（微生物学专业论文）一株产尿酸氧化酶菌株的分离及酶特性研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 尿酸是人体内瞟呤代谢的最终产物 般由肾脏排出 在临床检测中 血清 尿酸浓度是判断肾功能的一项重要指标 目前尿酸的测定一般采用酶促比色法 尿酸氧化酶 u r a t eo x i d a s e e c1 7 3 3 为临床尿酸检测用酶 其性能的好坏直 接影响到酶法测定在临床运用中的推广 迄今为止 对该酶的研究虽有许多报道 但多数报道的酶的热稳定性较差 本研究从土壤中分离筛选到一株产热稳定性较好的尿酸氧化酶菌株z z j 4 1 对其进行了鉴定 并进一步研究了该菌株的产酶发酵条件 酶的纯化 及该酶的 性质 主要实验结果如下 1 菌株的筛选及鉴定经过富集培养划线分离纯化后 得到5 株产尿酸氧化 酶菌株 通过酶热稳定性和k a n 值分析 菌株z z j 4 1 表现较高的热稳定性和最 低的k m 值 因此确定菌株z z j 4 1 为最佳产尿酸氧化酶菌株 通过对该菌株进 行形态学研究 生理生化特性测定 1 6 sr d n a 测序和系统发育分析 确定菌株 z z j 4 1 属于微杆菌属 m i c r o b a c t e r i u ms p 2 菌株产酶发酵研究对产酶发酵的各个条件 采用摇瓶培养试验 以测定 菌体生长量和酶活性为指标 确定了该菌株产酶发酵的最佳条件为 尿酸 3 9 玉米浆 1 0 9 k 2 h p o 3 h 2 0 2 9 k h 2 p o 0 5 9 m g s 0 47 h 2 0 0 5 9 n a c l i g 水 1 0 0 0 m l p h7 5 最适培养条件为 培养温度3 0 c 装液量为l o o m l 三角瓶装 3 0 m l 培养基 于1 2 0 r p m 转速下培养2 4 3 6 h 在上述培养条件下发酵 发酵液 的酶活可达o 9 8 u m l 3 酶的纯化和性质在最佳培养条件下发酵的酶液经硫酸铵分级沉淀 d e a e c e l l u l o s e 离子交换层析 t o y o p e a p lh w 6 5 c 疏水层析 s e p h a d e xg 7 5 分予筛层析后 提纯了约2 0 倍 比活达到5 3 2 u m g 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p a g e 显示为一条带 经s d s p a g e 电泳检测 确定该酶分子量为3 4 k d 研究尿酸氧化 酶的理化特性得知 该酶的最适反应p h 为8 5 其最适作用温度为3 0 c 在 p h 7 0 1 0 0 6 5 c 以下稳定 对尿酸的k r n 值为0 3 l m m o l l 转化系数k c a t 为 3 o l s a g h g s d s 能使该酶几乎完全失活 表面活性剂t w e e n2 0 t r i t o n x 1 0 0 对酶活性没有多大影响 浙江大学硕士学位论文 关键词 尿酸尿酸氧化酶热稳定性微杆菌属 u 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t u r i ca c i di saf i n a lp r o d u c to fp u r i n ec a t a b o l i s m w h i c hi se x c r e t e db yt h er e n a l m e t a b o l i s m i nc l i n i c a ld i a g n o s i s t h ec o n c e n t r a t i o no fu r i ca c i di ns e n n ni sa n i m p o r t a n tp a r a m e t e rf o re v a l u a t i o no f k i d n e yf u n c t i o n a tp r e s e n tt h em o s tc o m m o n l y u s e da s s a yf o ru r i ca c i di st h ee n z y m ec o l o r i m e t r ym e t h o d i nw h i c ht h eu r i c a s e u r a t e o x i d a s e e c1 7 3 3 w a su s e da so n em o s ti m p o r t a n te n z y m e t h e r e f o r e t h e p o p u l a r i z a t i o no ft h em e t h o dw a sl a r g e l yd e p e n d e do nt h ep r o p e r t i e so fu r i c a s e a l s o s o m er e s e a r c ho fu r i c a s eh a sb e e nr e p o r t e d h o w e v e r m o s to ft h er e p o r t e de n z y m e s d on o th a v eg o o dt h e r m a ls t a b i l i t y