at y p e ，w h i c h ( i ) n o t a b l ye x t e n d sc o n j u g a t i o n s y s t e mo fam o l e c u l ea n de n h a n c e s 曲队a n df l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d ，a n d ( i i ) i m p r o v e s e l e c t r o n - a c c e p t i n ga b i l i t yo fa e c e p t o rt e r m i n u sf o ram o l e c u l et oi n c r e a s ed i p o l em o m e n to f t h ee x c i t a t i o ns t a t e ，n a m e l ym o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e re x t e n t ，a n de n l a r g e sm o l e c u l a r m u l t i p l e - f r e q u e n c ya n dt w o - p h o t o na b s o r p t i o n ，a n d ( i i i ) a t t e n u a t e sm o l e c u l a rs y m m e t r yt o f o r mc e n t e r - a s y m m e t r ys p a c eg r o u p ，a n dt oe n s u r et h a tam o l e c u l ep o s s e s s e st h ee x c i t a t i o n s t a t ed i p o l em o m e n t s a tt h es a m et i m e ，a m i n og r o u pi ss u b s t i t u t e di n t om o l e c u l a ra n o t h e r t e r m i n i ，a n dc o o p e r a t i v e l yi n t e r a c t sw i t l lc y a n og r o u p st om a k eam o l e c u l eg a i ns t r o n g t w o - p h o t o na b s o r p t i o n as e r i e so fd 一尢- aa n da - n at w o p h o t o nf l u o r e s c e n td y e sw i t hd o u b l ec y a n og r o u p s d e r i v e df r o ms t i l b e n ew e r es y n t h e s i z e d t h ee f f e c t so ft h e i rt e r m i n a ls u b s t i t u t e dg r o u p su p o n t h e i r c s t p a ，p h o t o p h y s i c a lp r o p e r t i e s ，a n ds o l u b i l i t i e sw e r ed e t a i l e ds t u d i e d ，w h i c hs u g g e s t st h a t t e r m i n a la m i n oc a nr e m a r k a b l yi n c r e a s em o l e c u l a r ，f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d ，a n dl a r g e e m i s s i o nw a v e l e n g t h an u m b e ro fd - 开aa n dd a dt w o - p h o t o nf l u o r e s c e n ts e n s o r sf o rm e t a lc a t i o n s 、杭n l l d o u b l ec y a n og r o u p sw e r es y n t h e s i z e d t h e s es e n s o r ss e l e c t i v i t i e sf o rm e t a li o n s ，u 诳v i s t i t r a