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酶分子的改造方法及研究进展裴蓓10生物技术及应用班摘要：酶工程的研究已经发展到分子水平，在体外通过基因工程、化学、物理等手段改造酶分子结构与功能，大幅提高了酶分子的进化效率和催化效率，生产有价值的非天然酶。本文对常见的酶分子的改造方法做了一个简单的介绍化学修饰法、生物酶工程法、定点突变法，最后结合当今的形式对酶改造的发展前景做了描述。关键词：酶分子 改造方法 前景正文：1 酶分子改造的目标1.1 提高酶的稳定性1.2 提高酶的活性1.3 增强酶的选择性1.4 改变酶的表面特性2 改造酶分子的方法近年来，特别是随着蛋白质工程的(protein engineering)应用，即把分子生物学、结构生物学、计算生物化学结合起来，根据蛋白质结构与功能关系的知识，经过计算机辅助的分子设计，按照人类的需要，产生性能优良的酶分子。就目前情况来看，现在常用的酶分子修饰方法有：2.1 化学修饰法在应用过程中，有时会因酶的稳定性差、活力不够理想及具有抗原性等缺点而使其应用受到一定的限制，为此常需对酶进行适当再修饰加工，以改善酶的性能。酶的修饰可分为化学修饰和选择性遗传修饰两类。酶分子的化学修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造,造的目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状扩大酶的应用以达到较高的经济效益。酶分子的化学修饰常见的方法有：部分水解酶蛋白的非活性主链，利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰，酶辅因子的置换等。2.2 生物酶工程法 酶的化学修饰法并非改造酶的惟一手段。随着人们对酶的深入研究以及氨基酸一级结构的测定、基因重组技术的应用等，可以彻底地改造、合成并且模拟酶。这也就是生物酶工程的主要内容。生物酶工程主要包括基因工程技术生产酶和蛋白质工程技术改造酶两方面内容。 对自然酶的化学结构进行修饰以改善酶的性能的方法很多。例如，a一淀粉酶一般有 Ca2+，Mg等金属离子，属于杂离子型，若通过离子置换法将其他离子都换成Ca2= ，则酶的活性提高3倍，稳定性也大大增加；胰凝乳蛋白酶与水溶性大分子化合物右旋糖酐结合，酶的空间结构发生某些细微改变，使其催化活力提高4倍；还有对抗白血病药物 天冬酰胺酶的游离氨基进行修饰后，该酶在血浆中的稳定性也得到很大的提高。酶进行化学修饰时，应注意：(1)修饰剂的要求 (2)酶性质的了解 (3)反应条件的选择大多数酶经过修饰后性质会发生一些变化，如酶的热稳定性、抗各类失活因子能力、抗原性、半衰期、最适PH值等酶学性质，酶修饰中存在的问题是，随着酶与修饰剂结合率提高，酶活回收率将下降。克服的方法是采取一些保护措施，如添加酶的竞争性抑制剂，保护酶活性部位以及改进现有的修饰工艺，进一步完善酶的化学修法。制备修饰酶的目标:提高酶活力;改进酶的稳定性允许酶在一个变化的环境中起作用最适PH值或温度,改变酶的特异性使它能催化不同底物的转化改变催化反应类型,提高催化过程的反应效率。2.2.1 基因工程技术改造和生产酶 基因工程改造酶分子主要包括三方面内容：用基因工程技术大量生产酶。修饰酶基因，产生遗传修饰。设计出新酶基因，合成自然界从未有过的酶。 自从 20 世纪 70 年代重组DNA技术的建立，使人们在很大程度上摆脱了对天然酶的依赖，特别是当从天然材料获得酶蛋白极其困难时，重组DNA技术更显示出其独特的优越性。近十年来，基因工程的发展使得人们可以较容易地克隆各种各样天然的酶基因，使其在微生物中高效表达，并通过发酵进行大量生产。目前已有100多种酶基因克隆成功，包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。 克隆是酶基因工程的关键的一步，是把编码目的酶的基因插入适当的载体然后带人与载体相容的宿主，并随宿主复制。当酶基因插人载体后，在宿主中有两种表达方式，一种是利用自生携带的起始密码子，启动合成与天然酶完全相同的酶；另一种是利用载体所具有的密码子，合成相应的融合蛋白，融合蛋白经化学或酶活水解后形成大然酶。纤维蛋白溶酶原激活剂和凝乳酶是应用基因工程获得大量酶的最成功例了人纤维蛋白溶酶原激活剂是一类丝氨酸蛋白酶，能使纤维蛋白溶酶原水解产生有活性的纤维蛋白溶酶，溶解血块中的纤维蛋白，在临床上用于治疗血栓性疾病，促进体内血栓溶解。利用工程菌株生产的纤维蛋白溶酶原激活剂在疗效上与人体合成的酶完全一效，目前已用于临床试验。凝乳蛋白酶是生产乳酪的必需用酶，其来源有限。从微生物中提取的凝乳蛋白酶常会引起乳酪苦味。因此，人们克隆了小牛凝乳酶基因在酵母系统中表达，得到的凝乳酶与从小牛胃中提取的天然酶性质完全一致。 