（植物学专业论文）固定化酿酒酵母细胞的制备及其性能的研究.pdf

西北师范大学研壬 岔廿戈摘要 a b s t r a c t 中文摘要 本论文包括四部分 第一章固定化细胞技术及其应用研究进展 本章综述了固定化细胞的方法 载体材料及其应用 详细阐述了常用固定化细胞 的载体材料 固定化细胞载体材料的改进 固定化细胞在食品与发酵工业 化学与医 药工业 能源开发和环境工程上的应用 总结了固定化细胞的优异性能 并对未来的 发展给予展望 第二章酿酒酵母的分离鉴定 本章利用富集培养基 分离培养基 鉴定培养基等 通过稀释涂板法 平板划线 分离法 从土壤中分离出1 株酿酒酵母菌 对它的生理生化性质进行研究 并做了初 步的鉴定 鉴定为内孢霉目 酵母属 酿酒酵母 第三章固定化细胞材料的钊备及其性能研究 本章包括两节 第一节卡拉胶 瓜儿豆胶和膨润土固定化细胞材料的制备和性能研究 首次以卡拉胶 瓜儿豆胶和膨润土为载体固定化酿酒酵母 制备出具有高强度的 卡拉胶 瓜尔豆胶 膨润土复合材料 利用正交设计优化了复合材料制备条件 并利用 机械强度 扫描电镜 x 射线衍射 红外 热分析对此复合材料进行了表征 第二节卡拉胶 瓜儿豆胶和有机膨润土固定化细胞材料制备及其性能的研究 首次利用卡拉胶 瓜儿豆胶和有机膨润土为载体制备固定化酿酒酵母 制备了一 种新型的卡拉胶 瓜尔豆胶 有机膨润土复合材料 利用正交设计优化了复合材料制备 条件 并利用机械强度 扫描电镜 x 射线衍射 红外 热分析对此复合材料进行了 表征 第四章固定化酿酒酵母细胞的制备及性能研究 制备了固定化酿酒酵母进行了酒精发酵试验 确定了其最佳发酵发酵条件 通过 电镜可以看到复合材料的表面和内部均有大量的酿酒酵母细胞生长 用机械强度 s e m i r 等对固定化细胞进行了表征 通过试验室发酵试验得出酿酒酵母菌的最佳发 酵条件 温度为3 0 c p h 值为5 时间为7 2 h 时固定化细胞发酵酒精的最大产率为 1 5 1 关键词固定化细胞酿酒酵母卡拉胶瓜尔豆胶无机膨润土有机膨润土酒精 西北师范大学研士尹盛融j 亡 摘要 a b s 仃a d a b s t r a c t t h i sa r t i c l ei n c l u d e sf o u rp a r t s p a r ti ar e v i e wo nr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to ft e c h n o l o g yo f i m m o b i l i z e dc e l l sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n s i n t h i sp a r t t h em e t h o do fi m m o b i l i z e d c e l lp r e p a r a t i o n t h es u p p o r to fi m m o b i l i z e d c e l l sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n sw e r el o o k e db a c k f r e q u e n t l yu s e d s u p p o r to fi m m o b i l i z e d c e l l sa n dt h ea p p l i c a t i o no fi m m o b i l i z e dc e l l si nf o o d s t u f fa n df e r m e n t a t i o ni n d u s t r y c h e m i c a la n dm e d i c a li n d u s t r y e n e r g ys o u t c e sa n de n v i r o n m e n te n g i n e e r i n gw e r e d i s c u s s e d f r e q u e n t l yu s e d s u p p o r ta n dt h ei m p r o v e m e n to ns u p p o r to fi m m o b i l i z e dc e l l s w e r ee m p h a s i z e d t h ee x c e l l e n tp r o p e r t i e so fi m m o b i l i z e dc e l l sa n db r i g h tf u t u r ew e r e g i v e n p a r t i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e i nt h i sp a r t s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e w h i c hc a np r o d u c ea l c o h 0 1 w e r ei s o l a t e d f r o mt h ef o o ts o l lo f m a i z e a n da l s oi tw a si d e n t i f i c d p a r