t i o n ，o n e a n dt w o - p h o t o nf l u o r e s c e n c et i t r a t i o n s ，a n d 孓r p aw e r es t u d i e d t h er e s u l t si m p l y t h a tt h e s es e n s o r sc a nb eu s e dt od e t e c ts o m em e t a li o n sb ym e a n so ft w o - p h o t o nf l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n s e v e r a ld 吼at w o p h o t o ns o l v a t o c h r o m i cp r o b e sw i t hd o u b l ec y a n og r o u p sd e r i v e d f r o ms t i l b e n ew e r es y n t h e s i z e d t h ei n f l u e n c e so f s o l v e n tp o l a r i t i e sv i s c o s i t i e s ，a n d t e m p e r a t u r e su p o no n e a n dt w o p h o t o nf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p i e so ft h e s ep r o b e sw e r e s y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d g o o dl i n e a rr e l a t i v e sw e r er e v e a l e db e t w e e nt h ee m i s s i o nm a x i m a w a v e n u m b e r so ft h e s ep r o b e sa n ds o l v e n tp o l a r i t yp a r a m e t e r s 升队o ft h e s ep r o b e sg e n e r a l l y d e c r e a s eu p o nt h ei n c r e a s e so fs o l v e n tp o l a r i t i e s n l e s es o l v a t o c h r o m i cp r o b e sc a l lb ec a p a b l e o ft h ed e t e c t i o n sf o rs o l v e n tp o l a r i t i e s ，v i s c o s i t i e sa n ds e t t i n gt e m p e r a t u r e s k e yw o r d s ：s t i l b e n e ；t w o - p h o t o nd y e s ；t w o - p h o t o ns e n s o r s ；t w o 。p h o t o na b s o r p t i o n c r o s ss e c t i o n ；s o i v a t o c h r o m i cp r o b e s i v 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：日期： 大连理工大学博士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定 ，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名：耋丝 导师签名：毽墨墨笙导师签名：丝2 塑生 大连理工大学博士学位论文 引言 双光子荧光( t w o - p h o t o ne x c i t e df l u o r e s c e n c e ，t p e f ) 是指分子同时吸收两个光子到达 激发态，然后产生荧光的过程。早在1 9 3 1 年，g 6 p p e r t m a y e r 就在理论上预言了双光子吸 收的存在。但是，直到六十年代初激光器出现后，才由k a i s e r 等首先从实验上证实双光 子吸收过程。