2.2.2 蛋白质工程改造和生产酶2.2.2.1 合理设计合理设计是蛋白质工程最早使用的技术，而且现在也在广泛的使用。要达到此目的要做好三个方面的工作。第一要用结晶学技术来获得蛋白质结晶体，然后利用x一射线技术对晶体进行测量、分析，确定蛋白质的三维结构。第二借助计算机对蛋白质进行选择修饰，从氨基酸的化学结构预见空间结构，或通过人工智能等其它方法来确定蛋白质和功能的关系，找到要修饰的位点。第三，通过对基因序列的了解，运用定点突变技术来进行碱基替换。通过此法来改变蛋白质的功能，但要想获得理想的蛋白质工程产物往往要经过多次分析，替换才能达到目的2。2.2.2.2 定向进化定向进化是蛋白质工程的新策略，它是在不需要事先了解蛋白质的空间结构的情况下通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法。因此它能解决合理设计所不能解决的问题，在生产中的应用越来越受到重视。定向进化是在待进化蛋白质基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA多聚酶不具有3-5校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中引人突变，构建突变库，凭借定向选择方法，选出所需性质的蛋白质。定向进化实际就是随机突变加上选择，它与自然进化不同，整个过程都是在人为控制下进行的，并且还可以模拟真核细胞中DNA 随机拼接这一蛋白质进化过程来加速蛋白质的优化3，4。 酶的蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，而且仍需要应用基因工程的全套技术。所不同的是，酶的基因工程主要解决的是酶大量生产的问题，而蛋白质工程则致力于天然蛋白质的改造，制备各种定做的蛋白质，但也要用到基因工程的技术手段。2.3 酶分子的定向改造和进化酶分子设计可以采用定点突变(sited directedmuta genesis)和体外分子定向进化(in vitromolecular directed evolution)两种方式对天然酶分子进行改造5。2.3.1 定点突变定点突变需要知道酶蛋白的一级结构及编码序列，并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点。定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段6。该方法与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比，具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。图1为overlap extension PCR介导定点突变的基本过程1，其中C和D是相互匹配、并含有特定突变点的一对引物。利用定点突变技术对天然酶蛋白的催化性质、底物特异性和热稳定性等进行改造已有很多成功的实例，酶性质随着经定点突变而改变，正是由于突变的定向性、取代残基的可选择性、对高级结构的无(少)干扰性、检验手段的可靠性，与其他技术相比，定点突变技术显得准确而有效7。然而，定点突变技术只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构基本维持不变，因而对酶功能的改造较为有限。2.3.2 体外分子定向进化体外定向进化是近几年新兴起来的一种蛋白质改造新策略，它可以在尚不知道蛋白质的空间结构，或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现。具体的在上面已经详述过。3 酶分子改造展望相对于其它各种功能蛋白质，酶的结构与功能研究还处于幼年期，如何能够对酶蛋白实施分子改造，使它们的性能得到改善，是具有挑战性的课题。近年来，特别是抗体酶的发展为酶分子设计提供了一个全新的思路。它打破了化学酶工程和生物酶工程的界限，结合了免疫学、细胞生物学、分子生物学、化学等技术，制备出具有高度底物专一性及特殊催化活力的新型催化抗体。人们预测，随着新生物工程技术和噬菌体抗体库技术的发展，将有更先进的重组技术用来直接从抗体库中筛选催化抗体。参考文献:1朱俊晨.王小菁. 酶的分子设计、改造与工程应用. 中 国 生 物 工 程杂 志，2004，24（8）：32-372 吴华昌.邓 静.吴晓莉.韩 莎. 蛋白质工程在改造工业用酶中的应用. 四川轻化工学院学报，2004，17（2）：81-843 甘景镐. 从蛋白质工程学谈漆酶改造的途径. 福建师范大学高分子研究所论文，1988：28-294 唐良华.夏黎明.苏敏.微生物脂肪酶分子改造研究进展.生物技术，2003，13（3）：42-445 1Zhangxe