转座子插入引起的基因突变.docx

转座子插入引起的基因突变一、原理转座子（Tn）是能在不同复制子之间转移位置的核苷酸顺序。它一般来自抗药性质粒，由一个或几个抗药性基因加上两端两个顺序相同（但是方向不一定相同）的核苷酸片段（称为插入顺序IS）构成。当一个转座子转移位置而插入某一基因时，能使这一基因失活，即发生突变。各个转座子的抗药性基因、转移频率、插入位置、插入顺序都可以不同。有些转座子对于染色体的各个位置插入没有偏向，而另一些则偏向于插入某些特定的位置。转座子的插入突变有两上表型效应，即基因突变的表型效应和由转座子带来的抗药性。因此利用转座子可以有效地取得任何一种突变型。一个很有效的方法是通过转座子诱发F因子上的染色体基因的插入突变。大肠杆菌22菌株的染色体上携带有Tn5转座子（含kan抗性基因）。要使Tn5插入到F Lac+Pro+/Strs的乳糖发酵基因中去以引起Lac+突变，可先将这一F因子转移到(Lac Pro)Strr受体细胞中去，再观察是否发生了插入突变。在能排除供体的含链霉素的培养基上选择Pro+受体菌落，若是抗卡那霉素的，那就是说受体细菌不但接受了F因子，而且这一F因子带有Tn5，如果它又由Lac+变为Lac-,不能在以乳糖为唯一碳源的培养基上生长，那么，这一插入位置就是在乳糖发酵基因中。为进一步提高效率，还可以采取一种措施，使在特定条件下Lac+细菌不能生存而Lac-细菌能够生存。已经知道galE突变型在有乳糖和半乳糖存在的情况下，由于细胞中积累有毒的半乳糖代谢中间产物UDPgal和gal-1-P而死亡，所以如果采用galE突变型作为受体细菌，在含有0.02%乳糖和0.2%甘油的基本基上，受体细菌如果接受了一个FLac+Pro+，就不能生存。如果lac+基因由于插入了Tn5而成为lac+,那么受体细菌便能生存下来。二、材料、试剂、器具1、受体菌：F-/(lac proB) gaE strr2、供体菌：Flac+pro+/(lac pro)nalr带Tn5于染色体某处。3、LB完全培养液，每组4支，每支5ml。4、无菌生理盐水，每组6支，每支4.5ml。5、L选择培养基：含链霉素、卡那霉素、乳糖和甘油的基本培养基，每组6皿。6、G选择培养基：含链霉素和葡萄糖的基本培养基，每组5皿。三、步骤1、第一天傍晚，分别接一环供体菌和一环受体菌于两支5ml LB培养液中，37摇床上培养过夜。2、第二天，取两个内含4mlLB培养液的250ml三角瓶，分别加入1ml过夜培养的供体菌及受体菌，在37摇床上培养2-3小时。3、将新鲜培养的供体菌及受体菌各取1ml，在一无菌的250ml三角瓶中混合，37轻摇60分钟。4、吸取0.5ml混合菌液，用生理盐水稀释10-6倍。5、从10-1倍稀释液中吸取0.1ml涂于L选择培养基平板上，将供体菌及受体菌分别吸取0.1ml涂于L培养基上作为对照。再从10-2、10-3、10-6倍稀释液中各吸0.1ml分别涂于G培养基平板上。37培育二天。6、观察、统计并计算：1）接受了供体F(Lac+Pro+)的受体菌的数目：G板上生长的菌落数(个/ml)。2)在L板上生长的菌落数（个/m