th i s t u d i e so np r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fi m m o b i l i z e d m a t e r i a l t h i sp a r ti n c l u d e st w os u b s e c t i o n s e c t i o no n e s t u d i e do f fp r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fm o n t m o r i l l o n n i t e c a r r a g e e n g u a rg u mg e ls p h e r i c a lb e a d s an e ww a yt o p r e p a r ec o m p o s i t eg e ls p h c r i c a ib e a d su s i n gm o n t m o r i l l o n n i t ea sa m o d i f i e rw a sc a r r i e do u t t h eb e a d sw e r ec h a r a c t e r i s e db yd e t e r m i n i n gt h e i rm e c h a n i c a l s t r e n g t h a n db yx r a yd i f f r a c t i o n x r d a n df i i rs p e c t r o s c o p y t h e i rt h e r m a ls t a b i l i t y a n ds w e l l i n gk i n e t i c sw e r ea l s od e t e r m i n e d s e c t i o nt w o s t u d i e do ns t u d i e do np r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fq u a t e r n a r y m o n t m o r i l l o n n i t e c a r r a g e e n g u a rg u mg e ls p h e r i c a lb e a d s an e ww a yt op r e p a r ec o m p o s i t eg e ls p h e r i c a lb e a d su s i n gq u a t e r n a r y m m ta sa m o d i f i e rw a sc a r r i e do u t t h eb e a d sw e r ec h a r a c t e r i z e dw i t hs e m m a c h i n ei n t e n s i t y x r da n df i q r t h et h e r m a ls t a b i l i t yo ft h ec o m p o s i t eg e ls p h e r i c a lb e a d sw a sa l s o i d e n t i f i e d p a r t s t u d i e so n p r e p a r a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o no fl i v i n g 西北师范大拳研士垆崔静j 亡 摘要 a b s t r a c t 黝c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ec e l li m m o b i l i z a t i o n t h i ss t u d yc a r r i e do nt h ef i r s t s t e pr e s e a r c h t ot h ep o s s i b i l i t yt h a tt u r n sl i v i n g s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ec e l li m m o b i l i z a t i o n a n dt h ee f f e c to fs t o r a g et i m eo nt h ec e l l a c t i v i t yw a sa l s os t u d i e d a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o nw e od e t e r m i n e d t h et e m p e r a t u r ei s3 0 c p hi s5 t i m ei s7 2 h k e y w o r d s i m m o b i l i z e d c e l l s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e c a r r a g e e n g e a rg e m m o n t m o r i l l o n n i t