（动物遗传育种与繁殖专业论文）猪腮腺分泌蛋白表达特性及表达调控元件的研究.pdf

摘要 哺乳动物唾液腺是外分泌腺，也兼有部分内分泌功能。大多数分泌物可通过口腔直接到达胃 部，在p h ) 4 的情况f 发挥作用 少量分泌物可直接进入血液循环发挥作用。唾液蛋白种类繁多， 功能多样，往往一种蛋白有数种功能，不同蛋白有相同功能。唾液蛋白的上述特点使其具备了研 制生物反应器的条件。 腮腺分泌蛋白( p a r o t i ds e c r e t o r yp r o t e i n ，p s p ) 就是一种腮腺特异性表达的蛋白，由于它的功 能与免疫相关，引起了人f j 的关注。为了弄清p s p 的表达情况，以及它与a ，a m y ( a a m y l a s e ) 表达的关系，本研究根据已知的c d n a 序列设计引物，利用r t - p c r 、荧光定星p c r ( f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t ，q - p c r ) 对猪及小鼠的p s p 、a m y 在腮腺生后发育不同时期 的表达情况进行了研究。结果表明，猪与小鼠的p s p 在腮腺生后发育的各时期都是高效表达的， 而且p s p 的表达量随发育甥呈动态变化；并且与a m y 的变化方向一致，推测二者存在协同性表 达。随后的n o r t h e r n 杂交和w e s t e r n 杂交证实了，p s p 在m r n a 水平和蛋白水平也是高效表达的。 对猪p s p 的全长氨基酸序列进行了抗原决定簇分析，推测猪p s p 有4 个抗原决定簇，分别位 于p s p 蛋白的2 2 3 7 a a ，4 1 5 9 a a ，t 8 0 - 1 9 5 a a 以及c 一端。经过比较，按其中之一合成短肤，将短 肽与匙孔血蓝蛋白连接，免疫家兔，获得了抗猪p s p 抗血清。从蟹白质水平对其表达情况进行了 研究。在整个研究过程中，将a 一唾液淀粉酶及三磷酸甘油醛脱氢酶的表达情况作为对照。研究 发现p s p 在猪及小鼠中都是腮腺特异性高效表达，表达量在不同发育期呈动态变化，且始终高于 6 a p d h 。并且在6 周龄小鼠腮腺中发现了一个2 0 k d a 的蛋白，能与p s p 抗体发生反应。 在第二部分中，首先利用r l m 一5 r a c e 进行了猪p s p 转录起始位点的定位，结果表明，通过 r l m 一5 r a c e 得到的序列比现有的c d n a 序列的5 端长3 9 个碱基。分析发现，现有的猪p s p 基因 的开放阅读框( 0 p e nr e a d i n gf r a g m e n t ，o r f ) 有误，猪o r f 的真正起点( a t g ) 是在现存5 端上 游2 2 个碱基处( a t g 矗! 酆) 。而猪p s p 基因的转录起始位点，位于该基因新的o r f 起始密码子上 游l g 个碱基处。在随后进行的p s p 核心启动子预测中，分析发现猪p s i ) 基因的启动子属于非典 型启动子，不具有t a t ab o x 等经典元件；但有8 个i i l r 在转录起始点附近，而且其中两个i 刚好覆盖在转录起始位点上，这佐证了5 r a c e 结果，并且与l n r 本身的特点也有很好的符合。 随后用瞬时转染法对功能性启动子进行定位。首先成功地将普通转染载体改造为启动子分析 专用载体。利用一系列嵌套引物对启动子区片段进行了扩增、克隆、亚克隆，成功构建了含有不 同长度5 调控区的细胞转染载体。我们利用人唾液腺癌细胞系( a c c m ) 作为转染平台。我们培养 了猪腮腺原代上皮细胞，将其作为a c c - m 的对照和补充。我们拟用质脂体转染法将外源基因导入 哺乳动物细胞，为此，我们对不同培养基配方进行摸索，确定了最佳的转染条件。 关键词：腮腺分泌蛋白，唾液淀粉酶，转蒙起始点，细胞转染，载体构建，启动子，核心启动子 定位，表达特性，定量分析 a b s t r a c t m a m m a l i a ns a l i v a r yg l a n d sb e l o n gt oe x t e r n a ls e c r e t i o ng l a n d s ，b u tt h e yh a v ep a r tf u n c t i o n o fe n d o c r i n eg l a n d s m o s ts e c r e t i o n sc a nr e a c hm o u t hb yt h es a l i v a r yp e n a lt u b e ，a n dw o r ki n s t o m a c hw h e np h 4 w h j l eaf r a c t i o no f s e c r e t i o n sc a nr e a c hd i r e c t l yi n t ot h eb l o o d s t r e a m t h e r e a r el o t so fs a l i v a r ys e c r e t e dp r o t e i n s ，i nw h i c