植物组织可溶糖的测定.doc

植物组织中可溶性糖与淀粉的测定植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。一、苯酚法测定可溶性糖【原理】植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10100Mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nM波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定时间在160Min以上。【仪器与用具】分光光度计；电炉；铝锅；20Ml刻度试管；刻度吸管5Ml 1支，1Ml 2支；记号笔；吸水纸适量。【试剂】90苯酚溶液：称取90g苯酚(AR)，加蒸馏水10Ml溶解，在室温下可保存数月；9苯酚溶液：取3Ml 90苯酚溶液，加蒸馏水至30Ml，现配现用；浓硫酸(比重1.84)；1蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100Ml容量瓶中，加入0.5Ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；100gL蔗糖标准液：精确吸取1蔗糖标准液1Ml加入100Ml容量瓶中，加水定容。【方法】1.标准曲线的制作取20Ml刻度试管11支，从010分别编号，按表11加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1Ml 9苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以520s时间加入5Ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8Ml，在恒温下放置30Min，显色。然后以空白为对照，在485nM波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。表1-1各试管加入溶液和水的量 试管123456100ug/L蔗糖液（ml）00.20.40.60.81.0水（ml)2.01.81.61.41.21.0苯酚（ml）1.01.01.01.01.01.0浓硫酸（ml）5.05.05.05.05.05.0蔗糖量（g）0204060801002.可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.100.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入510Ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30Min(提取2次)，提取液过滤入25Ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。3.测定吸取0.5Ml样品液于试管中(重复2次)，加蒸馏水1.5Ml，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按式（11）计算测试样品中糖含量。可溶性糖含量()(CVA)(W106) 100 (11)式中C:标准方程求得糖量(g)；A:吸取样品液体积(Ml)；V：提取液量(Ml)；n：稀释倍数；W：组织重量(g)。四、淀粉的测定【原理】淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓硫酸的作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用苯酚或蒽酮试剂与糠醛化合物的显色反应，即可进行比色测定。【仪器与用具】电子天平；容量瓶：100Ml 4个，50Ml 2个；漏斗；小试管若干支；电炉；刻度吸管05Ml 1支，2.0Ml 3支，5Ml 4支；分光光度计；记号笔。【试剂】浓硫酸(比重1.84)；9.2MolLHClO4；9苯酚，同方法一淀粉标准液：准确称取100Mg纯淀粉，放入100Ml容量瓶中，加6070Ml热蒸馏水，放入沸水浴中煮沸0.5H，冷却后加蒸馏水稀释至刻度，则每毫升含淀粉1Mg，吸取此液5.0Ml，加蒸馏水稀释至50Ml，即为每毫升含淀粉100g的标准液。【方法】1.标准曲线制作取小试管6支从1-6编号，按表1-3加入溶液和蒸馏水。以下步骤按苯酚法或蒽酮法均可，见方法一或方法二，绘制相应的标准曲线。表1-3 试管123456标淀粉液（ml）00.40.81.21.62.0蒸馏水（ml)2.01.61.20.80.40苯酚（ml）1.01.01.01.01.01.0浓硫酸（ml）5.05.05.05.05.05.0蔗糖量（g）040801201602002.样品提取将提取可溶性糖以后的残渣，移入50Ml容量瓶中，加20Ml热蒸馏水，放入沸水中煮沸15Min，再用9.2MolL高氯酸4Ml提取15Min，冷却后，混匀，用滤纸过滤，并用蒸馏水定容(或以2500rMin离心10Min)。3.测定可采用苯酚法或蒽酮显色法测定。按13式计算淀粉的含量。淀粉水解时，在单糖残基上加了1分子水，因而计算时所得的糖量乘以0.9才为扣除加入水后的实际淀粉含量。淀粉含量()(CVA)(W106)100 (13)式中C：标准曲线查得的淀粉含量(g)；V：提取液总量(Ml)；A：显色时取液量(Ml)；W：样品重(g)。注：淀粉水解完全度试验：样品测定中可同时作1份用于淀