e q u a t e r n a r y m o n t m o r i u o r m i t e a l c o h o l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不 包括其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得西北师范大学或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意 签名 日期 关于论文使用授权的说明 本人完全了解西北师范大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校 有权保留送交论文的复印件 允许论文被查阅和借阅 学校可以公布论文的 全部或部分内容 可以采用影印 缩印或其他复制手段保存论文 保密的论文在解密后应遵守此规定 日期 西北师范大学研壬笋盘世t第一幸固定化细胞技术及其压用研冗进展 综述l 第一章固定化细胞技术及其应用研究进展 综述 1 引言 固定化细胞技术是2 0 世纪7 0 年代在固定化酶的基础上发展起来的高新技术和方 法 就是将具有一定生理功能的生物细胞 例如微生物细胞 植物细胞或动物细胞等 用一定的方法将其固定 作为生物催化剂而加以利用的一门技术 固定化细胞与固定 化酶技术一起组成了现代的固定化生物催化剂技术 1 早在19 世纪初叶 人们就利用微生物细胞在固体表面吸附的倾向而采用滴滤法 来生产醋酸 后来 又有人将类似方法来进行污水处理 现代的固定化细胞技术 是在固定化酶技术的推动下而发展起来的 1973 年 日本首次在工业上成功地利 用固定化微生物细胞连续生产l 天冬氨酸 接着 固定化细胞技术受到广泛重视 并 很快从固定化休止细胞发展到固定化增殖细胞 至今 在生产菌种方面已很少有未 被涉足过的研究领域了 固定化细胞的应用范围极广 目前已遍及工业 医学 制药 化学分析 环境保 护 能源开发等多种领域 在工业方面 如利用产葡萄糖异构酶的固定化细胞生产果 葡糖浆 将糖化酶与含n 淀粉酶的细菌 霉菌或酵母细胞一起共固定 可以直接将 淀粉转化成葡萄糖 利用涨澡酸钙或卡拉胶包埋酵母菌 通过批式或连续发酵方式生 产啤酒 利用固定化酵母细胞生产酒精或葡萄酒 此外 还可利用固定化细胞大量生 产氨基酸 有机酸 抗生素 生化药物和甾体激素等发酵产品 在医学方面 如将固 定化的胰岛细胞制成微囊 能治疗糖尿病 用固定化细胞制成的生物传感器可用于医 疗诊断 在化学分析方面 可制成各种固定化细胞传感器 除上述医疗诊断外 还可 测定醋酸 乙醇 谷氨酸 氨和bod 等 此外 固定化细胞在环境保护 产能和生 化研究等领域都有着重要的应用 2 固定化细胞及其特点 关于固定化细胞 到目前为止 尚没有任何权威机构对其做出准确的定义 多数 文献是这样定义的 固定化细胞就是被限制自由移动的细胞 即细胞受到物理 化学 等因素约束或限制在一定的空间界限内 但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连 续使用的活力 也有这样定义的 固定化菌体是把菌体细胞中特定的酶不经分离提纯 直接用适当的方法将菌体加以固定化来催化各种生化反应 不管是哪种定义 固定化 细胞都有细胞不能自由移动的特征 并且还具有活性 可以使用 西北师范大学硝士笋在糟i第一章固定化细胞技术及其应用研究进展 综连 固定化细胞按其细胞类型有固定化微生物 植物和动物细胞三大类 按其生理状 态又可分为固定化死细胞和活细胞两大类 与固定化酶相比 固定化细胞具有以下优点 4 1 省去酶的分离费用 多酶系统 无需辅酶再生 细菌生长停滞时间短 细胞多 反应快 对污染的抵抗力强 可连续 发酵 蒸馏或提取前不用分去细胞 保持酶的原始状态 从而加强了稳定性 可连续 使用 节约养料 使用固定化细胞反应塔 一边进料 一边排出发酵液 避免反馈抑 制和产物消耗 固定化细胞还具有天然游离细胞所不具备的许多优点 固定化细胞 的细胞浓度大 反应速度加快 有较高的生产能力 细胞被固定化后 不会产生流 失现象 分离纯化过程中菌体细胞易分离 固定化细胞可多次重复使用 当然 固定化细胞也有其自身的缺点 如 必须保持菌体的完整 防止菌体的自溶 否则影 响产物的纯度 必须抑制细胞内蛋白酶对所需酶的分解 胞内多酶存在 会形成副产 物 载体 细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍 3 固定化细胞的制备方法 从理论上讲 任何一种限制细胞自由流动的技术 都可以用于细胞的固定化 一 般认为 理想的细胞固定化方法应具备以下八个特点 应该能够控制固定化细 胞的大小和孔隙度 所使用的原料应该便宜 易得 固定化成本应尽量低 方法 应简单 易行 固定化过程应尽可能温和 尽量少损伤细胞 固定化细胞应具有稳 定的网状结构 在使用的p h 值和温度下 不会被破坏 固定化细胞应具有良好的 机械稳定性和化学稳定性 用于制各固定化细胞的载体 对细胞应该是惰性的 即 不损伤细胞 固定化细胞应使底物 产物和其他代谢能够自由扩散 单位体积的 固定化细胞应该拥有尽可能多的细胞数 目前 用于制备固定化细胞的方法种类繁多 新方法也层出不穷 加上不同的研 究者采用不同的分类方法 对此很难作出精确的分类 考虑细胞与载体间的作用力 固定化细胞的状态 