i nt h i ss t u d y as t r a i no fb a c t e r i ac a p a b l eo fp r o d u c i n gu r i c a s ew a si s o l a t e da n d i d e n t i f i e ds u b s e q u e n t l ya sas t a i no ft h eg e n u sm i c r o b a c t e r i u m a n dt h ec o n d i t i o nf o r t h ee n z y m ef e n m e n t a t i n n a n dp u r i f i c a t i o n c h a r a c t e r i s t i c so ft h ee n z y m ew e r ec a r r i e d o u ti nt h i sw o r d n l er e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w s 1 t h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ft h eu r i c a s ep r o d u c i n gs t r a i n f i v ec u l t u r e s o fb a c t e r i ac a p a b l eo fp r o d u c i n gu r i c a s ew e r ei s o l a t e df r o ms o i l w h i c hw e r es t r a i n z z j 2 一l z z j 3 4 z z j 4 l z z j 5 2a n dz z j 9 2 b a s e do nt h et h e r m a ls t a b i l i t ya n dk i n v a l u eo f u r i c a s ea n a l y s i s t h es t r a i nz z j 4 一l w h i c hs h o w e dt h eh i g h e s tt h e r m o s t a b i l i t y a n dt h el o w e s tk mv a l u e w a ss e l e c t e d o nt h e b a s i so fi t sm o r p h o l o g i c a la n d p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a sw e l la s1 6 sr d n as e q u e n c ea n dp h y l o g e n e t i ct r e e a n a l y s i s t h i sn e w i s o l a t eb e l o n g st ot h eg e n u sm i c r o b a c t e r i u m 2 t h ee n z y m ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s b a s e do nt h es t u d i e sf o rt h ec o n d i t i o n s o fu r i c a s ep r o d u c t i o n t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ee s t a b l i s h e d t h e c o m p o s i t i o no ft h em e d i u mw a s u r i ca c i d3 9 m a i z em i l k1 0 9 k 2 h p 0 43 h 2 02 9 k h 2 p 0 4o 5 9 m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9 n a c il g h 2 01 0 0 0 m la n dp h7 5 3 0 m lo ft h i s m e d i u mw a sa d d e dt oa1 0 0m lf l a s ka n di n c u b a t e do nas h a k e ro f1 2 0r p ma t3 0 0 c f o r3 0 3 6 h i 强eu r i c a s ea c t i 订l yp e a k e d 耵n 9 8 u m 1 3 t h ep u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fu r i e a s e t h es p e c i f i ca c t i v i t yo fa c r u d e c e l l f r e ee x t r a c to fu r i c a s ew a si n c r e a s e d2 0 f o l db yas e r i e so fp u r i f i c a t i o n s t e p si n c l u d i n ga m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n