t p e f 与单光子激发荧光( o n e p h o t o ne x c i t e df l u o r e s c e n c e ，o p e f ) 相比，存 在着多方面的优越性：t p e f 的激发光波长为s p e f 激发光波长的两倍左右，化合物在如 此长波的激发光中具有较好的光化学稳定性：另外，激发波长的大幅度红移也使得激发 光在介质中的散射大为降低、穿透性大大增加；再者，双光子激发中，光吸收与入射光 强度的平方成正比，若采用紧聚焦或者双光束技术，可使材料的激发能够具有精密的三 维空间选择性，这是s p e f 所无法作到的。因此t p e f 材料在双光子上转换激光、双光子 荧光显微技术、光动力学治疗等方面显示出非常光明的应用前景。 双光子吸收截面( t w o p h o t o na b s o r p t i o nc r o s ss e c t i o n ，如a ) 是表征化合物双光子吸。 收性能的物理量，它的大小直接反映化合物双光子吸收的强弱。双光子吸收为分子的三 阶非线性光学过程，其影响因素较为复杂，对其分子构效关系的研究是当前国际关注的 热点。美国a l b o t a 和r e i n h a r d t 两大研究小组分别从理论和实验两方面着手，在分子设计4 与合成方面已得出一些规律：具有共轭大7 c 键骨架且在其骨架两端连接强的给体 ( d o n o r ) 受体( a c c e p t o r ) ( d n - a ) 或强的给体给体( d 兀d ) 或受体受体( a - n a ) 的有机。， 分子，在激光脉冲作用下发生强的双光子吸收。双光子荧光染料及其探针的开发与应用 促进了双光子显微技术的快速发展。钙黄、钙绿1 及钙深红对细胞中钙离子的三维成像 分布在双光子激光扫描显微镜( t w o p h o t o nl a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ，t p l s m ) 中获得了 成功的应用，尽管它们的a w a g l 曼d ，但为双光子显微成像在细胞中的应用提供了范例。 双光子荧光显微与成像仅是最近几年才发展起来的，尚在起步阶段，存在许多不足 与缺陷。在探针的作用机制上，只有分子内电荷迁移和共振能量迁移这两种作用机制， 尚无光诱导电子迁移及极性探针的报道：从识别离子种类来看，仅只有铅离子、钙离子、 镁离子及氟离子这四种离子探针，别的离子探针还不曾出现。探针还难以达到实际应用 的要求，归结为探针水溶性差、选择性差及6 r p a 小。此外，探针分子整体上比较大，这 也是制约其应用的一个重要原因。该论文设计合成不同取代的双苯乙烯基苯及二苯乙烯 衍生物，研究它们的线性及非线性光学性质。通过对取代基及分子骨架的考察，探讨分 子的构造与双光子吸收的关系。在双光子荧光母体上引入一些识别性的受体，利用受体 与金属离子螯合作用的强弱，通过分子内电荷迁移机制将离子信息转换为荧光信号实现 对离子的探测。通过d 兀- a 分子在激发态经历一个绝热光反应过程，产生一个扭转分子 内电荷迁移，并伴随溶剂重组，从而实现溶剂生色，即溶剂生色探针。 对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究 第一章文献综述 1 1 引言 双光子荧光显微镜是生物活体组织成像的一个极其重要的工具，愈来愈受到人们的 重视。为了使双光子荧光显微镜获得最大范围的应用，关键是开发有效的双光子荧光探 针。对离子、小分子、蛋白质分子、核酸分子和酶活性进行定量分析和特异识别的应用 于双光子荧光显微镜的双光子荧光探针是探讨生命机理的一个重要的工具。离子的含量 对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、分子的分布与结构、分 子的构象及其相互作用等结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变 化机制，对生命奥秘的揭示、临床诊断以及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。 开发具有大的双光子吸收截面且在诸如频率上转换激射1 1 2 】、双光子荧光显微术【3 】、 光限幅【4 5 1 、三维光存储【& 7 1 、三维微n - r t 8 1 以及光动力疗法【9 1 等领域显示出良好的应 用前景的双光子材料是当前研究的热点。 骡光于爨蝮悬指在臻光烫瞧五k 众履分王屉时嗯蝗愿企光王k 丛基查跃鞭i j - l 嘴光 子能量昀激发态的过程。早在1 9 3 1 年，g 6 p p e r t m a y e r i j 就在理论上预言了双光子吸收 的存在，但是，直到六十年代初激光器出现后，才由k a i s e r 等【ll 】首先从实验上证实双光子 吸收过程。