载体的来源及固定化细胞的制备过程等因素 对细胞固定化方法 进行分类如下 3 1 载体结合法 载体结合法是基于细胞与载体之间通过物理吸附 离子结合 共价结合及生物特 异性吸附等作用将细胞固定在不溶性载体上 根据细胞与载体 b j 的作用方式 载体结 合法又可分为以下四类 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 生物特异性吸附法 3 2 交联法 交联法又称无载体固定化法 该法不利用载体 细胞之间依靠物理的或化学的作 2 西北师范大学研壬笋垃玲戈第一章固定化细胞技术及其应用研究进展l 综述 用相互结合 因此 交联法又分为化学交联法和物理交联法 化学交联法足细胞与醛 类 胺类 水合金属氧化物等带有双功能或多功能墓团的交联剂进行交联反应 在它 们之间形成共价键 从而固定化细胞的方法 物理交联法是指在细胞培养过程中 适 当改变细胞悬浮液的培养条件 如 离子强度 温度 p h 值等 使微生物细胞间发 生直接作用而颗粒化 p e l l e t i z a t i o n 或絮凝 f l o c c u l a t i o n 来实现固定化的方法 又称自固定化法 3 3 载体分隔法 载体分隔法是指依靠载体对细胞的物理阻挡来实现细胞的固定化的方法 载体分 隔法又分为包埋法和微胶囊法 3 3 1 包埋法 包埋法是将细胞封闭在天然高分子多糖或合成高分子凝胶的网络中 从而使细胞 固定化的方法 其原理是将细胞载留在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中 主 要是物理作用 个别也存在化学键 其特点是能将固定化细胞制成各种形状 球状 块状 圆柱状 膜状 管状等 强度较高 并且对细胞活性影响较小 固定化后细 胞能增殖 包埋法是细胞固定化最常用的方法 此法的优点是有较好的适应性 条件 温和 方法简便 稳定性好 容量高 包埋后载体可以防止机械作用对细胞的损害 但此法也有缺点 载体大分子对底物和产物的扩散阻力大 包埋材科可分为天然高分子和合成高分子化合物两大类 常用的天然高分子有 琼脂 海藻酸钙 卡拉胶 k 一角叉菜聚糖 淀粉 明胶等 其中海藻酸钙和卡拉胶具 有固化 成形方便 对微生物细胞毒性小及固定化密度高的优点而应用广泛 合成高 分子化合物中常用的载体物质有聚丙烯酰胺 聚乙烯醇 光硬化树脂等 它们的突出 优点是抗微生物分解性能好 机械强度高 化学性能稳定 但聚合物网络的形成条件 比较剧烈 对细胞的损害较大 而且成形的多样性和可控性不好 3 3 2 微胶囊法 微胶囊固定化法是指通过乳化作用将细胞包封在各种多聚物制成的半透性微胶 囊内的方法 微胶囊在微生物细胞 动植物细胞的固定化培养过程中主要是能形成一 种微小的培养环境 使固定化细胞培养过程与液体培养差别不大 降低了培养时剪切 力对细胞的影响 使搅拌和直接通气等操作不会影响细胞的正常生长 提高了细胞密 度 并使细胞得以重复和继续使用 而不会大量流失 比较有利于底物和产物扩散 但反应条件要求高 制备成本也高 制备微胶囊固定化细胞有以下几种方法 界面 聚合法 此法是将疏水和亲水单体在界面进行聚合 使细胞包封于半透膜中 常用的 西北师范大学研壬拳拦静名第一幸固定化细胞技术厦其应用研究进展 综迷 亲水单体有乙二醇 内三醇等 疏水单体有的多异氰酸等 液体f 燥法 此法是将 细胞悬浮液加于一种聚合物溶液中 再加油溶性表面活性剂 使上述混合液成为 油 包水 型乳化液 接着把这种混合液加入到含有保护胶质的溶液中 再次形成乳化液 然后真空低温干燥 便得到微胶囊 常用的聚合物有乙基纤维素 聚苯乙烯等 常用 的保护胶质有明胶 聚乙烯醇等 常用的有机溶液有苯 环己烷和氯仿 干相法 此法是将聚合物先溶于与水不相溶的有机溶液中 然后加细胞悬浮液 搅拌形成微小 水滴 此时 再边搅拌边加另一种与水不相溶的有机溶剂 聚合物在这种有机溶剂中 不溶 改变温度和加入的有机溶剂的量 则聚合物就会在微水滴周围浓缩并形成薄 膜而制成分散胶囊 聚合物如用乙基纤维素时 第一 二种有机溶剂分别为四氯化碳 和石油醚 如用硝基纤维素则有机溶剂分别为乙醚和苯甲酸丁酯 液膜法 脂膜法 其主要特点是以脂质体为液膜代替半透膜 脂质体由卵磷脂和表面活性剂等组成 3 4 系统截流法 系统截流法利用各种半透膜 如渗析膜 超滤膜 反渗透膜 中空纤维膜等 将 细胞限定在空间范围内 或将过滤 离心 沉淀后的细胞返回到生物反应器中循环使 用 与其他固定化方法相比 这种固定化方法 具有以下优点 可以使基质与微生物 细胞充分接触 进行有效的反应 固定化方法非常简单 通过控制膜的孑l 径可以选择 性地控制底物和产物的扩散 防止细胞的泄露 当然 该法也有一些缺点 如膜的污 染堵塞 导致反应速率下降等 3 5 固定化方法的改进 3 5 1 减少固定化过程中的活性损失 尉迟力 等则采用琼脂一陶瓷粒双介质包埋甲烷氧化细菌菌株 固定化方法为 将l m l 3 琼脂 5 0 和0 5 m l o d o 2 9 7 的菌悬液混合 5 0 陶瓷粒加热到5 0 加入混合液中 冷至室温 这样克服海藻酸钙包埋固定化细胞在甲烷制甲醇反应中的 缺点 因为琼脂是细菌的最适培养基 有利于保持细菌的生物活性 而陶瓷粒则能增 加固定化细胞的强度 3 5 2 提高固定化细胞颗粒的强度 为克服海藻酸钙凝胶在使用过程中不能抵抗细胞生长所必需的高浓度的磷酸盐 