hap r o t e i nm a yh a v em p h l f u n c t i o na n ds e v e r a l p r o t e i n sa l w a y ss h a r et h es a m ef u n c t i o n s om a m m a l i a ns a l i v a r yg l a n dc a n b eu s e da sb i o r e a c t o r s p a r o t i ds e c r e t o r yp r o t e i n ( p s p ) i se x p r e s s e de s p e c i a l l yi nt h ep a r o t i dg l a n d ，a si ti sa n t i b i o t i c s i nf u n c t i o n ，m a n yp e o p l eh a v ei n t e r e s t e di ni t t ou n d e r s t a n dt h ee x p r e s s i o no fp s pa n dt h e r e l a t i o n s h i pw i t hq - a m y l a s e ( a m y ) ，w er e s e a r c ht h ee x p e r e s s i o no ft h e s et w og e n e si nd i f f e r e n t p o s t n a t a ls t a g e si nm o u s ea n dp i gb yr t - p c ra n dq p c r ( f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s e c h a i nr e a c t ) ，r e s u l ts h o w s ，p s pe x p r e s s e dh i 曲l yi na l m o s tp o s t n a t a ls t a g e si nm o u s ea n dp i g , a n d e x p r e s s i o nl e v e lc h a n g i n gw i t ht h et i m e f u r t h e r m o r e ，t h et r e n do fp s pa n da m yk e e p st h es a m e i na l lt h et i m e ，s 1 1 9 9 e s tt h e ys h a r e sc o r e g p l a t i o n a n dr e s p l t sf r o mn o r t h e r na n dw e s t e r nb l o ts h o w t h es a m ea sq - p e r w ea n a l y s i st h ef g l la m i n oa c i ds e q u e n c eo f p i gp s p , t h e nf o u rp o t e n t i a lp e p t i d e sw e r ef o u n d a sa n t i g e n i cd e t e r m i n a n t s ，t h e i rs e q u e n c ea n dl o c a t i o na tp i gp s pw e r el i s ta sf e l l o w s ：2 2 3 7 a a ，4 1 5 9 a s ，1 8 0 - 1 9 5 a a ，c t e r m i n a l a m o n gt h e m ，p e p t i d e - i ( 2 2 3 7 a a ，) s h o w nt h eb e s t , t h e ni tw a s c h o s e na sa n t i g e nt ot oc o n j u g a t ew i t hk l h ，t od e v e l o pa n t i s e r u mi nr a b b i t ap o l y c l o n a la n t i b o d y s p e c i f i cf o rp i gp s pw a sg e n e r a t e d w er e s e a r c hp s pe x p r e s s i o ni np r o t e i nl e v e l ；r e s g l ts h o w sp s p e x p r e s s i o ni nh i g h e rl e v e lt h a nt h a to fg a p d h ，a n dan e wv a r i a n to fp s pw a sf o u n di nm o u s e w h i c hc a l lr e a c t e dw i t hp s p - a n t i s e r u m i nt h es e c o n dp a r t ，w el o c a t e dt h et