自制纤维素酶米氏常数的测定.doc

自制纤维素酶米氏常数的测定在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加就开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。底物浓度与反应速度的这种关系，可用米曼氏方程表示：v= VmaxS Km+S式中v为反应速度；Vmax为最大反应速度；S为底物浓度；Km为米氏常数。按此方程，可用作图法求出Km。（一）以V对S作图由米氏方程可知，当v=1/2Vmax时，Km=S，即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。因此，可测定一系列不同底物浓度的反应速度v，以v对S作图，当v=1/2Vmax时，其影响的底物浓度即为Km。（二）以1/v对1/S作图将米曼氏方程转换成林贝氏方程1/v=Km/Vmax 1/S + 1/vmax以1/v对1/S作图可得一直线，其斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于-1/Km。 1/v 1/Vmax -1/Km 1/SKm为酶的特征常数，对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此常可鉴别酶，大多数酶的Km值在10-210-5之间。本实验以自制纤维素酶为材料，测定底物不同浓度时的酶活性，再根据林贝法作图，计算Km值。原理纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。试剂1.柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L pH=4.8 (适用于酸性纤维素钠) 称取一水柠檬酸4.83g，溶于约750ml水中，在搅拌情况下加入柠檬酸三钠9.74g，用水定容至1000ml，调节溶液的pH到（4.80.05）备用。2.DNS试剂 称取3，5-二硝基水杨酸（100.1）g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50水浴中（磁力）搅拌溶解后，再依次加入酒石酸钾钠200g，苯酚（重蒸）2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解澄清后，冷却至室温，用水定容至1000ml，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。主要器材1.风光光度计 2酸度计 3恒温水浴 （500.1） 4.分析天平 .5磁力搅拌器 .6秒表或定时钟 7沸水浴 .8具塞刻度试管 25ml操作（一）底物浓度对酶促反应速度的影响1.样品的测定1.1待测酶液的制备称取固体酶液0.5g精确至0.1mg，用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容至50mL（使试样液与空白液的吸光度之差恰好在0.30.4范围内），放置10min，待测。反应时将酶液做适当倍数稀释。1.2秸秆的准备 将秸秆进行粉碎，备用。1.3操作程序 分别称取20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg的秸秆于具塞试管中。分别至于25 mL的刻度试管中（一支空白管，三支样品管），并最好标记。 分别向以秸秆为底物的这四个支管中，准确加入相应的pH的柠檬酸缓冲液1.5mL。 分别加入准确稀释好的待测酶液0.50mL于三支样品管中（空白管不加），使管内溶液浸没秸秆，混匀，盖塞。 将这四支试管同时置于（500.1）振荡水浴中，准确计时，反应60min取出。 立即准确向各管中加入DNS试剂3.0mL。再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5mL，摇匀。将着四支试管同时放入沸水浴中，加热10min，取出，迅速冷却至室温，加水定容至25mL，摇匀。 以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色皿，分别测量三支平行管中样液的吸光度，取平均值。以吸光度平均值查标准曲线或线性回归方程求出还原糖的含量。最后，以酶活性单位（v）的倒数v为纵坐标，以底物浓度S的倒数S为横坐标，在坐标纸上描点并连成直线，求该酶的Km值。（二）葡萄糖标准曲线的绘制及结果（三）酶活性的计算 秸秆酶活力定义：1g固体酶（或1ml液体酶），在（50+0.1）、指定pH条件下（酸性纤维素酶pH=4.8），1h水解秸秆底物，产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。秸秆酶活力按式计算。