和m g k n a 等阳离子 不耐热 凝胶强度不够及易破碎溶解的不稳定性质 宋向 阳等 用海藻酸铝凝胶代替海藻酸钙固定化树干毕赤酵母 可明显延长固定化酵母的 使用寿命 海藻酸铝凝胶耐磷酸盐能力是海藻酸钙凝胶的3 倍 田小光 1 也采用此 法提高海藻酸钙凝胶固定化细胞的强度 王洪祚 等报道海洪 顾缪等用聚乙烯亚胺 4 西北师范大学研士 往醑戈第一章固定化细胞技术及其应用研究进展 综速 溶液来处理海藻酸钙凝胶 段俊英等 通过加入甾醇 不饱和脂肪酸及改变c a c i 浓 度等均可达到提高凝胶粒子的机械强度 改善固定化细胞稳定性e 1 的 添加2 9 l c a c o 也能使制得的海藻酸钙固定化颗粒在发酵时能保持稳定性 将其表面被覆壳聚糖也可 以提高其强度 李花子等 1 采用延时包埋法与加入化学药剂法对聚乙烯醇一硼酸固定法进行了改 进 结果表明 用这两种方法制得的聚乙烯醇固定化颗粒的水溶膨胀性大大减少 不 易破碎 电镜观察发现 改进后的聚乙烯醇凝胶网状结构明显优于未经过改进的聚乙 烯醇凝胶的网状结构 其具体做法 延时包埋方法 a 细胞湿重5 9 悬浮于5 m l 0 0 0 9 9 m l 的n a c i 中 b 制备1 2 5 m l0 i g m l 的聚丙烯醇和0 o l g m l 的海藻酸钠 混合溶液 加热溶解 在室温下静置4 h c 以上2 种溶液混合 并搅拌均匀 d 用 内径为0 4 0 r i o n 的注射器滴加到冷却的饱和硼酸与0 o l g m l c a c l 的混合溶液中 使 其形成2 m m 直径的白色球型小珠 并在其中浸泡2 4 h e 用生理盐水洗涤2 次 即可 使用 加入化学试剂法 在基本包埋方法的基础上 加入0 0 5 9 m l 单体丙烯酰胺和 0 0 0 6 9 m l 交联剂n n 一亚甲基双丙烯酰胺 童群义等 1 报道了聚乙烯醇一卡拉胶混合载体固定化大肠杆菌一酵母菌混合体系 结果表明 在聚乙烯醇浓度l o 卡拉胶浓度0 5 成型剂的p h 值6 4 菌体量0 5 9 g 固定化细胞 固化时间3 6 h 的条件下 固定化细胞具有较好的机械强度和较高的酶活 力 4 固定化细胞的载体 固定化细胞技术的关键是所采用的固定化载体材料的性能 4 1 选择载体的标准 选择载体的标准是 对细胞无毒 不影响细胞的代谢 具有良好的传质性能 具有高的载体活性 即固定化细胞的活性回收率要高 载体固定化细胞的容量要 大 即要有高的细胞负载量和活性 载体材料要容易获得 价格便宜 操作制备 方便 能适于大规模生产 有较高的机械强度 能较长时间的使用和重复使用 生物 化学及热力学稳定性 在选择载体时 还应该考虑到固定化方法 具有离子交换基团和吸附蛋白能力的 如d e a e 纤维素 藻土 磷灰石等均可作为物理吸附和离子结合法的载体 能形成凝 胶或进行凝聚的琼脂 角叉菜聚糖 海藻酸盐 明胶 聚丙烯酰胺等 可作为包埋法 的载体 4 2 固定化细胞载体材料的分类及性能 西北师范大擘硝士乒白管 之第一章固定化细胞技术厦其应用研冗进展 综进 自固定化技术兴起以来 其载体材料的研究就备受关注 也取得了不少成就 但 在实际应用中还存在许多问题需要解决 所以许多学者仍一直致力于新载体材料的研 制和应用 目前制备固定化细胞的常用载体材料主要分为三大类 有机高分子载体 无机载体和复合载体 4 2 1 有机高分子载体材料 有机高分子载体材料又分为天然高分子凝胶载体和合成有机高分子凝胶载体 天然高分子载体材料一般对生物无毒性 传质性能好 但强度较低 在厌氧条件 下易被微生物分解 寿命短 常见的此类载体 多糖类如 琼脂 角叉菜聚糖 海藻 酸盐 甲壳素 壳聚糖 纤维素等 蛋白质类载体如明胶 胶原等 这几类载体中琼 脂的机械强度较差 合成有机高分子载体材料一般强度较大 但传质性能差 在进行固定化时 对细 胞活性有影响 常见的此类载体有 聚丙烯酰胺 聚乙烯醇 光硬化树脂 等 聚丙 烯酰胺的突出优点是抗微生物分解性能好 机械强度高 化学性能稳定 但聚合物网 络的形成条件剧烈 对微生物细胞的损害较大 而且成型的多样性和可控性不好 聚乙烯醇加热后溶于水 向其水溶液中加入硼酸 或硼砂后发生凝胶化 或者由 该聚合物的浓溶液经冻融制备成冻凝胶 冻凝胶孔径大 孔隙率高 操作稳定性好 除上述特点外 它的流变学性质优良 可适用于多种类型的反应器 不易被微生物降 解 化学惰性强 无毒 生物相溶性好 价廉易得 近十年来得到了广泛得研究和应 用 目前已有6 0 多种细胞 包括大肠杆菌 酿酒酵母 面包酵母 啤酒酵母 动植 物细胞等都用聚乙烯醇冷冻胶固定并取得了良好的效果 但聚乙烯醇凝胶有时由于交 联不彻底 在高温下强度交低 若在凝胶制备过程中加入少量粉末活性炭 可以提高 凝胶强度 2 5 几种常见固定化细胞有机载体性能的比较如表 卜2 表卜2 几种同定化细胞有机材科性能比较 西北师范大学硝壬 缮礁之第一章固定化细胞技术厦其应用研究进展 综述 甲壳素和壳聚糖是近年来研究的比较热门的新钱体 甲壳素是自然界中唯一的氨 基多糖 其学名为 1 4 2 乙酰胺一2 一p 一1 葡聚塘 它既能生物合成 又能生物 降解 广泛存在于虾 蟹和昆虫的外壳以及菌类和藻类的细胞壁中 是一种储量极为 丰富的自然资源 在一定条件下 甲壳素脱去分子中的部分乙酰基就转变为溶解性较 好的壳聚糖 甲壳素 壳聚糖是具极大潜力的固定化载体 周华等以甲壳素为载体固 