r a n s c r i p t i o ns t a r ts i t eb y57 r a c e ，r e s p l ts h o w s ，w eg o t 3 9 b pl o n g e re d n as e q u e n c et h a nt h er e p o r t e do n e ，a n dw ec o r r e c tt h ef i r s tc o d eo fp s po r f t oi t s 一2 2 b pu p s t r e a m ；a n dw el o c a t e dt h et r a n s c r i p t i o ns t a r ts i t eo n - 1 9 b po f t h en e wo r f w ep r e d i c t e d t h ec o r ep r o m o t e rp i p s p ，r a s p i ts h o w s ，p s pp r o m o t e ri su n t y p i c a lo n e ，t a t ab o xw a sn o ti n c l u d e ， a n de i g h ti n r sw e r ef o u n dn e a rt h et r a n s c r i p t i o n s t a r ts i t e ，i tp r o v e dt h er e s i - t l to f5 r a c e ，a n df i t t h ec h a r a c t e ro f i n r w el o c a t e dp s pp r o m o t e rb yi n s t a n tt r a n s f e c t i o n f i r s t l y ，w es u c c e s s m l l yr e b u i l dp l s m i d p e g f p - n 1 ，a n ds e tu p as e r i o u so fc e l lt r a n s f e c t i o nv e c t o r si n c l u d i n gd i f f e r e n t l e n g t ho f 5 r e g i x l a t i o nr e g i o nb yp c r ，c l o n ea n ds u b e l o n e w et a k ea c c mc e l la st r a n s f e c t i o ns u b j e c t , a n d t a k ep r i m a r yp a r o t i de p i t h e l i u mc e l l sa sc o n t r 0 1 a n dif o u n ds u i t a b l et r a n s f e c t i o nc o n d i t i o n ，t h e b e s tr a t i oo f l i p o f e c t a m i n e d n aw a s1 3p m o l ：2 0 1u s i n gs e r u m f r e em e d i u m ，a n dt h eo p t i m a lt i m e t oo b s e r v ew a s2 4h o u r sa f t e rt r a n s f e c t i o n k e yw o r d s ：p s p , a m y t r a n s c r i p t i o ns t a r ts i t e ，t r a n s f e c t i o n ，v e c t o rr e b u i l d ，p r o m o t e r , c u r e p r o m o t e r , a n dl o c a t i o n 1 i 本研究由 “国家基础研究重点发展规划 ( 编号：t g 2 0 0 0 0 1 6 1 0 4 ) 和 “全国优秀博士学位论文作者专项资金资助 项目”( 编号：2 0 0 1 5 1 ) 资助 f u n d e db yn a t i o n a lk e yf o u n d a t i o np r o j e c t ( n o t g 2 0 0 0 0 1 6 1 0 4 ) a n d s u p p o r t e db yt h ef o u n d a t i o nf o r t h ea u t h o ro fn a t i o n a le x c e l l e n td o c t o r a ld i s s e r t a t i o n o fp r c h i n a ( n o 2 0 0 1 5 1 ) g u l b p b s a c d n a d m s o d n a d n t p d t t e b e d l a e s t q - p c r h i l m g m m m l o d o r f p c r p s p a m y s s d s 缩略词语表 m t c r o g r a m m i c