然而，由于一般材料的双光子吸收截面很小，双光子吸收的实际应用受到限 制，双光子吸收研究一直停留在基础研究水平。19 9 0 年，美国康奈尔大学d e n k 等【1 2 j 提出 将双光子激发现象应用到共焦激光扫描显微镜中，开辟了双光子荧光显微和成像这个崭 新的领域。近年来，有机双光子吸收材料在诸多领域，尤其是双光子荧光显微和成像中的 应用得到了广泛的关注【1 3 l 引。设计和合成双光子吸收截面大和上转换荧光强的有机分子 能大大促进双光子荧光显微成像在生物系统中的应用，其应用包括：单分子检测【i 圳、免 疫测定【2 0 l 、d n a 片断测定口1 1 、化学和生物传感器【2 2 l 、生物微芯片圆、毛细管分离检测 等【2 4 j 。在大量的实验和理论研究基础上，人们总结出有机双光子吸收材料的一些结构一 性能关系，提出了许多行之有效的设计和合成策略，大大推动了双光子吸收应用的发展 【1 3 1 5 2 5 2 9 1 o 双光子荧光探针的研究是近几年才刚刚兴起的一个崭新的前沿领域。这一领域的研 究还远远没有拓展开来，亟待更多的新研究成果问世，以填补这一领域的空白。目前已 有的研究从识别客体来说仅局限于离子探针与p h 探针，仍无识别对象为分子的探针问 世：而从探针识别的机理来说仍囿于分子内电荷迁移( i c t ) 和共振能量迁移( r e t ) 这两 种作用机制，尚无光诱导电子迁移( p e t ) 探针和扭转分子内电荷迁移( t i c t ) 溶剂生色探 针的报道；从识别离子种类来看，仅只有铅离子、钙离子、镁离子及氟离子这四种离子 探针；别的离子探针还不曾出现。 2 大连理工大学博士学位论文 1 2 双光子荧光显微成像的优点 双光子共焦显微镜与单光子共焦显微镜相比具有许多突出的优点：( 1 ) 双光子共焦 显微镜可以采用波长比较长的、在生物组织中穿透能力比较强的红外激光作为激发光 源，因此可以解决生物组织中深层物质的层析成像问题； ( 2 ) f l j 于双光子荧光波长远离 激发光波长，因此双光子共焦显微镜可以实现暗场成像；( 3 ) 双光子荧光可以避免普通 荧光成像中的荧光漂白问题和对生物细胞的光致毒问题；( 4 ) 双光子跃迁具有很强的选 择激发性，有利于对生物组织中一些特殊物质进行成像研究：( 5 ) 双光子共焦显微镜具 有更高的横向分辨率和纵向分辨率。另外，由于材料的双光子吸收强烈地与激发光强的 平方相关，因而在紧聚焦的条件下，双光子吸收仅局域于物镜焦点处的空间体积约妒的 小范围内，甚至不使用共焦小孔，就能得到高清晰的三维图像，使共焦显微镜的设计大 为简化，易于操作；( 6 ) 双光子共焦显微镜使用红外激光作为激发光源，能大大地降低 生物组织对激发光的吸收损耗，可获得较强的样品荧光；( 7 ) 由于组织中的自发荧光物 质的激发波长一般都在3 5 0 - - - 5 6 0n m 的范围内，因此使用红外激光作激发光源的双光子 荧光显微镜能避免组织自发荧光的干扰。 基于上述优点，加之使用较长波长的光来激发样品，可以避免紫外光对样品的伤害 和使用复杂的紫外光学元件的许多限制，同时可以延长对活体生物样品的观察时间，双 光子共焦激光扫描显微镜为研究氨基酸、蛋白质和神经递体( n e u r ot r a n s m i t t e r ) 等提供了 独特而重要的方法。例如，d e n k 等用波长为6 3 0n m 的激光进行双光子激发，获得了分” 辨率达2 0 0n m 的猪肾细胞分裂期染色体的荧光像【1 2 】，因此，双光子荧光显微成像术成 为生物分子检测1 3 0 1 、活性细胞的超分辨率层析成像【3 1 3 3 】等研究的重要工具。 常规的双光子共焦显微和成像，通常采用传统的荧光物如荧光素等作为双光子荧光 发射体。这些荧光物的双光子吸收截面较小，在实验中必须采用高强度激光激发高浓度 的荧光物的措施来获得足够强的上转换荧光，这样加大了活体生物样品的观测难度。因 此，寻求具有高荧光量子产率和大双光子吸收截面的材料是这个领域的热点。例如，2 0 0 1 年，v e n t e l o n 等在二氢菲衍生物中获得了荧光量子产率高达8 6 和双光子吸收截面是荧 光素分子1 0 0 0 多倍的结果【3 3 1 。这些研究的深入将会对双光子共焦显微和成像技术的发展 产生相当大的促进作用。 1 3 双光子荧光探针设计的一般原理 1 3 1 双光子荧光探针发生作用的机理 双光子荧光探针与单光子荧光探针的设计原理基本上是一致的，作为一个探针分 子，也是由两部分组成：一是荧光团( f l u o r o p h o r e ) ；二是离子 羽( i o n o p h o r e ) 或称作受体 ( r e c e p t o r ) ，不一定局限于离子，从广义上讲，发生作用的对象除了离子外还有分子甚至 3 对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究 大分子，因此最好称作受体。