定化大肠杆菌制备l 一天冬氨酸 潘光亮等利用甲壳素固定化大肠杆菌转化苯丙酮酸 形成l 一苯丙氨酸 江龙法等以壳聚糖微胶囊固定化红酵母细胞 硅橡胶无毒 机械强度高 传质性能好 对氧气和二氧化碳有很好的通透性 而 且硅橡胶是疏水性的材料 对于底物常是难溶于水的有机化合物的生物转化反应来说 尤其适合 潘冰峰等采用有机硅橡胶制备固定化细胞将1 2 苯乙酮还原为1 2 一 二苯基羟基乙酮 王延春 刘践等 1 采用低温辐射聚合法将亲水性单体甲基丙烯酸一b 一羟乙酯 h e m a 与疏水性单体甲基丙烯酸乙酯 e l a 甲基丙烯酸丁酯 b m a 共聚制备强 度大 韧性好的高分子材料 用以固定化酵母细胞 这种亲水性和疏水性单体共聚制 各的固定化细胞载体可以克服物理吸附法固定化细胞的不足之处 细胞容易脱落 所制得得固定化细胞的重复反应性比较好 吴斌等 5 1 用可见光固化树脂固定化含黄嘌呤脱氢酶的细胞 具体制备固定化细胞 的方法 取一定体积的可见光固化树脂置于玻璃板上 用玻片将其压成l m m 厚的薄片 然后将蒸馏水溶解的细胞悬浮液均匀涂布其上 立即盖上另一块同样大小树脂薄片 用玻片将两块树脂片压紧 用波长4 8 6 3 n m 光照强度1 5 9 2 m w c m 2 的蓝光照射1 5 m i n 即得可见光固化树脂固定化细胞 庞永新制备一系列光固化水凝胶固定化枯草杆菌发 酵产d 一淀粉酶 4 2 2 无机载体材料 无机载体如多孔陶珠 红砖碎粒 砂粒 活性炭等 具有机械强度大 对微生物 无毒性 不易被微生物分解 耐酸碱 成本低 寿命长等特征 是一类重要的载体材 料 这类载体大多具有多孔结构 在与微生物接触时 利用吸附作用和电荷效应 把 微生物固定 无机载体内部有较大的孔隙度 可以容纳不断增殖的微生物 使载体内 细胞浓度增大 常见的几种无机载体中 多孔陶珠的吸附能力强 孔径可调控 针对不同大小的 微生物 可选用相应规格的陶珠作载体 灵活度大 但其成本高 红砖碎粒是一种来 源广 成本低 易制造的细胞固定化载体材料 在吸附性能 耐酸碱等方面 具有实 7 西北师范大学硝士 崔 口戈 蒡一幸固定化细胞技术及其压甩研完进展 综述 用性 具备了载体材料的基本条件 有较大的应用前景 4 2 3 复合载体材料 由于有机载体材料和无机载体材料各有优缺点 而两类材料在许多性能方面互 补 因此 可将这两类载体材料结合 组成复合载体材料 以改进材料的性能 薛胜伟等 1 在制备海藻酸钙固定化细胞生产丙烯酰胺时加入粉木活性碳 硅藻 土 提高海藻酸钙的机械强度及酶活性 为固定化细胞生产丙烯酰胺实际生产应用提 供了可能性 李淑彬等 1 采用聚乙烯醇 p v a 加少量的海藻酸钠和活性炭的方法对一 株能高效降解甲胺磷的细菌假单胞菌菌株进行固定化 用于降解甲股磷 他们所用复 合固定化体系包括3 个组分 生物催化剂 吸附剂和固态底物 其中 吸附剂主要用 于富集有毒污染物 提供给微生物进一步生物降解 并能减轻其对生物催化剂的抑制 作用 固态底物用于支持降解并减少其他生物的干扰 结果表明 复合固定化体系能 更加有效地降解污染物 显示出复合载体材料的优越性 闵航等 以聚乙烯醇为主要包埋材料 由海藻酸钠 f e 粉 c a c o s i o 粉末构 成复合载体 包埋固定厌氧污泥 对以蔗糖为主要碳源的模拟废水进行处理 刘春芳州报道m a e k a w a j p 等发明了一种制备固定化微生物的磁性载体的方法 该发明的特点是将微生物与超顺磁体一起包埋 所形成的磁性载体在处理室中的运动 通过磁力进行控制 将一定浓度的丙烯酰胺 a c y u v 单体或聚乙烯醇 p v a 海藻酸钠 交联剂n n 一亚乙烯基双丙烯酰胺 引发剂n n n n 一四乙基乙二胺以及包括 氧化铁粉末的超顺磁体 u l t r a p a r a m a g n e t i cb o d y 等配制成组分a 将活性污泥离 心 制备成菌悬液 作为组分8 将一定浓度的甲酸钙溶液和过硫酸铵 过硫酸铵可 加强微生物小球的强度 配制成水溶液作为组分c 将组分b 与a 以 3 i 5 4 或最好为 5 2 5 5 3 的比例混合 滴入组分c 中 形成海藻酸钙的膜包裹的小 球 并在溶液c 中放置3 0 m i n 使丙烯酰胺单体在交联剂的作用下进行交联反应 完 成凝胶化作用 并使微生物及超顺磁体包埋在凝胶中 制得具有适当强度的 包埋在 海藻酸钙薄膜中的固定化微生物的球形载体 将其浸入c 磷酸钾 0 0 5 m o l l 溶液 中 浸出载体表层的海藻酸钙 使之形成平均粒径在3 m m 的多孔的固定化微生物的球 形载体 这种方法用于包埋的微生物可以是活性污泥 也可以是厌氧消化污泥 这样 制得的载体 可用于废水的间歇式处理 固定床或流化床处理 高分子复配物是两种不同性质的高分子体系 经由氢键力 库仑力 给 受电子 体的相互作用 范德华力 疏水键力等次价力聚集而成 许多天然或 和 合成高分子 复合物载体的优良传质性能 对水 电解质及氧的透过选择性和良好的生物相容性 8 西北师范大擘矽壬笋舷静t第一章固定化细胞技术厦其应用研究进展 综述 显示了良好的应用前景 y u k a n gy u a n 等 7 1 发明了一种用海藻酸钙 聚乙二醇 p e g 聚乙烯酰胺 p e i 的复合载体固定微生物的方法 将以上三种物质和微生物与c a c l 水溶液混合制成微 生物小球 p e i 