r o l i t r e b a s ep a i r b o v e n es e l m ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd n a d i m e t h y l s m f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d i t h i o t h r e i t 0 1 e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i n i t r i l o t e t r a c e t i ca c i d e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t e r h o u r i n i t i a t o re l e m e n t s l i t r e m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t e r o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a g m e n t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p a r o t i ds e c r e t o r yp r o t e i n a - a m y l a s e s e c o n d s o d i u md o d e c y ls i _ t l f a t e v 独创- i 生声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名叼z 绎时间：埘年月玎日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 崤玛聋 时间： 埘年月叫开 聊馘： 帆绷堋 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 第一节腮腺分泌蛋白的相关研究 1 唾液腺的组织结构 哺乳动物唾液腺是由腮腺、颌下腺和舌f 腺三对大腺体以及多个小腺体组成。唾液腺的 表面包有一层疏松结缔组织的被膜，被膜结缔组织伸入腺体内部，把腺体分隔成许多小叶， 每个腺小叶都含有大量腺泡。腺体的实质包括腺泡和导管两部分，腺泡位于最小导管的末端， 由一群具有分泌功能的腺细胞组成；导管起自最小的末端分支，然后汇合成较粗的导管，分 泌物经导管导入口腔。根据腺泡的形状、结构和分泌物性质的不同，可将腺体分为浆液腺、 黏液腺和混合腺三类。例如人的腮腺分泌低粘稠度的富含蛋白的液体，因此被称为浆液腺： 人的下颌下腺和舌下腺分泌高粘稠度的富含糖类的液体，又被称为黏液腺；家畜的腮腺为浆 液腺，颌下腺和舌下腺为混合腺。 唾液腺组织的细胞类型主要为浆细胞、粘细胞、肌上皮细胞。浆细胞产生富含蛋白的水 样分泌物，通常形成球形腺泡。枯细胞产生富含枯多糖的分泌物，通常形成管状腺泡。肌上 皮细胞是一类可收缩的细胞，在导管中，能驱动分泌产物进入口腔。成熟的腮腺主要由浆细 胞和小叶导管细胞构成，浆细胞占腮腺细胞总数的7 5 8 0 ，是分泌蛋白的合成场所( k l e i n r 1 9 8 2 ，r e d m a nr e ta 1 ，1 9 7 0 ) 。腮腺分泌物占唾液总量的2 5 含有a - 淀粉酶和腮腺分泌 蛋白、麦芽糖酶、唾液粘蛋白和具有抗葫活力的免疫球蛋白。颌下腺由浆细胞和粘细胞构成， 主要为浆细胞，其分泌物占唾液总量的7 0 ，含有唾液粘蛋白和较弱的a ，淀粉酶活力。舌 下腺由粘细胞和浆细胞，主要为粘细胞，其分泌物占唾液腺总量的5 。唾液腺分泌的蛋白 具有重要的功能。 2 唾液的成分及功能 唾液是整个唾液腺的终产物，是由末端分化的腺泡细胞和导管细胞等不连续组件分泌的 ( t a n d l e r b 1 9 8 5 ) 。由于有细胞碎屑及沉淀的黏液素，全唾液往往很粘稠且为非均质。唾液包 含水、糖蛋白、溶菌酶、过氧化物酶、乳铁蛋白、碳酸氢盐和磷酸盐构成的缓冲系统及免疫 球蛋白等多种蛋白成分取白口腔的全唾液不仅包含唾液腺的混合分泌物，亦包括脱落的上皮 细胞、软组织的微生物及来自龈裂内的液体等。猪的唾液分泌量为每天1 5 升，唾液骚白总含 量为4 m g m l ，含有多种消化酶及抗菌成分。正常人每日全唾液的分泌量约为卜1 5 升，p h 值在5 0 - 7 0 之间，唾液中蛋自质浓度为0 0 2 5 一l g 1 0 0 m l ，较血浆中低1 0 0 倍左右。唾液中 含有多种免疫球蛋白，主要为由唾液腺局部的浆细胞产生的分泌型i g a ( s i g a ) ，由血清经龈 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 沟渗入口腔的i g g 、t g a 和少量i g m 与i g e 。每1 0 0 r a l 唾液中i g a 、i g g 与i g m 的含量分别为 1 9 1 4 m g 、1 4 m g 、0 2 m g ，大约为血清浓度的1 l o ，1 8 0 0 ，1 4 0 0 。