从作用机制来讲也是有如下几种。 一是分子内电荷迁移机理( i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ，i c t ) t 3 4 1 ，受体与客体作用后 削弱了受体的供电能力，导致荧光团上的电子云密度降低。如果受体接合客体前对荧光 团表现为供电基，则体系的荧光减弱；反之，则荧光增强。在i c t 过程中常伴有吸收波 长与发射波长的红移或蓝移( 见图1 ) 。 e 匠亘回：乏t i ，t 匠亘囤 臣亘回叩s o 。土上臣亘围 i ii 舌ls b 一、一急。围 t i m e 1 ) f 为荧光团；2 ) r 为受体；3 ) s i 为最低能量激发态；4 ) s o 为电子基态；5 ) f c 为f r a n c k - c o n d o n 激发 态；6 ) + 为带正电的离子；7 ) e q u i l 为热平衡电子基态：8 ) t h e x i 黼z 衡电子激发态。 图1 1i c t 中离子对电荷迁移影响的能量示意图 f i g 1 1t h ee n e r g yd i a g r a mo fi o n i ce f f e c tu p o nc h a r g et r a n s f e ri ni c t 二是光诱导电子迁移过程( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ，p e t ) 幽j ，探针在未接合客 体前不发荧光或荧光很弱，这是由于受体的h o m o 轨道( 最高占据分子轨道) 能量高于荧 光团的h o m o 轨道能量，受体上的电子通过光诱导跃迁到荧光团的h o m o 上，致使荧光 团的荧光淬灭，而当受体接合客体后，受体的h o m o 轨道能量显著降低( 低于荧光团的 h o m o 轨道能量) ，这样受体上的电子不能通过光诱导跃迁到荧光团的h o m o 上，此时 荧光团自身的l u m o ( 最低空分子轨道) 接受一个光子再通过能级跃迁将接受的光子释 放出来，回到h o m o 能级，从而发出荧光( 见图2 ) 。 flu orophor e bo undrcccptor 图1 2p e t 的前线轨道能量示意图 f i g 1 2f r o n t i e ro r b i t a le n e r g yd i a g r a mf o rp e t 4 大连理工大学博士学位论文 三是共振能量迁移( r e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r , r e t ) 过程刚，探针一般是两个荧光团 ( 可相同也可不同) 通过一个柔性受体连接起来，未接合客体前两个荧光团紧密相靠，产 生共振能量迁移而自淬灭，分子不发荧光或荧光很弱；一旦受体接合客体后，两个紧密 相靠的荧光团就因客体的被包裹而被彼此远远推开，共振能量迁移被阻断，荧光团就发 出荧光( 见图3 ) 。 图1 3r e t 机理示意图 f i g 1 3t h ed i a g r a mo fr e tm e c h a n i s m 四是扭转分子内电荷迁移( t w i s t e di n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ，t i c t ) 3 5 删和远程 电荷迁移( e x c i p l e x ) 1 4 3 一o l ，远程电荷迁移既有分子内扭转电荷迁移，也有分子间扭转电 荷迁移，究竟采用何种方式来实现电荷迁移取决于分子本身的构造。 lqh l 1 ) d 代表供体( d o n o r ) ，a 代表受体( a c c e p t o r ) ：2 ) a e i 代表扭转激发态与扭转基态的能量差，彳历代表 定域激发态与定域基态的能量差：3 ) f c 代表扭转基态的f r a n c kc o n d o n 态。 图1 4 扭转激发态形成过程中能量关系示意图 f i g 1 4t h ed i a g r a mo fe n e r g e t i cr e l a t i o n sb e t w e e n v a r i o u ss t a t e si nt h et i c tf o r m a t i o n 一般地，分子内含有长碳链脂肪胺，氨基氮上的孤对电子易于将电荷转移到分子的 受体部分，产生电荷分离，通过外界条件实现电荷离域的稳定，譬如溶剂极性、粘度及 温度等；分子间的电荷迁移是在分子本身难以实现内部电荷迁移的情况下，可以通过一 5 对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究 个分子的供体与另一个分子的受体之间发生电荷传递，从而产生电荷分离，同样通过外 界条件来实现分离的稳定。