是携带正电荷的高聚物 对海藻酸钙有静电引力 因而加强了微生物 小球的结构 唐学友 1 利用k 一卡拉胶一魔芋多糖复配胶包埋的固定化啤酒酵母细胞 由腺苷 a 生产三磷酸腺苷 a t p 固定化酵母的制备方法 将k 一卡拉胶钠盐与魔芋多糖精粉按 4 1 比例溶于水中 并配制成4 的溶液 该溶液于4 5 保温备用 将此复配胶溶液 l o o m l 与l o o g 啤酒酵母混合均匀 然后用注射器滴入k c i 溶液制成2 m m 直径的颗粒 或冷置后切割成2 咖左右的小块 在一3 0 冰箱保存待用 在卡拉胶中加入魔芋多糖 进行复配 改善了载体的脆性和泌水性等性能 不但有利于菌体反复使用 而旦便于 产物分离提取 节约成本 提高产品质量 与明胶一戊二醛方法相比 它不易被微生 物的蛋白酶所分解 此外 p v a 一卡拉胶 丹宁一卡拉胶 三醋酸纤维素酯一海藻酸钙 聚乙烯亚胺一卡 拉胶 p v a 海藻酸钙 硅胶一褐藻酸钙 p e a e 纤维素 p m m a 及聚乙烯基毗啶 q e s e p h a d e x a 5 0 等复合物凝胶的应用都有许多报道 王洪祚嘶1 在离聚体的系统研究 基础上 将其引入载体材料与天然及合成高分子分别形成共混及互穿聚合物网络体 系 用于酶及细胞的固定化 显示了高分子复合物载体强度高 性质稳定及传质性能 好的特点 由于载体骨架的结构和性能对固定化细胞的固定化效果起着决定性的作用 所以 寻找适合固定化细胞的新型高分子载体材料并对具体的固定化过程进行优化是十分 重要的 根据不同的固定化对象可以研究开发一些新型的高分子载体材料 并根据一 定的优化方案找出具体固定化体系的最优固定化条件 5 固定化细胞的应用 目前 固定化细胞已在食品与发酵工业 化学合成工业 医疗诊断 环境污染治理与检 测 能源开发等各个领域得到广泛的应用 下面重要介绍固定化细胞在食品与发酵工业 化 学与医药工业 能源开发与环境工程等方面的应用现状 5 1 食品与发酵工业中的应用 乳制品工业中采用的固定化细胞技术较多 将乳酸菌包埋于海藻酸钙凝胶中 进 行连续培养生产乳酸 奶酪的制作中也常用到海藻酸钙包埋的含酶的细胞 以控制熟 化进程 也有利用流化床生物反应器生产l 一乳酸 北京农业大学1 9 9 5 申请的一份专 9 西北师范大学硝士学拉静戈第一 固定化细胞技术及其应 f f i 研究进展 综述 利中 采用海藻酸钠和明胶为固定化双歧杆菌的线体 通过针头注入c a c i 溶液中 得到直径为0 5 一1 o m m 的双歧杆菌胶粒 此胶粒可在一定程度上避免氧或酸对菌体的 侵害 延长了活菌的保存期 海藻酸钙固定化双歧杆菌可添加到对于菌体存活较恶劣 的食品中 李学梅等 采用海藻酸钙包埋法固定化米根霉 发酵生产l 一乳酸 固定化米根 霉菌体在颗粒表面形成一层菌丝膜 有利于氧气和其它营养物质的传递 三相流化床 生物反应器结构简单 动力消耗低 反应器内物质混合均匀 氧传递量大于固定化米 根霉的需氧量 非常适合好氧的固定化米根霉发酵 常秀莲m 以海藻酸钙为载体进行了德氏乳酸丰t 菌的固定化乳酸发酵的研究 发现 胶粒的直径 对乳酸收率没有明显的影响 底物浓度对细胞活性有一定的影响 产物 乳酸对发酵有抑制作用 提出了产物抑制的乳酸发酵动力学模型 r d a r a k t c h i e v j c c o t t o n 等 删报道了用固定化细胞生物反应器发酵生产乳酸 近年来 固定化细胞技术在调味品生产中得到了广泛的研究 如酱油发酵 酿醋 谷氨酸发酵 香味剂生产等 据王建龙 1 报道日本的o s a k i 等首先对利用固定化细胞生产酱油进行了研究 他 们以海藻酸钙为载体 制备了固定化细胞用于连续生产酱油 酿醋是固定化细胞技术最古老的应用 近年来 利用固定化细胞技术酿醋的研究 领域同趋活跃 在大多数情况下 获得了较高的生产速率 7 3 9 l h 且操作稳定 性好 但醋酸的最大浓度加较低 7 5 9 l 其主要原因可能是由于固定化细胞内供 氧不足 刘松青 用角叉菜聚糖固定化细胞连续发酵生产马铃薯醋 并进行了中试 产品达到了食醋的质量标准 发酵周期约为4 天 淀粉转化率达9 5 以上 酒精转酸 率达7 5 以上 利于自动化 现代化生产 吴茂玉 等采用多种菌共固化发酵生产苹 果酸 确定了较佳的生产工艺 利用气升式悬浮床生物反应器生产葡萄酒醋等也有许 多报道 但大多数停留在实验阶段 高放m 1 研究用改进的聚乙烯醇一硼酸法包埋固定化黑曲霉细胞与葡萄糖异构酶协 同反应生产高含量低聚果糖的优化条件 用优化条件制得的固定化细胞与葡萄糖异构 酶协同转化生产低聚果糖 重复利用性好 且转化率高于单独使用黑曲霉 王克明等 利用粉丝废液固定化红曲发酵生产红曲色素 对以粉丝生产废液为主 要培养基 以聚乙烯醇海藻酸钠双载体固定红曲 最佳发酵条件 采用气升式生物反 应器重复发酵生产红曲色素进行了考察研究 目 工业上生产木糖醇均采用木糖化学催化加氢的方法 其设备和工艺复杂 成 1 0 西北师范大学舻士尹搓板第一章固定化细胞技术蕊乓应用研究进展 综述 本较高 一定程度上限制了其应用 陈爱政等 考察了以游离莫格氏假丝酵母 c a n d i d am o g iia t c c 细胞 海藻酸钠固定化莫格氏假丝酵母 c a n d i d am o g iia t c c 细胞 壳聚糖 海藻酸钠 a c a 微胶囊固定化莫格氏假丝酵母 c a n d i