d e a e c e l l u l o s ei o n e x c h a n g e i i i 浙江大学硕士学位论文 t o y o p e a r l h w 6 5 c h y d r o p h o b i cc h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i f i e de n z y m e w a s h o m o g e n e o u sa sj u d g e db yp a g e t h em o l e c u l a rm a s sw a se s t i m a t e dt ob e3 4 k db y s d s p a g e s t u d yo nt h ec h a r a c t e r i s t i c ss h o w e dt h a t t h eo p t i m u mp hf o ru r i c a s e r e a c t i o nw a s8 5a n dt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s3 0 0 c u r i c a s ew a ss t a b l eb e t w e e n p h7 0 t o1 0 0a n dt h et e m p e r a t u r eb e l o w6 5 c t h ek r nv a l u ef o ru r i ca c i dw a s o 3 1 m m o l l t h ee n z y m ew a sm a r k e d l yi n a c t i v a t e db yi n c u b a t i o n v i 也1r n m o l lo f h f a 矿 a n do 5 o fs d s t w e e n2 0a n dt r i t o nx 1 0 0a l m o s th a d n oe f f e c to nt h e u f i c a s ea c t i v i t y k e y w o r d s u r i ca c i d u r i e a s e t h e r m o s t a b i l i 镑m i c r o b a c t e r i u ms p 致谢 本论文是在导师马晓航 4 研究女和贾小明副教授的悉心指导下完成的 论文 从选题 技术路线设计到最后整理成文 都倾注了他们大量的心血 马老师渊博 的学识 严谨的治学 一丝不苟的工作作风 开拓创新的学者风范及为人师表的 高尚人格给了我莫大的启迪和教诲 在此 谨向我的导师表示衷心的扇谢和最诚 挚的谢意 论文在完成过程中 还得到了浙江大学赳宇华教授 阉航教授等老师给予的 热情雒助和指点 在此对他们表示衷心的唐谢 此外 感谢我的师姐起更峰 孙桂芹 师妹郭康平 李霞 师弟赵伟峰 开 雷以反实验室的郭桂枝 孔素英两位阿姨和阮爱东博士 姚晓华博士 刘击博士 朱亚伟硕士 程炙凡硕士 杨丽硕士 刘静硕士等络我的热心帮助 是他们营造 了良好的研究氛围和学习环境 使我度过了非常愉快的三年硕士学习时光 值此论文完成之际 特别唐谢深爱我的父母和象人 唐谢他们多年采对我的 养育和教导 意谢 最后向在我成长过程中所有关心和支持过我的老师 同学和朋友表示真挚的 同时 向参加本论文评闭 评议和答辩委员会的全体专家 教授及为论文答 辩辛勤工作的人员致以崇高的敬意 周学来 2 0 0 5 年5 月于华家池 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 尿酸 2 4 6 一三羟基嘌呤 简称u a 陈文凯等 2 0 0 2 是次黄嘌呤和 黄嘌呤代谢的直接产物 在黄嘌呤氧化酶作用下 次黄瞟呤氧化为黄嘌呤 黄 嘌呤氧化为尿酸 在大自然界中 只有人类 鸟类及某些灵长类是以尿酸为嘌 呤代谢的最终产物 即尿酸是腺嘌呤与鸟嘌呤在人体内进行分解代谢的最终产 物 其它低等生物则可以将尿酸进一步分解为二氧化碳和水等化合物 生物体 内尿酸的来源包括内源性和外源性两个部分 前者通过体内氨基酸 磷酸核糖 及其他小分子化合物合成屎酸或核酸分解代谢产生尿酸 约占体内总尿酸的8 0 后者是从食物中核营酸分解而来 约占体内总尿酸的2 0 健康成年人正 常尿酸的水平为血清中0 1 5 o 4 r e t o o l l m o t o n a k aj e ta 1 9 9 4 尿 液中1 4 9 4 4 6 m m o l l k i s s i n g e rpt 日ta l 1 9 8 7 代谢去路主要由 肾脏排出 其余约2 5 由消化道排泄 血尿酸水平受尿酸生成 排泄过程的不同程度的影响 如代谢发生紊乱 可表现为高尿酸血症或低尿酸血症 c h e im e ta l 2 0 0 2 低尿酸血症较高尿 酸血症少见 如美国住院患者中发生率仅约0 9 7 日本为0 8 4 高尿酸血 症在西方国家较为多见 约占2 0 男性及更年期后妇女更多见 近年来 随 着生活水平的提高 我国的高尿酸血症也在增加 1 1 尿酸水平的影响因素 1 1 1 尿酸症的产生 在溶血 横纹肌溶解 真红细胞增多症 恶性肿瘤增生 肿瘤化疗放疗期 间 细胞核酸分解过多 嘌呤代谢增强 尿酸生成增加 出现所谓的高尿酸血 