唾液中免疫球蛋白的含 量远低于血清，但p a r r p 用放射免疫分析( r i a ) 与酶联免疫吸附实验( e l i s a ) 等方法检测 免疫缺陷病毒、甲型肝炎与风疹病毒感染者唾液中的抗体后认为，唾液中的抗体水平己足够 用于一些免疫学诊断。除此之外，唾液还具有多种重要的功能：湿润食物、润滑消化道及参 与消化、维持d h 值的平衡、清洁口腔及抵抗细菌侵入口腔( m a n d e l i d 1 9 8 9 ，f o x p c e ta 1 ，1 9 8 7 ， n a g y g e ta 1 2 0 0 3 ) 。正是由于唾液中富含各种具有重要功能的蛋白，使得对唾液腺的研究越 来越受到重视。 3 在唾液腺开展的相关研究 3 1 癌症研究 发生在唾液腺的癌症包括腺癌、囊腺癌、淋巴上皮癌等，这些癌症的表型和生物学特性 各异，它们发生的分子机制和临床病理上的一些问题尚未阐明。为了揭示上述问题，人们对 于唾液腺癌症的发病机制及早期诊断技术进行了研究。m a r u y as 等( m a r u y as ，k i mh w ，w e b r r s ，e ta 1 ，2 0 0 4 ) 在唾液腺癌的研究方面迈出了重要的一步。这个研究小组用芯片对1 8 种 常见的唾液腺良性及恶性肿瘤的蛋白表达谱进行了分析。在5 0 0 0 个分析的基因中，有1 3 6 个基因在正常唾液腺组织，良性肿瘤及恶性肿瘤之间存在表达差异。大多数差异表达基因的 功能与附着、分化、及信号转到通路内成员的功能相似。这个研究小组找到了一系列可以区 分正常唾液腺与肿瘤组织的基因，以及用于区分腺样囊性癌与其它恶性肿瘤的基因，发现了 原发于大唾液腺和小唾液腺的腺样囊性癌基因表达模式的差异，为唾液腺癌的研究提供了新 的信息。 随后的研究在更深的层次开展起来，2 0 0 5 年s t e n m a ng 对唾液癌中出现的融合癌基因及 其蛋白产物进行了研究，结果表明，唾液腺癌的特征是染色体高频率的周期性异位，染色体 异位导致病原相关性融合癌基因的表达。这些癌基因编码新的融合蛋白，或者使正常蛋白或 被截短的蛋白实现异位表达，这种现象在良性或恶性肿瘤中都存在。染色体异位的靶点主要 是d n a 附着转录因子( 如p l a g l h 黼a 2 ) ，包括生长因子信号、细胞周期调控信号，以及n o t c h ， c a m p 信号转导通路的相关因子。鉴定这些融合蛋白有助于我暂j 认识导致上皮癌，尤其是唾液 腺癌发生的分子机制。进一步研究发现，在唾液癌中的融合蛋白似乎不是肿瘤类型特异性的， 它们的致癌作用可能是通过激活基础的转化途径来实现的。这种作用途径在多数细胞类型中 都存在，这可能对于研究其它类型癌症的发病机制也有参考价值。这些融合蛋白的下游基因 产物将为制定新的治疗策略提供了重要靶点。 在唾液腺癌的早期诊断方面，人们也进行了有意的探索。研究发现，唾液腺淋巴上皮癌 ( s a l i v a r y g l a n d l y r e p h o e p i t h e l i a lc a r c i n o m a s ，s l e c ) 的发生可能与e b v ( e p s t e i n b a n v i r u s ) 病毒的感染有关。为了研究e b v 在s l e c 发生过程中的作用，l e n k y 等( j e n ky h i g u c h i m ， l ij ，e ta 1 ，2 0 0 5 ) 从s l e c 患者的唾液腺组织中分离到了e b v 病毒晚期膜蛋白1 基因( l m p 1 ) ， 2 中雷农业大学博士学位论文 第一章文献综述 通过与标准e b v 毒株的比较，发现l m p l 基因发生了缺失突变，包括一段l o 个氨基酸的 缺失，一段5 个氢基酸的缺失，另有1 2 处单个氨基酸突变。l m p - 1 的蛋白产物能抑制胚胎 肾细胞系( t 2 9 3 ) 的生长，这与标准毒株的作用一致，说明发生的缺失突变不影响病毒的重要 特性，l m p 1 的发现为临床上鉴定e b v 致病株，实现对s l e c 的早期诊断提供了依据。 3 2 唾液腺介导的基因治疗 哺乳动物唾液腺是位于头部的外分泌腺，唾液腺( 腮腺、颌下腺) 的解剖特点使其成为 基因治疗极好的靶位：通过导管系统在口腔的开口，可直接无创逆行注射各种转基因结构 至唾液腺；腺体的腺泡和导管细胞均呈单层排列，大大增加了与基因转移载体直接接触的 机会，提高转基因的表达效率；人类唾液腺都有完整的包膜，能限制载体扩散，防止对其 它组织产生副作用；唾液腺具有分泌作用，能产生大量蛋白质，方便外源基因的表达和运 输。目前主要的研究热点是用重组腺病毒载体对唾液腺进行转染，用于唾液腺的保护和疾病 的治疗。 对唾液腺的保护主要是对放射性损伤和自身免疫损伤的治疗。据报道，美国每年新增4 万名头颈部癌患者，大部分都需要进行放疗。唾液腺腺泡细胞对电离辐射非常敏感，头颈部 恶性肿瘤放射治疗时，主要是破坏腺泡细胞，导致唾液分泌功能异常。d e l p o r t e 等对经放射 处理的大鼠唾液腺( 主要是导管细胞) 转移水通道蛋白1 ( a q p l ) 编码基因，可以增加这些 导管细胞的透水性，使其具有分泌功能。