小鼠染色体标本制作、染色及观察.doc

山东大学实验报告科目 细胞生物学实验 题目 小鼠染色体标本的制作、染色与观察姓名 * 系年级 2011级生物基地 学号* 同组者 * 日期 2013/05/23、302013/05/30 小鼠染色体标本的制作、染色与观察【实验目的】1. 初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法，了解各 操作步骤的原理。2. 了解常用实验动物染色体的数目及特点。3. 认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组形图。【实验原理】 凡处于活跃增殖状态的细胞，或者经过各种处理后，任何动物组织的细胞就可进入分裂，均可用于染色体分析。在正常动物体内，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织。给动物注射一定剂量的秋水仙素，即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2. 用低渗法使细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3. 空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。Giemsa染色是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。主要用Giemsa染液可以将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。【实验材料】1. 试剂：秋水仙素、生理盐水（0.9%的NaCl溶液）、0.3%KCl低渗溶液、固定 液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液。2.器具：解剖盘、镊子、眼科剪、小烧杯（2）、吸管、玻璃刻度离心管、恒温 水浴锅、离心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等。3.材料：小白鼠。【实验步骤】1.取雄性小鼠以每克体重4g注射秋水仙素，经1416小时后，断头法杀死小鼠， 取出睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl溶液）洗去血污。2.将睾丸放入装有1ml 0.3%KCl低渗溶液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。3.用铜网过滤到玻璃刻度离心管中，再加0.3%KCl缓冲溶液至4ml。4.将离心管放入37恒温水浴中静置30分钟，进行低渗处理。5. 以8001000转/分的转速离心8分钟。6. 取出离心管，弃去上清液，加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），并用吸管 至管底吹气，轻轻打散细胞，固定8分钟。7. 再以8001000转/分的转速离心8分钟。8. 取出离心管，弃去上清液，加入1ml固定液，再制成细胞悬液，固定5分钟。9. 取洁净的低温预冷载片，距载片1015cm高度滴下23滴细胞悬液，从载片 一边向另一边轻轻吹气，并同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色 体展开。10.用滤纸擦去载片上多余液体，空气干燥或成文火干燥。11.用Giemsa染色2030分钟，细水冲洗玻片背面，去多余染液，气干。12.镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染 色体形态并计数。【实验结果】本实验采用的是小鼠的精巢，视野中可见大量的精子（图中未给出），它们有一个比较圆的头部和鞭毛，还有一些细胞有一个尖，老师说，那是未变形的精子。部分细胞处于减数第一次分裂中期，这样的细胞是二倍体，应有40条染色体；有些处于减数第二次分裂中期，这样的细胞是单倍体，应有20条染色体。还有一些细胞处于分裂期，但不是中期，这类细胞染色体的凝集程度不是很高。经过仔细查找，最终找到处于减数分裂中期的染色体。如图，处于减数分裂中期的染色体染色质凝缩程度达到最大。小鼠的染色体多为端着丝粒染色体（17、18对染色体为亚端部），呈“V”字形或“U”字形，由于显微镜放大倍数比较小且手机像素不是很高，导致无法看清中期染色体的形状，只能看到染色体呈短棒状。由图可数出，可分辨的染色体数目为13条，还有一部分染色体堆叠在一起。图：经秋水仙素处理的小鼠精细胞染色体标本照片（1040）【实验结果分析】实验结果中，可分辨的染色体数目为13条，还有一部分染色体堆叠在一起，没有完全展开，这说明在对染色体展平的步骤没有做好，以后应改进。已知小鼠染色体的数目为40条，而本次实验所得结果远小于这个数值，分析原因可能有二：1.在滴片、染色、冲洗等步骤中操作不当，造成染色体丢失；2.该细胞处于第二次减数分裂中期，染色体总数为20。也可能是两种原因的共同结果。【注意事项】1. 向小鼠腹腔注射秋水仙素时，用左手抓住小鼠背部的皮，右手持注射器，进针 时倾斜45，在开始注射前，将针头略向上挑，以免将秋水仙素注入小鼠的肠 道内。注射过程中注意观察小鼠的反应：如果秋水仙素被正确注入腹腔内，小 鼠应该是很安静的。2.断头法处死小鼠后，血液要冲洗干净，以免影响之后的实验的进行。3.从开始加入0.3%KCl低渗溶液至37恒温水浴低渗处理结束，时间控制在 50min以内。4.两次离心的转速控制在8001000转/分，不要太高，以免破碎细胞。5.滴片时，使滴管与载玻片间的距离尽量远，这样细胞才能被“摔碎”，使眼睛、 滴管、载玻片竖直成一条直线，保证细胞悬液能被滴在载玻片上。6.滴完片之后，将载玻片的一端轻轻在试验台边缘敲打，使未破碎的细胞破碎。7.边敲打载玻片边从载片一边向另一边轻轻吹气，以使细胞均匀分布和促使染色 体展开。8. 多个样品同时进行染色时，载玻片应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量 慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。9. Giemsa染色后，细胞核呈蓝紫色，细胞质被染成粉红色。染色后时间过长，由 于氧化作用，细胞核也呈红色，所以，染色之后，抓紧时间观察和拍照。附:1. Giemsa染液的配制：吉姆萨粉(Giemsa stain) 甘油(AR) 甲醇(AR) 将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再分批加入甘油，放56温箱中2h后，分批加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于04保存)。使用前，将母液用PBS稀释后使用。2. 本实验染色采用倒置染色法，具体方法如下：在玻璃板上用废旧载玻片作支架，