d am o g i ia t c c 细胞的木糖醇发酵 发现与游离 海藻酸钠固定化发酵相比 微囊化发酵转化率更高 更稳定 其转化率稳定在6 5 左右 发酵周期约为5 0 h r o c a 等 1 在一个实验规模的填充床生物反应器中用固定化重组酵母菌生产木糖 醇 发现厌氧条件可提高木糖醇的产量 并可通过调节反应液的停留时l 丑j 来提高木糖 醇的产率 何嘉波等 采用卡拉胶 明胶 壳聚糖 聚乙烯亚胺 聚乙烯醇固定化酵母 进 行了批木糖转化试验 确定聚乙烯醇膜状载体为最佳载体 在最佳工艺条件下 经 2 0 批次发酵结果表明 平均转化率7 0 8 平均生产强度2 2 7 9 l 另外 陈九武等o 以海藻酸钙 聚乙烯醇为材料包埋固定化产酯酵母细胞 建立 了聚乙烯醇水凝胶的固定化产酯酵母方法 并对聚乙烯醇水凝胶固定化的产酯酵母的 产酯活性与海藻酸钙凝胶固定化产酯酵母的进行了比较 该凝胶在产酯活性 机械强 度 使用寿命 贮存稳定性等方面均优于后者 辛嘉英等伽以流化床作为固定化体系 在硅藻土颗粒表面构建了混合培养的甲烷氧化细菌的吸附膜 通过最佳配比的混合连 续循环通入流化床反应器中抽提产物环氧丙烷 克服了产物抑制 该生物反应器最初 产生环氧丙烷的日产量为1 1 0 1 5 0 um o l d 连续操作2 5 d 未观察到坏氧丙烷生产 能力的明显减小 薛胜伟等 固定化细胞生产丙烯酰胺 用固定化细胞发酵生产丙酸 没食子酸等有机酸也有报道 5 2 固定化细胞在化学工业和制药工业的应用 胥秀英等侧用海藻酸钠凝胶液固定化酵母细胞生物合成l 一苯基乙酰基甲醇 l p a c 对影响酵母菌生物合成的主要因素进行了研究 结果表明 酵母菌株按2 9 鲜细胞 3 2 5 踟l 海藻酸钠凝胶固定化后 所获固定化凝胶珠置于装有4 倍体积反应 液的容器中 在振荡频率2 2 0 转 分 温度2 8 3 0 添加0 2 的v c 时 批次生物合 成l p a c 产量最高 达2 o g l 何成等嘲1 用海藻酸钙包埋法对增殖培养的酵母细胞进行固定化 并用于催化有机 溶剂中乙酰乙酸乙酯的不对称还原反应 娄文勇瞄 1 研究了固定化啤酒酵母细胞在水相及水一有机溶剂双相中催化三甲基 硅乙酮不对称还原反应 在优化反应条件下反应最大产率和产物的光学纯度分别商达 8 4 9 和9 0 2 及9 6 8 e e 和9 5 7 e e 西北师范大学砑士笋越磴戈第一章固定化细胞技术及其应用研究进展 综述 吉爱国 用聚乙烯醇一海藻酸钙包埋法将氧化葡萄糖酸杆菌和棒杆菌休止细胞共 固定化 以葡萄糖酸为仞始原料 探i 寸了氧化葡萄糖酸杆菌和棒杆菌共固定化细胞合 成2 一酮基 l 一古龙酸的方法 最高转化率为3 7 7 2 张建国m 1 以卡拉胶为载体 固定化棒状杆菌菌株细胞 将顺式环氧琥珀酸转化为 l 一酒石酸 固定化捧状杆菌菌株细胞经活化处理 顺式环氧琥珀酸水解酶酶活力 总回收率在1 0 0 以上 摇瓶反应1 0 批 酶活力没有明显降低 潘冰峰等 采用有机硅橡胶制各固定化细胞将1 2 苯乙酮还原为1 2 一二苯 基羟基乙酮 1 9 7 4 年y a m a m o t o 等人 采用聚丙烯酰胺固定化产氨短杆菌 b r e v i b a c t e r i u ma m m o n i a g e n e s 进行l 苹果酸的生产 1 9 8 2 年t a k a t a 等人 报道 卡拉胶固定化黄色短杆菌 b r e v i b a c t e r i u mf l a v u s 延胡索酸酶 又名富马酸酶 稳定 性提高的研究 等等 胡纯铿池1 采用海藻酸钙为载体制备固定化黄曲霉生产l 一苹果 酸 王燕 3 咖在液相培养基中将米曲霉菌体培养成直径为1 2 m m 的菌球 以甲醛为 交联剂 明胶为活性保护剂对其进行固定化 制备的固定化米曲霉菌体具有较高的操 作稳定性 用其连续拆分n 一乙酰一d 丙氨酸 半衰期为7 7 天 王燕等也对固定化米 曲霉菌体填充床拆分d l 丙氨酸的动力学行为进行了研究 分析固定化米曲霉拆分 d l 一丙氨酸的动力学特性 通过问歇反应器的实验数据处理 获得了酶促反应的动力 学参数 应用填充床的一维稳态轴向扩散模型进行数值求解 得到了模型计算值 与 实验结果比较表明 提出的模型能较好地描述固定化菌体连续拆分d l 一丙氨酸过程 华蕾等 用卡拉胶包埋串珠镰孢霉菌菌丝体 得到d 一泛解酸内酯水解酶活力较 高的固定化细胞用于拆分d l 一泛解酸内酯 用固定化细胞进行反复分批酶水解3 0 批 每天一批 酶活稳定 平均水解率2 8 0 9 6 固定化细胞冰箱 4 贮存8 周 酶活未 见下降 将黑曲酶菌固定于硅藻土和高分子泡沫中 置泡罩塔固定化反应器中生产酶制 剂 其酶活力比摇瓶培养生产的酶活力高出2 倍 张朝晖等 1 采用聚氨酯固定化黄孢原毛平革菌合成木素过氧化物酶 庞永新制备 一系列光固化水凝胶固定化枯草杆菌发酵产a 一淀粉酶 s v e t i a n ap a s h o v a st a o 等 删也都采用固定化细胞生产酶 并且取得了较好的结果 在流化床反应器中用固定化的镰刀菌孢子转化青霉素为6 一氨基青霉素烷酸 6 a p a 结果表明固定化镰刀菌孢子催化底物转化的收率较高 其生产能力与游离 孢子的相当 西北师范大学跖士 崔 p 之第一章固定化细胞技术及其应用研究进展i 咤逮 王鲁燕等 1 用海藻酸钠 卡拉胶 海绵固定化生米