转移后，实验组唾液流量增加2 3 倍，接近正常水 平，而未经基因治疗的放射大鼠对照组，其唾液流量仅为正常水平的3 5 ( d e l p o r t ec ，e ta 1 1 9 9 7 ) 。 修复自身免疫损伤主要是对舍格林综合征( s j o g r e ns y n d r o m e ) 的治疗。合格林综合征是 一种常见的自身免疫疾病，主要病理特征是细胞因子i l 2 、i n f 吖、t n f 一诱导的炎症反应， 以及细胞毒性t 细胞的杀细胞作用导致的唾液腺组织破坏、唾液分泌异常。t h 2 细胞产生的 细胞因子可以减轻炎症反应，因此应用基因治疗增强t h 2 的功能，有助于恢复唾液腺的免疫 平衡，从而使腺体内的病理破坏停止，促进组织修复反应( y a m a n os ，e ta 1 1 9 9 9 ) 。 唾液腺虽然是外分泌腺，但它依然可以作为治疗循环系统蛋白缺乏性疾病的靶器官。为 了证实这个假设，有人进行了探索。1 9 9 6 年k a g a m ih 等构建了含人h c t l a t 基因的重组腺 病毒载体，逆行注入大鼠颌下腺，e l i s a 检测发现转染后2 4 4 8 h ，腺体内h c t l a t 蛋白含量 为2 7 4 n g m l ，唾液内含量为3 1 3 n g m l ，血液中的含量为5 n g m l ，证明外源蛋白可以通过唾 液腺的内分泌作用进入提循环。1 9 9 8 年h ex 等进行了更为深入的研究。h ex 等用含人生 长激素( h g h ) 的重组腺病毒载体转染大鼠颌下腺，转染后4 8 h ，大鼠血清中h g h 水平达 到1 6 n g m l ，类胰岛素生长因子增加2 5 n 。转基因大鼠血清成分分析显示，血中代谢产物尿 蛋白氮、肌氨酸酐、甘油三酸酯水平升高，这些都是h o h 合成代谢的产物。上述研究表明， 唾液腺作为转基因治疗的靶器官是可行的。 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 3 3 免疫方面 利用质粒d n a 进行免疫在小鼠已经被证实是非常成功的。然而，发展d n a 疫苗还面临 一些挑战，比如在大型动物上获得的效果较差，大动物的粘膜免疫相对较弱。上述问题可以 通过唾液腺免疫来解决，将d n a 疫苗的水溶液通过唾液腺导管直接注入动物体内，可以实 现免疫。这种改进的d n a 疫苗韵免疫效果已经在多种动物模型上得到证实。t u c k e r s n 等的 实验证实用上述方法免疫，在狗和大鼠上可获得抗原特异性滴度高于1 0 0 0 0 的抗体。并且可 以提高粘膜免疫反应的强度。 目前唾液腺相关免疫研究已经逐步向应用方向发展，在医疗和动物生产都有新进展。龋 齿病和牙周病是较难预防的常见病，k a w a b a t a 等把含有牙龈朴啉单胞菌编码基因的质粒注入 鼠的唾液腺，该基因使鼠唾液腺组织内产生纤毛蛋白，并分泌特异性唾液抗体i g a 和血清抗 体l g g ( k a w a b a t as ，t e r a oy ，f u i i w a r at ，e la 1 i n f e ei m m u n ，1 9 9 9 6 7 ( 1 1 ) ：5 8 6 3 - 5 8 6 8 ) 。 理论上 可以保护宿主抵御牙龈朴啉单胞菌的定植，防止牙病的发生。在动物生产中主要用于控制寄 生虫及虫媒疾病的传播。当前用于控制硬蜱的方法有多个方面的局限性。最近研究发现，针 对硬蜱的免疫接种可能是一种行之有效的治蜱良方。在蜱唾液腺中，许多基因是在蜱吸血过 程中被诱导表达的，大量新台成的蛋白被释放到唾液中，这些蛋白可能在调节宿主免疫反应 及宿主抗原呈递方面有一定作用，肩胛唾液腺蛋白是硬蜱特有的一种蛋白，该蛋白在硬蜱吸 血过程中特异性表达，为了鉴定该蛋白x u y 等( x u y ，e ta 1 ，2 0 0 5 ) 采用了抑制性消减杂交 对硬蜱进行了研究。结果发现了1 0 个唾液腺相关的蛋白，它们在硬蜱吸血时表达量都上调， 这些蛋白是未来制造抗蜱疫苗用于防治蜱及蜱媒疾病传播的候选靶点。 3 4 唾液生物反应器的研究 唾液腺生物反应器是最近才发展起来的新型生物反应器( g o l o v a ns re ta 1 2 0 0 1 ) 。其特 点是利用唾液分泌蛋白的调控区在唾液腺中特异性表达各种酶类和外源蛋白。常用的唾液蛋 白为腮腺分泌蛋白p s p ( m a d s e nh o e la 1 ，1 9 8 5 ) 、n 一唾液淀粉酶一a m y ( h a g e n b u c h l eo e l a 1 ，1 9 8 0 ) 1 富含脯氨酸的蛋白p r o r i c h ( a n n d k e l a l ，1 9 8 7 ) 。与其它生物反应器比较，唾液 腺生物反应器具有独特的优势：唾液腺分泌物易于通过导管进入到口腔：唾液腺能合成和分 泌大量蛋白；唾液腺分泌物能源源不断进入到体内；唾液的分泌不受性别和发育时期和年龄 的限制；而且大家畜的唾液分泌量大，容易收集纯化。正是唾液腺的这些突出的特色，使得 唾液腺生物反应器越来越呈现出勃勃生机，被寄于厚望。 利用唾液腺表达一些饲料中需添加的酶类，如植酸酶、葡糖苷酶、木聚糖酶等，来改善 家畜和家禽的生产性状，对整个畜牧产业是非常重要的。