由t i c t 及e x c i p l e x 产生的溶剂生色作用机制，即是通常所说 的极性探针，除了探测极性外，还可检测粘度、温度等，有时又称之为环境探针。其生 色作用机制示于图4 。在溶剂生色过程中存在三种激发态，即定域激发态( 1 0 c a l i z e d e x c i t e d s t a t e ，l e ) 、扭转分子内电荷迁移激发态( t w i s t e di n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r e x c i t e ds t a t e ，t i c t ) 和远程电荷迁移激发态( r e m o t ec h a r g et r a n s f e re x c i t e ds t a t e ，e ) ，这 三种激发态之间的区别如图5 所示。 饼n ，、 n _ 爿喜一0 享 1 3 2 各类双光子荧光染料的双光子吸收截面 各类双光子化合物的双光子吸收截面大致是：苯并噻唑类衍生物为6 5 - 2 2 1g m 5 1 1 ( 见图1 6 ) ( 1 g m = i o 5 0 c m 4 s p h o t o n ) 、芴类衍生物为7 7 - - - 1 0 7 0 验生活g m 5 2 , 5 3 1 ( 见图1 7 ) 、叁 键类化合物为2 1 0 - - 9 9 0g m ”1 ( 见图1 8 ) 、不含氰基的双苯乙烯类在8 0 5g m t ”1 ( 见图1 9 ) 左右、含氰基的双苯乙烯类在2 5 0 0g m 左右【5 6 1 ( 见图1 9 ) 。对于共轭体系比较庞大的芳环 上不含氰基的多枝分子，其6 约为1 3 6 0g m 5 7 1 ( 见图1 6 ) ，而苯环上含两个氰基的多枝 分子达至1 j 5 5 3 0g m t 5 8 1 ( 见图1 1 0 ) ，含两个氰基的双苯乙烯类偶极分子的6 甚至可达至u 5 3 0 0 g m 5 9 1 ( 见图1 1 1 ) 。因此，应该选含氰基的双苯乙烯类作为双光子荧光团，且这类化合物 荧光量子产率也相当高，一般均在0 7 以上。双光子化合物的结构特点：( 1 ) 具有大的共 轭罐结构；( 2 ) 分子是非中心对称的；( 3 ) 分子基态偶极矩小、激发态偶极矩大；( 4 ) 能形成 分子间氢键，使分子首尾相连而加强偶极；( 5 ) 具有刚性的平面结构；( 6 ) 分子是反式的；( 7 ) 具有最低的单线电子激发态s 1 为 兀l 跃迁。 设计一个双光子荧光探针即是找一个双光子荧光团与一个受体，然后把二者连接起 6 大连理工大学博士学位论文 来。单光子荧光探针中用到的受体在双光子荧光探针中一样可以用，这是没什么疑义的。 关键是找一个双光子荧光团，双光子荧光团既要保证有很高的双光子吸收截面和荧光量 子产率，同时还要保证发射波长要尽可能的大，溶解性要好。作为双光子荧光团，为了 获得较大的双光子吸收截面，本身共轭体系比较大，有较大的刚性平面，同时激发态偶 极矩大，这势必大大降低荧光团的溶解性，许多双光子分子不要说水相，即便是有机相 也难溶或根本就不溶。双光子效应的强弱取决于分子的极化程度，极化程度高，双光子 吸收截面越大，双光子效果越佳，而高度极化的分子由于分子间的相互静电作用溶解性 很差唧】，这是一个比较突出的矛盾。末端含有氨基的双光子分子的吸收截面是末端含烷 氧基分子的1 0 倍【6 1 】，且末端含有氨基的双光子分子的溶解性较末端含其它基团的双光子 好得多，最大发射波长也大，荧光量子产率也高得多，因此双光子荧光团最好末端应含 氨基。 综合上述情况，比较理想的双光子荧光团应该是末端带氨基的含有两个氰基的双苯 乙烯类衍生物。 t o l u e n e ：9 9g m ；t h f ：1 1 8g m b 1 t o l u e n e ：1 9 0g m ；珊：2 2 1g m b 3 t o l u e n e ：4 2g m ；t h f 6 5g m b - 2 q 弋扩o c 图1 6 苯并噻唑衍生物的双光子吸收截面 f i g 1 6t w o p h o t o na b s o r p t i o nc r o s ss e c t i o n so fb e n z o t h i a z o l ed e r i v a t i v e s 8 8 0 g m f - l 图1 7 芴衍生物的双光子吸收截面 7 7 4 g m f - 2 p 。