症 而重症肝病 应用别嘌呤醇等可导致黄嘌呤氧化酶抑制或缺失 使尿酸生 成减少 造成低尿酸血症 浙江大学硕士学位论文 1 1 2 肾功能的影响 肾脏清除的尿酸占总量2 3 以上 当 障小球滤过率 g f r 下降 肾小管分 泌减少及重吸收功能增强时 会导致不同程度的尿酸增高 g f r 下降时 单个 肾小球排出尿酸增多 但肾脏排泄总量下降 反之 当肾小管分泌增强或重吸 收减少时会导致血尿酸降低 称肾性低尿酸血症 1 2 尿酸与临床疾病 尿酸在机体内既有有益作用 作为一种还原性物质 参与氧化还原反应 有 抗氧化 抗d n a 损伤作用 也有有害作用 促进血管平滑肌增生 导致内皮功 能紊乱等 尿酸可能在痛风 高血压 血管病 糖尿病 肾脏病等多种疾病发 病过程中起到某种作用 1 2 1 尿酸与痛风 尿酸是一弱酸 其溶解度很低 超过溶解度的尿酸盐析出呈针状结晶 特 别容易沉积在温度较低的远侧端肢体 例如足趾 和酸度较高的组织 例如运动 后的肌肉 关节腔 主要侵犯部位是关节的滑囊膜和关节软骨 肾脏和皮下软 组织 关节腔中的尿酸盐结晶被吞噬细胞 白细胞吞噬后 可破坏细胞的溶酶 体等细胞器 释放出蛋白水解酶 激肽 组胺 趋化因子等物质 引起局部血 管扩张和渗透性增加 血浆渗出 白细胞集聚等炎症反应 而炎症细胞释放的 白介素 i l 一1 6 肿瘤坏死因子 t n f 等细胞因子 激活环氧化酶一2 c o x 一 2 合成前列腺素类 更使炎症范围进一步扩大 组织被溶解侵蚀 表现为急性 痛风性关节炎 多次复发可造成骨质穿凿状破坏 结缔组织增生 形成骨性肿 大 活动障碍 畸形和局部骨质疏松 大量尿酸盐结晶沉积成为结节状硬结 称为痛风石 在皮下可破溃流出白垩样物质 尿酸盐通过肾脏排出时 可沉积 在肾间质 引起间质性肾炎 尿酸性肾病 可沉积成尿路结石 引起肾阻塞 晚期可引起肾小管萎缩 间质纤维化 不坚持治疗的痛风患者约1 4 死于肾功 能不全 浙江大学硕士学位论文 1 2 2 尿酸与血管疾病 高尿酸血症与心血管疾病的关系 多年以来 直存在争议 f e s s e l 等 1 9 8 0 经1 0 年随访研究 发现高尿酸血症患者发生冠心病或高血压者 其危险性增加 1 0 倍 原发性高血压患者较正常血压者发生痛风的危险性增加3 倍 除尿酸排 泄障碍外 其它的高尿酸血症中 多数与血管性病理损伤相关 如系统性红斑 狼疮 高血压 冠心病等 血管内皮细胞在致病因素影响下 有氧代谢障碍 a t p 生成减少 a t p 耗竭促使腺嘌呤降解 尿酸合成增加 同时生成氧自由基 b o l l ir e ta l 2 0 0 3 高尿酸可损伤血管内皮 尿酸盐沉积于动脉壁可 引起动脉硬化 高尿酸合并糖尿病及高血压者更易导致血管内膜损伤及动脉硬 化 如此高尿酸血症与血管损伤就形成了恶性循环 王孝铭等 1 9 8 5 1 2 3 尿酸与糖尿病 糖尿病常伴发肥胖 高血压 冠心病 血脂异常及高尿酸血症 尿酸与糖 尿病患者的甘油三酯 极低密度脂蛋白 总胆固醇 体重指数 血压 空腹c 肽 空腹胰岛素水平 尿白蛋白排泄率等存在着正相关 与糖化血红蛋白 高 密度脂蛋白星负相关 合并高尿酸血症的糖尿病患者的糖尿病并发症 代谢综 合征 高血压 冠心病发生率较尿酸正常的糖尿病患者高 b o n o r ae e ta l 1 9 9 6 糖尿病早期由于肾小管对滤过液葡萄糖莺吸收增加而竞争抑制了尿酸 的重吸收 使血尿酸低于正常 糖尿病 肾病晚期g f r 下降 尿酸滤过率降低 血尿酸升高 并发酮症时 有机酸产生过多 与尿酸竞争分泌 从而提高尿酸 水平 有学者认为 在胰岛b 细胞分泌缺陷为主时 血胰岛素水平低 血糖高 表现为低尿酸 在胰岛素水平高时 表现为高尿酸血症 高尿酸血症是引起糖 尿病大 小血管病变的重要因素 同时高尿酸血症可损伤b 细胞 使糖尿病加 重 1 2 4 尿酸与肾脏 在高尿酸血症患者中 有临床症状的肾损害占4 1 但尸检几乎都有肾损 害 肾小管损害较突出 尿酸显著增高 尿酸在血液中主要以阴离子形式存在 浙江大学硕士学位论文 当血尿酸浓度超过饱和度时 易形成结晶沉淀在组织 引起各种病理改变 肾 损害主要分为3 种类型 痛风肾病 尿酸肾病 肾结石 尿酸与肾脏预后的关系也在受到学者关注 肾脏病常见高尿酸血症 高尿 酸血症也常与此类疾病的其它危险因子并存 如高血压 肥胖 高脂血症等 但它是肾病进展独立的相关因素或只是肾脏疾病的后果 尚未定论 尿酸水平 与肾血流量负相关 尿酸水平升高提示肾血流量减少 尿酸对预后的影响与高 尿酸和肾功能下降的平行出现有关 r u i l o p elm e ta l 2 0 0 1 血尿酸控 制不好可导致肾功能进一步恶化 对i g a 肾病研究发现 肾功能进展者较肾功 能平稳者 诊断对高尿酸血症更为普遍 s y r j a n e nj e ta 7 2 0 0 0 日本的 调查发现 尿酸在8m g 乩以上 较5m g d l 以下者 发展到肾功能受损的 相对危险度高 i s e k ik e ta 7 2 0 0 1 i g a 肾病中 血尿酸与c e r 负相关 与尿蛋白 肾小管问质损害呈正相关 在有高血压或是弥漫增殖性肾小球肾炎 者 尿酸较高 肾活检时尿酸正常者的c e r 下降显著低于伴高尿酸者 高尿酸 与c e r 下降独立相关 i g a 肾病的高尿酸来源于肾小球和小管问质双重损害 是i g a 肾病的预后危险因素 o h n oi