尤其在猪、鸡、鸭等单胃动物，由 于其体内缺乏内源性植酸酶，饲料中的植酸磷不能被有效分解、吸收，而随粪便排放出，造 成了严重的农业磷污染，因此植酸酶的添加非常迫切。2 0 0 1 年g o l o v a ns p 等建立了可以在 唾液腺中分泌植酸酶的转基冈小鼠模型。该研究中所采用的表达系统为大鼠富脯氨酸蛋白 ( i n d u c i b l ep r o l i n e - r i c hp r o t e i n ，p r p ) 启动子和小鼠腮腺分泌蛋白( c o n s t i t u t i v ep a r o t i ds e c r e t o r y 4 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 p r o t e i n 。p s p ) 启动子调控大肠杆菌植酸酶a p p a 基因在唾液腺中表达( g o l o v a ns p e l a 1 ，2 0 0 1 ) 。分析表明，转基因小鼠唾液腺分泌的植酸酶可致小鼠粪便中磷水平显著降低。该 实验室用同样的系统获得了植酸酶转基因猪。在以豆粉为唯一的磷源时，检测饲料中磷的消 化率，发现转基因猪几乎达到了1 0 0 ，而非转基因猪只有5 0 ，而且转基因猪产生的植酸 酶可以分解利用植物性饲料中的植酸盐，因此饲料中不需要再添加无机磷( s p e n c e rj d e t a l ， 2 0 0 0 ) 。对粪便的检测中，与非转基因猪相比，植酸酶转基因猪的粪磷含量在断奶仔猪和育成 猪分别降低了5 6 和7 5 ( 如表1 3 所示) 。有望缓解环境中磷污染( g o l o v a ns p e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 这两个表达系统，充分证明利用唾液腺作为生物反应器来生产在消化道中起作用的蛋白 质和酶类是一种非常有效的方法。p s p 基因在生物反应器中的应用除表达动物所需的各种酶 类外，还可以用来表达人类需要的重要生物活性蛋白或药物，其应用前景是非常广阔和诱人 的。 3 5 生物制药及疾病防治 唾液腺是吸血昆虫( 体表寄生虫) 的重要器官，吸血昆虫的唾液中含有许多与吸血相关的 功能因子，它们与宿主动物凝血过程中的重要成分相互作用，同时还是传播病原的载体，许 多研究表明唾液能提高或增强病原微生物对宿主的感染传播( t i t u sa n dr i b e i r o ，1 9 8 8 ；o s o r i oe t a 1 ，1 9 9 6 ；e d w a r d se ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在研究过程中，人们认识到昆虫唾液分泌成分在治疗人类心血 管疾病中的作用，以及唾液腺免疫抗原在畜牧业中的作用，因此对昆虫唾液的生理生化特性 进行研究将带来生物制药和疾病防治的双丰收。 埃及伊蚊是我国登革热的重要传播种群，埃及伊蚊的唾液中有三种与吸血相关的因子， 其中最为重要的一种是唾液腺激肽s i a l o k i n i n1 ( b e e m t s e n ，1 9 9 9 ) 。唾液腺激肽是唾液中一种 具有强大舒血管作用的短肽，与速激肽类神经激肽有很高的同源性，与哺乳动物免疫功能因 子p 物质的抗体有交叉作用( r i b e i r o ，1 9 9 2 ：c h a m p a g n ea n dr i b e i r o ，1 9 9 4 ) 。速激肽类物 质除了具有舒血管活性，还能调节免疫细胞的功能，如引起肥大细胞的释放，抑制巨噬细胞 的吞噬功能，在疾病媒介传播过程中有重要意义。目前有人用合成的埃及伊蚊唾液腺激肽对 b a l b e 小鼠进行研究，结果表明唾液腺激肽对登革热病毒感染b l b c 小鼠具有一定增强作用， 病毒血症时间延长，抗体滴度降低，该作用与埃及伊蚊唾液的增强作用相似。研究埃及伊蚊 唾液腺激肽的生物活性和对宿主的免疫调节作用，有助于控制登革热病毒的传播。在蜱类， 人们对其唾液腺分泌物进行了研究，发现蜱类的唾液腺分泌多种药理学活性物质，包括抗凝 血剂、前列腺素e 和前列腺素、血管舒张肽、抗炎因子、抗组胺物质等等。在一些种类， 唾液腺也分泌免疫抑制抗原，使这些寄生虫免于宿主的排斥反应。现已在美洲花蜱分离除一 种凝血酶抑制剂( z h ue l a l ，1 9 9 7 ) ，在变异革蜱分离出血小板凝集抑制剂( w a n g e la 1 1 9 9 6 ) ， 在长角血蜱分离出胶原特异性血小板聚集抑制因子( 程远国等，1 9 9 9 ) 。蜱类唾液腺的研究 对于解释唾液腺的结构与功能功能与适应及开展有效的防治均有重要意义。 相比z 下，对于吸血昆虫r h o d n u sp r o l i x u s 的研究更为深入，r h o d n u sp r o l i x u s 是锥虫病 病原体的传播者，主要分布于南美、中美和拉丁美洲，这种昆虫不论是幼虫、成虫、雌虫、 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 雄虫都要靠吸食人或其它动物的血液而生存。