bn bp bn b 对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究 f i g 1 7t w o - p h o t o na b s o r p t i o nc r o s ss e c t i o n so ff l u o r e n ed e r i v a t i v e s ( c 1 0 h 2 1 ) 2 ( c 1 0 h 2 1 ) 2 n ( c 1 0 h 2 1 ) 2 n ( c l o h 2 1 ) 2 n t - l 1 2 c n n ( c 1 0 h 2 1 ) 2 1 3 c n t 4 图1 8 叁健类化合物的双光子吸收截面 f i g 1 8t w o - p h o t o na b s o r p t i o nc r o s ss e c t i o n so f t r i p l eb o n dc o m p o u n d s 8 n ( c l o h 2 1 ) 2 大连理工大学博士学位论文 ( c 6 h 13 ) 2 n ( c 6 h 1 3 ) 2 n ( c 4 h 9 ) 2 n s t 8 0 5 g m n ( c 6 h 13 ) 2 n ( c 4 h g ) 2 s t - c n 图1 9 双苯乙烯基苯衍生物的双光子吸收截面 f i g 1 9t w o - p h o t o na b s o r p t i o nc r o s ss e c t i o n so fb i s - s t y r y l b e n z e n ed e r i v a t i v e s a - 1 ：11 4 0g m ；a - 2 ：1 8 1 0 ，1 9 0 0g m ；a - 3 ：2 5 8 0 ，2 4 9 0g m ；a - 4 ：5 5 3 0 g m ；a - 5 ：3 6 5 0g m x = h y = h ( a 1 ) ；x = o p r , y f f i h ( a - 2 ) ； x = f ly = o m e ( a - 3 ) ；x = c n ，y = h ( a _ 4 ) ；x = c n ，y = o m e ( a - 5 ) 图1 1 0 多取代偶极分子的双光子吸收截面 f i g 1 10t w o - p h o t o na b s o r p t i o nc r o s ss e c t i o n so f m u l t i s u h s t i t u t e dd i p o l em o l e c u l e s ( c 4 h 9 ) 2 n f b - i ：3 6 0 0g m ；f b - 2 ：4 4 0 0g m ；f b - 3 ：5 3 0 0g m r i = c n ，r 2 = h ( f b 1 ) ；r 1 2 c n ，r 2 = o c l 2 h 2 5 ( f b - 2 ) ；r i = o c h 3 ，a 2 2 c n ( f b 一3 ) 多取代偶极分子的双光子吸收截面 n ( c e h l3 ) 2 n ( c 4 h 9 ) 2 f 谵1 11t w o - p h o t o na b s o r p t i o nc r o s ss e c t i o n so fm u l t i s t y r y lb e n z e n ed e r i v a t i v e s 1 4 双光子荧光探针的种类及其发展 双光子荧光探针归纳起来有阳离子探针、阴离子探针及p h 探针三种。 对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究 1 4 1 双光子阳离子探针 1 4 1 1 双光子镁离子探针 第一个真正意义上的双光子荧光探针是镁离子探针，其荧光团是l ，4 二氰基2 ，5 双苯乙烯基苯的衍生物，受体是单氮杂1 5 冠5 ( m o n o a z a - 1 5 c r o w n 5 e t h e r ) ，由p o n d 等于 2 0 0 4 年合成，荧光团可接一个1 5 冠5 受体( m g - 1 ) ，或荧光团两端各接一个1 5 冠5 受体 ( m g - 2 ) 6 2 a 】，当氮杂1 5 冠5 鳌合镁离子时，氮杂氮原子上的孤对电子与镁离子配位成键， 使荧光团上的分子内电荷迁移减弱，导致单光子与双光子吸收及荧光特性上发生变化， 吸收和发射强度均减弱，且都发生相应的蓝移或红移，是一个典型的i c t 探针。带一个 冠醚受体的探针分子m g - 1 的发射波长、荧光量子产率、占及络合常数分别是6 2