e ta 7 2 0 0 1 研究发现 高尿酸血症动 物模型的血液中环氧化物酶一2 c o x 2 和肾索水平升高 且肾脏入球小动脉增 厚 平滑肌增生重于非高尿酸动物 c o x 2 受体阻滞剂可以阻断这一作用 提示 尿酸通过c o x 2 介导了肾脏病进展 e a n gdh e ta 2 0 0 2 i 2 5 尿酸与代谢综合征 尿酸与血压 血脂 血糖都有相关性 而上述指标同时出现异常 即为代谢 综合征 代谢综合征多见于中青年男性 缺少运动 营养过剩者 胰岛素抵抗可 能是核心的因素 胰岛索可促使屎酸等阴离子及钠盐的重吸收增加 从而增高血 尿酸水平 胰岛素抵抗减轻后 血尿酸水平下降 高尿酸水平是胰岛素抵抗综合 征的特征表现之一 t s u n o d as 日fa l 2 0 0 2 代谢综合征中的要素之一 脂代谢紊乱 与高尿酸血症有相关关系 高 尿酸血症者常伴高甘油三酯血症 脂肪降解产生的大量脂肪酸进入肝后 使甘 油三酯合成增加 此过程与嘌呤的合成的可能有一定联系 而导致甘油三酯增 加的同时 也提高了尿酸水平 代谢综合征的另一要素 肥胖 与尿酸水平 4 浙江大学硕士学位论文 也有相关 体重指数 b m i 是反映肥胖程度的主要指标 部分学者认为肥胖指数 o i 是更好的指标 国内学者早年就发现尿酸与甘油三酯或相对体重显著正相 关 方圻等 1 9 8 3 综上所述 尿酸水平与痛风 高血压 血管病 糖尿病 肾脏病及许多临 床综合征相关 而这些疾病或病理状态又有相互影响 它们之间可能互为因果 也可能有协同效应 血尿酸水平可能反映并整合了不同的危险因子和它们的可 能的相互作用 尿酸受诸多因素影响 在各种病理过程中表现水平高低的变化 无论作为疾病的预后因子 或是独立的危险因素 或仅仅是病程中的一个标志 都是非常有意义的 1 3 尿酸的检测方法 尿酸的检测在涉及临床诊断研究方面具有重要意义 目前尿酸常用的检测 方法有酶法 蒋秉士申等 1 9 9 8 尿酸传感器检测法 r i l i n a e t a l 1 9 9 5 荧光测定法 a v i e rg a l b a n p a j 2 0 0 1 高效液相色谱法 管敏娅等 2 0 0 3 和钨铝磷酸法等 1 3 1 酶法 将酶作为测定试剂用于待测物的分析起源于1 9 世纪中叶 2 0 世纪初已开 始应用于临床系列化的测定 但真正现代意义的用于临床生化测定的酶试剂是 2 0 世纪3 0 年代才出现 7 0 年代得到了较大发展 同时在理论和实践上也日趋 成熟和完善 如果从动力学角度对目前所使用的酶试剂加以分类 可分为单酶法和酶偶 联法 张雨清等 1 9 9 7 目前临床上常用检测尿酸的方法是单酶法 其基本 原理是通过单一的酶促反应后利用各种方法直接测定底物或产物的浓度来求得 待测物含量 酶学方法测定尿酸 其反应原理如下 尿酸 h 羽 o 一尿囊索 c o h 0 尿酸氧化酶催化 h z o 4 a a p 苯酚一醌亚胺 3 h 0 过氧化物酶催化 4 a a p 4 氨基安替比林 反应在硼酸盐缓冲液中进行 测定生成红色醌亚胺的量 便可换算出尿酸 5 浙江大学硕士学位论文 的浓度 此方法的优点是操作简便 时偶联了另一种酶 过氧化物酶 学特性的影响 1 3 2 尿酸传感器检测法 样品处理简单 缺点是测定反应底物浓度 因此其结果的准确度也受到过氧化物酶酶 酶电极分析方法作为一种简便 快速 灵敏和特效的分析技术 一直受到 化学家们的重视 尿酸传感器采用流动注射分析系统 由样品混合器 瞳流泵 覆盖酶膜的氧化极 流动池 热交换器 循环恒温水浴锅 溶氧控制器和积分 仪组成 当一定的试液注入样品混合器后 与流速为1 5 m l m i n 的0 0 2 m o l l 磷酸缓冲液 p h 8 5 混合 起经热交换器恒温 3 2 0 1 再进入反应室 在固定化尿酸氧化酶催化下进行氧化反应 使反应液中溶解氧浓度下降 这样 氧电极就产生差异电流响应峰 由积分仪记录下来 当溶液中的尿酸经载流液 洗脱后 电极很快回到起始状态 信号随即回到基线 就可以进行第二次注射 分析 这一方法的发展和酶固定化技术的迅速发展密切相关 酶固定化技术是制 作酶电极的关键 它对电极的各项性能起决定作用 目前已开发了吸附法 载 体偶联法 交联法和包埋法等各种固定的方法 近来还研究了一种以氧化铝固 定尿酸氧化酶的方法 还应用溴化锂和氯化钙溶解家蚕丝素后分别研制出二种 固定化氧化物酶和尿酸氧化酶丝素膜 用固定化尿酸氧化酶丝素膜和氧电极 研制了一种流动注射分析尿酸传感器 目前这种酶膜尿酸传感器法最具发展前 景 有望得到广泛应用 但设备比较复杂 价格昂贵 1 3 3 荧光测定法 该方法是基于尿酸氧化酶的测定方法 其原理是 尿酸与尿酸氧化酶反应 过程中会产生一个荧光基团 在3 2 0n m 处有一个发射光谱 测定反应过程3 2 0 n m 吸光值的变化即可算出底物尿酸的浓度 通过系列数据分析 得到关系式 j a v i e ro a l b a n e ts 7 2 0 0 1 l o g i i 2 7 3 2 u a 卜0 0 0 8 i i 分别为反应起始与终止时的吸光值 6 浙江大学硕士学位论文 该方法的优点是 1 该反应一步就能完成 2 结果不受尿酸氧化酶浓 度的影响 3 操作简单 缺点是 待测液必须先经过脱蛋白 消除读数干挠 尿酸氧化酶中不能含有f a d 或f m n 等辅助因子 f i g 1 u r i c a s ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yv a r i a t i o nd u r i n gt h ee n z y m a t i cr e a c t i o n a u a 0m b u a 1 0 1 0 5m c u a 1 8 1 0 4m d u a 4 2 1 0 4m e u a 2 5 9 l o 一4m ka l li n i t i a lf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yv a l u e 1 1 a d d i t i o no f t h ea n a l y t e p r o d u c e sa ni n s t a n t a n e o u sd e c r e a s ei nt h es i g n a l 1 2 c o n s t a n tv a l u e 1 3 4 高效液相色谱法 该方法是较常用 较基本的尿酸检测方法 所用流动相简单 分离效果较 好 操作简便 快速 p h l c 检测法虽然简单 但常常需要麻烦费时的样品预处 理或使用复杂的柱切换设备 为了解决这些问题 1 9 8 5 年以来不少研究工作者 研究了生物体液直接进高效液相色谱固定相 这些固定相包括内表面反相 半 渗透表面 混合功能相及屏蔽疏水相等 用这些固定相可以进行含蛋白体液的 直接进样分析 且柱效好 柱寿命长 现在人们常采用体液直接进样高效液相 色谱法测定尿酸 且应用日益广泛 1 3 5 磷钨酸还原法 磷钨酸还原法是目前临床b b 较常用的方法 利用无蛋白滤液中的尿酸在碱 性环境中可被磷钨酸氧化成尿囊素及二氧化碳 磷钨酸被还原成钨蓝 t u n g s t e n 浙江大学硕士学位论文 b l u e 根据钨蓝颜色深浅 用7 1 0 h m 波长滤光板或红色滤片 与同样处理的标 准比较 进行比色 以空白调零点 可求出其浓度值 反应原理如下 尿酸 h p w 0 一尿囊素 c o 钨蓝 该方法操作简单 但在应用过程中 由于磷钨酸中含有钼 可与血液中的 酚类物质起颜色反应 发生干挠 此外 除了上述几种方法外 近年来 一些科学工作者还研究了应用高效 毛细管区带电泳技术测定尿酸的新方法 该方法只要在受试者尿液经过样品处 理后 取滤液稀释5 0 倍 在毛细管区带电泳条件下测定 就可得到受试者的尿 酸分析结果 此法用于尿酸的测定 无需进行特殊的样品预处理 可直接进行 定量分析 该方法操作简单 分析速度快 样品用量少 但测定结果准确性较 差 适用临床快速粗略检验 1 4 微生物尿酸氧化酶的研究概况 尿酸氧化酶 u r a t eo x y g e no x i d o r e d u c t a s e e c1 7 3 3 简称u o 是生 物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶 它以氧作为受体的氧化酶 它能够催化 尿酸氧化生成尿囊素 二氧化碳和过氧化氢 在尿酸临床诊断中 此酶专一性 强 反应效率高 是重要的诊断分析用酶 许多物种中均发现有尿酸氧化酶存 在 但在高等哺乳动物 猿和人类 体内却缺乏有生物活性的尿酸氧化酶 因而 尿酸就作为嘌呤代谢的最终产物 s c h i t t e n h e l m 首先发现此酶存在于牛肾中 以后 从各种来源 例如细菌 霉菌 假丝酵母等 猪肝中也发现了尿酸酶 并进行了酶的提纯及性质的研究 最近 有人对尿酸酶产生菌进行了广泛的筛选比较 其中以芽孢杆菌和假丝酵 母产较高的尿酸酶活性 1 4 1 尿酸氧化酶的理化特性研究 b o n g a e r t sg p 等 1 9 7 8 发现b a c i l l u s f a s t i d i o s u s 菌株能以尿酸为唯一碳 源 并诱导产生尿酸氧化酶 经纯化分析 测定得其分子量大约为1 4 5 1 5 0 k d 酶作用最适p h 为9 5 最适反应温度为3 0 3 5 c 当温度从4 0 c 升至6 0 c 酶 活逐渐丧失 酶促过程中没发现在能促进反应的金属离子或辅酶 多种金属离 浙江大学硕士学位论文 子和氰化物都能对反应起抑制作用 l i uj 等 1 9 9 4 分离纯化了产朊假丝酵母 c a n d j d au t i i 曲所产生的尿 酸氧化酶 该酶在p h 值8 5 和9 5 之间 温度低于3 5 时较为稳定 酶反应 最适p h 为8 5 最适反应温度3 0 对尿酸反应的i i i l 值为5 2 6 x1 0 1 m o l l 经超速离心分析 酶的分子量为1 2 0 k d 通过s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳 d s p a g e 测得其亚基分子量为3 0 k d 表明该酶有四个亚基组成 1 5 本研究的目的及内容 目前国外对酶法尿酸检测开展了广泛的研究 酶法尿酸检测试剂盒已研制 成功并得到广泛应用于临床诊断 我国是一个人口大国 随着生活水平的提高 高尿酸引起的痛风患者越来越多 因而快速 准确的检测方法对患者的治疗非 常重要 而国内对尿酸酶法测定试剂盒的开发研究还刚起步 作为测定方法的 研究 首先要开发出尿酸检测用酶 尽管已有这方面的研究 但在实际生产中 仍然存在产量低 酶热稳定性不好的问题 