新生仔猪腹泻综合征NPDS研究初探.doc

新生仔猪腹泻综合征NPDS研究初探时间：2011-04-19 来源： 作者： 摘要:近来，众多猪场出现新生仔猪腹泻高发病情况，应用抗生素治疗无明显效果，死亡率很高，有些严重发病的猪场哺乳仔猪整窝出现腹泻相继死亡，导致猪场损失惨重。猪群发病特点表现为母猪与新生仔猪同时具有临床症状，母猪主要表现为产前产后便秘，产后发烧不食、少奶甚至无奶、拉水样粪；新生仔猪初期表现为黄色水样或溶糖状腹泻物，有臭味，腹泻、呕吐，进而转变为剧烈水样腹泻、吮乳无力、仔猪体质快速瘦弱最后衰竭死亡。鉴于此严重情况，我楠森兽医诊断技术研究中心立即组织专家力量，在全国范围内深入各地猪场做临床调查并取发病仔猪病料开展实验室诊断。关键词: 新生仔猪、病毒性腹泻、肽核酸我中心在与泰国等东南亚地区农场及国内众多猪场交流后发现这种新生仔猪的腹泻问题相当普遍，对养猪生产已造成了不小损失，需引起同行重视并尽快研究出控制措施与方案。经过临床调查结合实验室诊断研究分析，近来的产房母猪和新生仔猪腹泻病症主要与多种病毒共感染相关，故暂命名为“新生仔猪腹泻综合征(NPDS)”。由于病毒持续侵染母猪淋巴系统和生殖系统，形成感染压力后致使母猪免疫机能衰弱，便秘、体况不良、食欲不佳、产程过长、奶水不足、产道感染率增加等一系列亚临床症状及死胎、流产、返情率增高等繁殖障碍现象。受病毒感染压力的影响，在妊娠后期病毒易通过胎盘屏障垂直传染给胎儿几率增加，新生仔猪先天性带毒及出生后即在母猪排毒污染严重的环境中与母猪一起生活，免疫系统频繁遭受病毒攻击致使原本尚未发育成熟的免疫系统损伤严重，再加上目前是冬春季节交换，日夜温差与气候变化剧烈，故出现高发病高死亡率。为探究发病原因，我们将从广东、广西、福建、江西、湖南、江苏、安徽、湖北、河南共9个省区采集的28个病料样本（十二指肠、淋巴结、肺脏、扁桃体、血液）处理，尝试分离猪瘟病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒、流行性腹泻病毒。一、 病料处理分别取解冻的待检病料10g左右（在冰上进行操作），用灭菌的手术剪剪碎，加入适量的生理盐水或PBS溶液（pH7.2)混匀，用灭菌的研磨器充分研磨，再用2ml Eppedorf管分装，反复冻融2-3次，4冷冻离心机离心8000r/m，10min，取上清液，置-70保存备用。二、 病毒液、病料中病原DNA模板的制备2.1圆环病毒及伪狂犬病毒的DNA提取取447.5ul上清液，加50uL10%的SDS，震荡混匀；加入2.5uL蛋白酶（PEK），混匀；放入58水浴锅中，充分裂解2h，再加入水饱和酚250ul，三氯甲烷240ul，异丙醇10ul，混匀，12000转/分离心5min；取上清400ul加1/10体积的醋酸钠40ul，2倍体积的无水乙醇800ul，混匀，置于-20进行DNA沉淀1h；12000r/m离心20min，弃去上清，加入1000ul 70%乙醇洗涤沉淀，再弃去上清进行干燥，干燥后加入灭菌双蒸水50ul将DNA溶解，-20保存备用。2.2猪瘟病毒、蓝耳病病毒及轮状病毒的RNA提取及反转录采用天泽基因生产的柱式动物RNAout试剂盒提取样品RNA。按照说明书提取，样品管中A液和B液各加450ul，再加入300ul样品上清液，混匀；加氯仿250ul，混匀，12000r/m离心5min，取700uL无色透明水相于通用离心柱中，12000r/m离心1min，加入通用洗柱液700ul，再重复离心步骤；弃去离心吸附柱，换成离心管，每管加50ul洗脱液，再次离心1min，-20保存备用。将RNA反转录成cDNA，反应体系：DEPC 6uL+RNA 5ul+引物 1ul+dNTP 2ul,65反应2min，在降温至4保持5min。再向反应管中加入5*buffer 4ul+Ribolock Rnase Inhibitor 1ul+M-MLV 1ul，30反应10min。三、 引物设计与合成根据基因文库提供的和已发表的CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PEDV序列，应用计算机软件DNAstar在保守区域基因序列保守区的五对引物。