镇西康雄等对此昆虫的唾液腺进行了详细研 究，发现了唾液中分子量为1 9 9 2 k d a 的奇特的血红素蛋白( p r o l i x i n s ) 具有抗凝血活性， 并阐明了p r o l i x i n s 在昆虫吸血过程中的作用机制。昆虫吸血前唾液腺细胞分泌p r o l i x i n s ， 在细胞内结合血红素，同时携带一氧化氮( n o ) 并储存在唾液腺腺腔中。由于昆虫体温和 p h 值较低，p r o l i x i n s 和n o 以结合状态存在。在吸血时，上述结合物被注入动物体内，宿 主动物体温和p h 较高，n o 游离出来，使附近毛细血管的平滑肌舒张，血管扩张，这样昆 虫就能比较容易地找到血管，然后把吻插入其中并不断分泌唾液，p r o l i x i n s 具有抗凝活 - 胜，从而使昆虫不断吸食到血液。n o 除具有舒张血管平滑肌的作用外，还具有阻止血小扳 聚集地作用，血小板聚集是血液凝固和血栓形成地重要阶段，因此，n o 也具有组织血液凝 固的作用。p r o l i x i n s 作为抗凝血因子的同时还具有运输n o 的机能，可以说是一种非常独 特的蛋白质，就目前的研究状况来看，将p r o | i x i n s 开发成有效且副作用小的抗血栓药物是 很有希望的。 4 腮腺分泌蛋白的研究进展 唾液中蛋白种类繁多，有些功能已知，像组氨酸蛋白酶抑制剂家族、糖苷酶、淀粉酶、 蛋白酶、激肽释放酶等；另外一些唾液蛋白仅知c d n a 序列，其结构和功能还有待研究， 包括腮腺分泌蛋白为代表的p s p 蛋白家族、肾素和激肽释放酶。由于腮腺分泌的高丰度蛋白 在基因治疗等方面可能有较好的发展前景引起了人们的研究兴趣。 4 1 各物种p s p 基因的发现 腮腺分泌蛋白作为唾液中表达量非常高、组织特异性表达的一种糖蛋白，其氮基酸结构 的显著特点是富含亮氢酸，对其功能的研究还不很充分。1 9 8 0 年o w e r b a c hd 在研究小鼠唾 液淀粉酶的时候，在腮腺中发现了一种分子量约为2 0 k d a 的蛋白，并将其命名为腮腺分泌蛋 白( p a r o t i ds e c r o t e r yp r o t e i n ) 。1 9 8 5 年，m a d s e nh o 等通过蛋白的氨基酸测序获得小鼠p s p 基因的c d n a 序列。接下来，s h a wp ( 1 9 8 6 年) 等在小鼠基因组中获得了p s p 的整个结构 基因，包括9 个外显予和s 个内含予，对p s p 基因的调控区进行了初步的分析，确定了该基 因的基本调控区和调控元件，并对其组织表达分布进行了研究，证实了p s p 基因的组织特异 性表达，在腮腺中高表达。其m r n a 在每个腺泡细胞中的聚集量可达到5 1 0 4 个分子，在舌 下腺和颁下腺有少量表达，在其他组织不表达( s h a wpe ta 1 ，1 9 8 6 ：l a u r s e nj e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。用 转基因小鼠进行的p s p 基因表达研究，已经分别确定了在转录起始点上游4 6 k b 的舌下腺特 异性增强子平口- 3 6 k b 的腮腺特异性增强子。p s p 在组织特异性增强子指导下，在舌下腺的表 达量与内源基因一致，但是在腮腺的表达量只有内源基因的l 。研究表明，要在转基因小 鼠腮腺获得p s p 的高效表达，需要2 5 k b 的基因组片断，包括11 4 k b 的上游区和2 5 k b 的下 游区( l a u r e ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。后续研究表明，鼠科动物的p s p 上游8 0 到6 5 处存在另一个指 导腮腺高表达的调控区( l a u r e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。p s p 在腮腺高水平的特异性表达就依赖该； 6 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 _ _ _ 一i i i m l i i i _ _ 一 由于该区能在转基因小鼠中激活异源的s v 4 0 启动予，证明该区是一个增强子序列( l a u r e nj e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。而且腮腺分泌蛋白基因增强子序列附近的蛋白质结合元件( p r o t e i n b i n d i n g d e m e n t s ) 是p s p 蛋白进行组织特异性表达所必需的( s v e n d s e ne ta l ，2 0 0 1 ) 。 g u p t a n 等对大鼠p s p 基因的确定是通过与小鼠p s p 基因的比较发现的，大鼠的p s p 基 因具有与小鼠p s p 同样的氨基酸特点，而且二者在c d n a 和氨基酸序列上非常一致基因结 构极其相近，都含有9 个外显子和8 个内含子，在染色体上都是以单拷贝形式存在。序列比 较表明：小鼠和大鼠