国内对尿酸氧化酶的系统研究目前 尚未见报道 本研究试图从土壤这个微生物的大本营中筛选出产热稳定性好的尿酸氧 化酶的微生物 对分离到的尿酸氧化酶产生菌进行产酶发酵条件的研究 并进 行尿酸氧化酶的提纯以研究其理化性质 在此基础上进行该酶的分子生物学研 究 希望通过本研究能为尿酸氧化酶的结构与功能的研究奠定理论基础 为今 后构建高产 酶学特性好的基因工程菌进而开发尿酸酶法检测试剂盒提供材 料 本研究的技术路线主要为 产尿酸氧化酶菌种的筛选 产酶发酵条件研究 和 酶的提取及性质研究 酶基因的分子生物学研究 浙江大学硕士学位论文 第二章产尿酸氧化酶菌株的分离与鉴定 国内外对产尿酸氧化酶的a r t h r o b a c t e r 咖6 i f o r m i s n o b u t o s h i k 等 2 0 0 0 b a c i l l u ss u b t i l i s h u n a gs 等 2 0 0 3 c a n d i d au t i l i s l i ujg 等 1 9 9 4 和 p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a i s h i k a w a j 等 2 0 0 4 等菌株已作了较多的研究 但是 大多数菌株所产尿酸氧化酶存在着热稳定性差的问题 本章进行了产尿酸氧化 酶菌株的筛选 分离及系统鉴定 从土壤中分离 获得一株产尿酸氧化酶的优 良菌株 编号z z 3 4 1 并对该菌株进行形态观察 生理生化分析及1 6 sr d n a 序列同源性的鉴定 2 i 材料 2 i 1 菌株的分离源 浙江省杭州郊区及浙江大学校内土壤 2 1 2 主要仪器 恒温培养箱 电热恒温水浴锅 s c 1 5 型数控超级恒温槽 宁波海曙天恒 仪器厂 l g r l 6 一w 型高速台式离心机 北京医用离心机厂 i e cb 2 0 a 型离 心机 p h s 一3 c 型精密p h 计 上海精科雷磁 u v 7 5 4 型分光光度计 上海第 三分析仪器厂 o l y m p u sb h 一2 型万能显微镜 9 2 1 1 型超声波细胞粉碎机 宁 波新芝科器研究所 电泳仪及d y y i i i 型垂直电泳槽 p c r 仪 h y b a i d l i m i t e d z f 紫外投射分析仪 上海康华生化仪器厂 2 1 3 培养基 2 1 3 1 细菌富集培养基 尿酸 5 o g 酵母膏 0 5 9 2 0 9 k h 2 p 0 0 5 9 o 1 0 0 0 m l n a c i 0 1g m g s n 7 h 2 0 0 5 9 k 士i p 0 4 p h7 5 浙江大学硕士学位论文 2 1 3 2 细菌分离培养基 尿酸 3 o g 酵母膏 3 o g n a c l 0 1 9 m g s 0 4 7 h 2 0 o 5 9 k h p o 2 o g k h 2 p o 0 5 9 m 0 1 0 0 0 m l p h7 5 对于固体培养基则另加琼脂1 5 2 0g 2 2 试验方法 菌株的分离纯化技术路线如下 摇瓶富集一 平板划线分离一 液体发酵鉴定 2 2 1 富集 取2 0 克土接种于l o m l 以尿酸为唯一碳源的富集培养基中 3 0 c 于摇床 振荡培养 三天后 取l m l 培养液接种于已灭菌的相同培养基上 继续培养 如 此重复三次 以备菌种的筛选 2 2 2 菌株纯化 用接种环蘸取一环富集培养物 进行平板划线分离 待菌落形成后 挑取 单个菌落 反复划线分离 直到纯化为止 将纯化的菌株接种至斜面培养基保 存 2 2 3 菌株的产酶鉴定 将分离得到的菌株接种到分离培养基中 测定菌株的尿酸氧化酶活性 2 2 4 尿酸氧化酶的测定方法 将待测的菌体细胞用超声波进行破壁 离心 1 0 m i n 后取上清酶液0 l l 加入到含有0 6 m l 尿酸 4 m m p h 8 5 0 1 5 m l 4 一氨基铵替比林 3 r a m 0 1 m l 苯酚 1 5 和0 0 5 m l 过氧化物酶 1 0 0 0 u 的混合体系中于3 0 x 2 反应2 0 m i n 后 加入1 o m l 无水乙醇终止反应 m a s a r u s 1 9 8 1 在5 4 0 h m 处测定其0 d 值 酶活定义为 3 0 c 每分钟生成lp 朋o l h 0 的酶量为一个酶活单位 浙江大学硕士学位论文 2 2 5 菌株z z j 4 1 的鉴定 2 2 5 1 细菌形态观察 革兰氏染色 菌体形态观察参照 常见细菌系统鉴定手册 东秀珠等 2 0 0 1 鞭毛观察将分别培养2 4 h 和4 8 h 的细胞用1 o w v 的磷酸钨染色后置于电 镜下观察 用悬滴法观察其运动性 2 2 5 2 生理生化反应 生理生化试验包括 v p 测定 接触酶反应 硝酸盐还原试验 淀粉水解 试验 明胶水解试验 方法参照系统细菌学鉴定手册 碳源利用采用b i o l o g 鉴 定系统 b i o l o gi n c h a y w a r d u s a 耐盐性试验测定 将菌株分别接入n a c l 浓度为o 1 2 3 4 5 和6 的l b 培养基中 测定其生长活性 2 2 5 3d n ag g 含量 b 乙笛重制足强以p 步骤j 珏仃 细菌培养 同时以大肠杆菌k 菌株做参比菌株 上 土 细菌d n a 的提取和保存 酚 氯仿 异戊醪等试刑拙提 