该引物设计完成后, 通过计算机网站(http:/www.ncbi. N/BLAST/)对其进行分析，结果具有良好的特异性。引物序列如下：CSFV 上游引物:5-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3 下游引物:5-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3PRRSV 上游引物: 5-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3下游引物: 5-AGCTCGTTTCATGCTGAGGGTGA-3PRV 上游引物: 5-AGGACGAGTTCAGCGACG-3下游引物: 5-AACAGGCGGTTGGCGGTCAC-3PCV2 上游引物: 5-GACCTGTCTACTGCTGTGAGTA-3下游引物: 5-AAATTCAGGGCATGGGGGGGAA-3PEDV 上游引物:5-GTATGGTATTGAATATACCAC-3 下游引物:5-GATCCTGTTGGCCATCC-3 四、 PCR扩增及鉴定采用天泽基因PCR试剂盒，30ul反应体系：DNA（cDNA） 2-4uL+PCR Mix 15ul+引物1-2ul+灭菌双蒸水 9-11ul，采用95预变性5min，9450s，52-59不同温度进行退火50s，72延伸1min，共35个循环；最后72延伸10 min，产物4保存。五、 结果与分析病原分析结果如下（表1.）六、预防控制思路据调查研究显示，我国及东南亚地区目前新生仔猪腹泻高发病率高死亡率与母猪群遭受野毒持续侵染，形成感染压力呈正相关，凡是便秘、体况不良、食欲不佳、产程过长、奶水不足、乳房炎与子宫炎及返情、产死胎率高的母猪群所产的新生仔猪发生腹泻病率显著的增高。另外,国内猪场母猪贡献成品肉猪的生产水平普遍不到发达养猪国家的60%，大量的种猪存在不同程度的繁殖障碍，由于母猪的生产性能低下，又加上疾病的频频发生，猪场的盈利危机四伏。在猪场中有着相当多的公猪表现死精、弱精、甚至无精；母猪表现出的屡配不孕、死胎、流产、产弱仔、便秘、奶水不足、采食量不正常等亚临床现象。存在的这些现象中，有超过80%是由于野毒在种猪群中循环并持续侵染种猪的生殖系统上皮细胞，导致卵巢、输卵管、子宫、精囊腺、睾丸等组织器官细胞大量凋亡。 俗话说的好，母猪好好一窝、公猪好好一坡，在哺乳母猪饲喂过程中，采用疫百特（肽核酸-一种新型的抗病毒添加剂技术）添加到哺乳母猪料中，对母猪群实施病毒感染良好控制与净化方案是解决这些问题的关键！七、发病猪群临床控治措施7.1 国内猪场相关产品配套方案A:母猪，分娩当天肌注疫百特注射液6-8ml/头份，间隔3天各肌注一次，1-2次/疗程。B:吃奶的新生仔猪，肌注疫百特注射液0.1ml/头份（3kg体重） 、0.2ml/头份（3-7kg体重），可与疫苗或补铁同针肌注，间隔2天各肌注一次，2次/疗程；或疫百特注射液0.2ml+霉克乐5-10g/头份灌服（即：以10头猪/窝计，分别取疫百特注射液2ml和霉克乐50-100g加入200ml热开水中搅拌形成混悬液，用一次注射器吸取20ml灌入乳猪口中咽下，1-2次/日。）C:正常采食的发病猪群采用疫百特60 1000g+菌特肽克2000g+霉克乐2000g/吨全价料，连续饲喂7-10天。D:搞好猪圈环境卫生、干燥、温暖。7.2 国外猪场相关产品配套方案 发病猪肌注YebatonTMInj.+阿托品(功能:缓解消化道平滑肌蠕动、止泻)，两天一次，连续肌注3-5次。 母猪，分娩当天肌注YebatonTMInj.6-8ml/头份，间隔3天各肌注一次，1-2次/疗程。 吃奶的新生仔猪，肌注YebatonTMInj. 0.1ml/头份（3kg体重） 、0.2ml/头份（3-7kg体重），可与疫苗或补铁同针肌注，间隔2天各肌注一次，2次/疗程；或YebatonTMInj. 0.2ml+ MILDRIDPlus 5-10g/头份灌服（即：以10头猪/窝计，分别取YebatonTM