保存于s s c 播 i 夜1 0 d 2 6 0 0 d 2 3 0 0 d 2 8 0 1 0 4 2 0 5 5 1 l 上 以韫厦为横坐杯 o d 僵为纵坐标 绘制d n a 热燹性温度曲线 曲线中点对 应的温度为t m 土 浙江大学硕士学位论文 2 2 5 41 6 sr d n a 序列测定 从斜面上直接挑取菌体 悬浮于1 0 0ul 无菌重蒸水中 沸水处理3 5 m i n 1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n 上清直接作为下一步p c r 的模板 引物采用b s f s 2 0 5 一a g a g tt t g a tc c t g gc t c a g 3 e s c h e r i c h i ac o l l 的1 6 s r r n a 对应位置为8 2 7 和b s r l 5 4 1 2 0 5 一a a g g a g g t g a t c c a g c c g c a 3 如c h e r i c h i ac o l i 的1 6 sr r n a 对应位置为1 5 4 1 1 5 2 2 p c r 反应体系 5 0 此 为 d d h o3 8 5 汕 l o p c r 缓冲液 食m g 5 此 d n t p 5 m m o l l l 此 引物b s f 8 2 0 1 0 m m o l l 和b s r l 5 4 1 2 0 1 0 m m o l l 各 2 p l 模板l u l t q 酶0 5 p l p c r 反应程序如下 9 4 c 预变性5 m i n 9 4 变性 l m i n 5 2 退火i m i n 7 2 延伸i m i n 循环3 0 次 7 2 延伸l o m i n 4 保温 l o m i n p c r 产物的纯化和测序是由上海博亚生物技术有限责任公司完成 2 2 5 5 基于1 6 sr d n a 序列的系统发育分析 将所得到的1 4 3 3 b p 序列 g e n b a n k 登录号 a y 2 3 8 1 旦 结果通过b l a s t 程 序与g e n e b a n k 中的核酸数据库 h t t p w 唧 n c b i n l m n i h g o v 进行比对分 析 选取与z z j 4 1 菌株同源性较高的菌株用c l u s t a l x1 8 t h o m p s o njd 等 1 9 7 7 软件进行比对 结果通过m e g a 软件分析构建系统发育树 k i m u r a m 1 9 8 0 2 3 结果与分析 2 3 1 产尿酸氧化酶菌株的筛选 2 3 i 1 初筛 富集得到的菌株经产酶鉴定 筛选得到5 株产尿酸氧化酶的菌株 分别为 z z 7 2 1 z z j 3 4 z z j 4 一i z z j 5 2 和z z j 9 2 2 3 1 2 菌种的复筛 为得到最佳的产酶菌株 我们对筛选到钓5 株菌株所产生的尿酸氧化酶做 浙江大学硕士学位论文 进一步研究 分别对它们的热稳定性和k m 值进行测定 1 2 0 1 0 0 芝8 0 墓 6 0 4 0 端 2 0 0 2 54 55 05 56 05 57 0 7 5 t e m p e r a t u r e 2 一l 3 4 4 一l 5 2 9 2 图2 1 温度对不同菌株所产尿酸氧化酶的影响 粗酶液分别用不同温度处理3 0 分钟后测定其 剩余酶活 f i g 2 1 e f f e c to f t e m p e 哺u r eo n t h es t a b i l i t yo f d i f f e r e n t u r i c a s e c r u d ee n z y m es o l u t i o n w a s i n c u b a t e di nw a t e rb a t ha td i f f e r e n tt e m p e r a t u r ef o r3 0m i nr e s p e c t i v e l y t h er e m a i n i n ga c t i v i t i e s w e r ed e t e r m i n e da f t e rt h e i rc o o l i n gt o3 7 c 4 l 2 l 0 篮 8 6 4 2 一 r 4 224f s t 劬 图2 2 不同菌株所产尿酸氧化酶的k m 值 横轴和纵轴分别是底物浓度与酶活的倒数 f i g 2 2t h ek mv a l u e so f u r i c a s ep r o d u c e db yd i f f e r e n ts t r a i n t h ea b s c i s s aa n do r d i n a t ei n d i c a t e t h er e c i p r o c a lo f s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n sa n du r i c a s ea c t i v i t i e s r e s p e c t i v e l y 结果如图 f i g 2 1 f i g 2 2 所示 菌株z z 3 4 1 所产的尿酸氧化酶不 仅热稳定性最好 其k m 也为最低 所以